流式細胞分析儀檢測抗核抗體譜方法學性能驗證

徐敏,黎海生,戚南昌,太繼瓊,蔣金梅（昆明市第一人民醫院,云南 昆明 650011）

自身抗體是診斷自身免疫性疾病的重要依據，抗核抗體是細胞內所有核抗原成分的總稱，是自身免疫性疾病的重要輔助診斷指標[1]。每種自身免疫性疾病幾乎都伴有特征性的自身抗體譜。自身免疫病患者中，有相當一部分病人的血清或其體液中可以檢測到一種或多種高效價的自身抗體，能為自身免疫病的診斷、療效觀察等提供非常有價值的依據，自身免疫性疾病的檢測方法多種，而在眾多的檢測方法中，有的操作繁瑣，有的對人體有害，而且都不能同時檢測多種抗體。根據國內外研究情況介紹，美國ZEUS公司AtheNA檢測系統即通過多重微球流式點陣分析（multiplexed bead assay，MBA）技術原理，可同時自動化或半自動化定量檢測多種自身抗體，根據CNAS-CL02：2012《醫學實驗室質量和能力認可準則》的規定[2]，開展使用新方法前，實驗室必須對指標的相關性能進行方法學驗證評估。本實驗室對美國ZEUS公司AtheNA系統Luminex200流式熒光分析儀的主要性能進行驗證，確定設備能否達到所要求的性能指標及設備性能是否合格，以確保儀器檢測所得結果的準確性和可靠性，這樣更有助于臨床病情監測與臨床用藥指導，以及協助自身免疫性疾病的診斷。

1 材料與方法

1.1標本來源 采集昆明市第一人民醫院2019年住院病人已檢測抗核抗體譜項目的血清及門診體檢正常人血清，避免使用溶血、脂血和細菌污染的標本。

1.2儀器與試劑 美國ZEUS公司AtheNA系統Luminex200流式熒光分析儀，美國ZEUS公司抗核抗體譜檢測試劑盒（多重微珠流式免疫熒光發光法）［批號16110003，試劑成分：復合微珠懸浮液、藻紅蛋白標記的羊抗-人IgG，實驗緩沖液、洗滌緩沖液（10×）］；美國宙斯（Zeus）科技公司生產的AtheNA Multilyte ENA譜（抗核抗體譜）檢測試劑盒內標準品。

1.3檢測項目 SSA-52、SSA-60、SSB、Sm、RNP、Scl-70、Jo-1、Cent B、ds-DNA（雙鏈DNA）、Nucleosome（抗核小體抗體）、PM-Scl、PCNA、Ribosomal P（抗核糖體P蛋白抗體）、Histone（組蛋白抗體）、M2（抗線粒體抗體）。

1.4實驗方法

1.4.1精密度評價 根據CLSI EP5-A2[3]方案來驗證其精密度。①批內精密度：收集我院住院患者血清，濃度水平接近醫學決定水平樣本，樣本量為5ml，一天內重復檢測20次，計算均數（x）、標準差（SD）及批內變異系數（CV%），批內變異系數（CV%）需符合WS/T 494-2017[4]要求＜10%。②批間精密度：用室內質控品，每天檢測1次，選取20天的室內質控的在控結果的變異系數作為評價指標，批間變異系數（CV%）需符合WS/T 494-2017要求＜15%。

1.4.2正確度（符合性實驗） 因定量標準品難以獲取，本實驗室用已檢測抗核抗體譜項目的衛生部室間質評樣本作為驗證材料，樣本血清按試劑盒說明書進行常規步驟試驗，結果再與免疫印跡法做符合性比對試驗，陰性、陽性及弱陽性結果須完全相符。

1.4.3線性范圍驗證試驗 采用CLSI EP6-A2[5]《定量分析方法的線性評價》驗證方法，取一份低濃度ds-DNA樣本（L）和一份高濃度ds-DNA樣本（H）分別按照5L、4L+1H、3L+2H、2L+3H、1L+4H、5H的低高濃度配比，配成6個濃度梯度樣本，按試劑盒說明書進行常規步驟試驗。將6對實測值（Y軸）與預期值（X軸）進行直線回歸，計算y=ax+b，計算線性范圍和相關性，以R2≥0.95為判定標準。

1.4.4最低檢出限 取一份低濃度標本重復做10次試驗，按試劑盒說明書進行常規步驟試驗。求空白檢測低限（LoB）：將空白樣品重復10次作批內測定，計算空白（響應量）均值（空白）和標準差（s空白），95%可能性為：LoB=x空白+2·s空白。

取稀釋液作為標本重復做10次試驗，按試劑盒說明書進行常規步驟試驗。

求定量檢測低限（LoQ）：將定量檢測限樣品重復10次作批內測定，計算響應量均值（）和標準差（s定量），95%可能性為：LoQ=定量+2·s定量。

1.4.5參考區間 參考CLSI C28-A2[6]，選取我院門診體檢正常人20名，男、女各10名，年齡在18-60歲之間，樣本血清無黃疸及溶血，按試劑盒說明書進行常規檢測，判斷標準為R值≥90%，若滿足要求，則可判定廠家提供的參考區間適用于本實驗室，若不滿足要求，則需根據本實驗室建立參考區間。按以下公式計算R值：R＝檢測值在引用參考區間的個體數／總個體數×100%。如果≥90%的樣本檢測結果在（1-119AU/ml）范圍內，則驗證符合通過。

1.5統計學分析 采用Microsoft Excel 2013軟件進行數據分析處理。并計算相應的均值、CV和標準差。線性驗證中各濃度理論值與實測值關系采用Pearson相關分析。計數資料以例數或百分率表示。

2 結果

2.1精密度驗證結果 混合血清批內精密度均＜10%，質控血清批間精密度均＜15%，符合WS/T 494-2017要求的標準，見表1、表2。

表2 流式熒光免疫法檢測15個自身抗體項目的批間精密度驗證結果

2.2正確度驗證 因定量標準品難以獲取，本實驗室用已檢測ENA項目的衛生部室間質評樣本作為驗證材料，樣本血清按試劑盒說明書進行常規步驟試驗，結果再與免疫印跡法做符合性比對試驗，陰性（＜100）、陽性（＞120）及弱陽性（100-120），結果完全相符，見表3。

表3 流式熒光免疫法檢測自身抗體的正確度性能評價結果

2.3線性范圍驗證 因本實驗室使用的美國ZEUS公司AtheNA系統Luminex200流式熒光分析儀檢測ENA譜（抗核抗體譜）的結果只有ds-DNA項目是定量（IU/ml），其余項目為半定量（AU/ml），故此僅對ds-DNA的線性范圍性能做評價。ds-DNA在美國ZEUS公司AtheNA系統Luminex200流式熒光分析儀檢測結果在范圍內呈線性，R2=0.9871，R2＞0.95，符合要求，見表4。

表4 流式熒光免疫分析法ds-DNA線性范圍性能評價結果

2.4最低檢出限驗證 ENA譜15項檢測試劑盒（多重微球流式免疫熒光發光法）在美國ZEUS公司AtheNA系統Luminex200流式熒光分析儀上最低檢測限預期值為12，15項檢測均低于預期值，見表5。

表5 流式熒光免疫分析法檢測自身抗體檢出限(靈敏度)結果

2.5參考區間驗證結果 使用的美國ZEUS公司AtheNA系統Luminex200流式熒光分析儀檢測ENA譜參考區間驗證結果見表6，15項檢測結果≥90%的樣本檢測結果在試劑盒規定的參考區間（1-119AU/ml）范圍內，故參考區間驗證符合通過。

表6 流式熒光免疫分析法檢測自身抗體參考區間驗證結果

3 討論

近年來由于臨床經驗的積累和實驗室診斷技術的進步，發現自身免疫性疾病患者越來越多，涉及臨床多學科，相互交叉、相互滲透，臨床表現復雜多樣，同病異癥，異癥同病也是該類疾病容易誤診的主要原因之一。抗核抗體為一種廣泛存在于人體內的自身抗體，可與細胞核產生反應，主要分布在血清內，通過其水平檢測，可為自身免疫性疾病診斷提供一定指導[7]，自身抗體是用于輔助診斷自身免疫性疾?。ˋID）的重要實驗室指標，其檢測方法已不同程度實現了定量或半定量[8]。目前，比較公認的血清自身抗體檢測的“金標準”是ANA HEp-2 IFA檢測法，但是該方法只能作為初篩試驗，而且主要依靠主觀判斷抗體的滴度，對于陽性的標本還需要做一系列的確證試驗。因此，對于陽性標本，其檢測步驟繁瑣，檢測成本高，報告周期長。因此，迫切需要一種能集初篩和確診試驗于一體的簡便、快速的自身抗體檢測法[9]。美國ZEUS公司AtheNA系統Luminex200流式熒光分析儀診斷系統采用多重微球流式點陣分析（multiplexed bead assay，MBA）技術研制的AtheNA Multi-Lyte抗核抗體檢測系統是一種均勻的、多元的微珠分析系統[10]。有國內外文獻報道，AtheNA ANA系統和標準的ELISA系統在檢測確診的自身免疫患者、實驗室常規送檢的連續標本以及獻血者血清時，其符合率從97.7%-99.0%，單個標志物的符合率從92.09%-97.7%，具有高度一致性，其敏感性、特異性都很好[11]。在臨床檢驗中，精密度是試劑盒或檢驗程序重要的分析性能之一，是保證準確度的先決條件，臨床實驗室絕不希望同一樣本在不同時間測量的結果有明顯差異，致使臨床醫生無法相信臨床實驗室的檢驗結果，從而使檢驗結果不能成為診斷和治療的依據[12-13]。

正確度（符合性）是表示測量結果中系統誤差大小的程度。本實驗室用已檢測抗核抗體譜項目的衛生部室間質評樣本作為驗證材料，符合性實驗驗證相對CV在0.37%-7.48%；結果再與免疫印跡法做符合性比對試驗，陰性、陽性及弱陽性結果完全相符。說明該試驗正確度性能符合要求。

多重微球流式免疫熒光發光法檢測的ds-DNA濃度范圍為12-649IU/mL，線性相關性好，R2=0.9871，說明該儀器具有良好的線性范圍。最低檢出限是對單位濃度或單位量待測物質變化所致的響應量變化程度，是試驗方法產生一個能可靠地被檢出的分析信號所需的被測組分的最小濃度或含量。參考區間是解釋檢驗結果，分析檢驗信息的一個基本尺度和依據[14]，只有實驗室給臨床提供檢驗項目可靠的生物參考區間，才能使臨床對患者或健康體檢者的診斷治療有明確的指引。按照CLSI C28-A2文件推薦的方法，對抗核抗體譜15個項目參考區間進行方法學驗證，測定結果提示，SSA-52、SSB、Cent B有95.0%的測定數據在廠家引用的參考區間內，SSA-60、Sm、RNP、Scl-70、Jo-1、ds-DNA、Nucleosome、PM-Scl、PCNA、Ribosomal P、Histone、M2有100%的測定數據在廠家引用的參考區間內，均大于90.0%的要求，表明廠家提供的參考區間適合本實驗室，可以直接引用。

綜上所述，AtheNA系統Luminex200流式熒光分析儀診斷系統其精密度、正確度（符合性）、線性、檢測限、參考區間均達到所要求的性能指標，性能能夠滿足臨床需求，為自身免疫性疾病相關特異性抗體的檢測提供了一種靈敏而特異的工具。