circCRKL靶向miR-942-5p對骨肉瘤Saos-2細胞增殖、遷移和侵襲的影響

熊濤，李秀山

骨肉瘤是骨組織中最常見的原發性惡性腫瘤，好發于青少年，具有較高的局部侵襲和遠端轉移傾向。骨肉瘤治療以新輔助化療、手術聯合化療為主，但轉移或復發仍是患者死亡的主要原因。了解骨肉瘤侵襲和轉移的機制將為開發特異性骨肉瘤治療策略提供理論基礎。環狀RNA（circRNA）是由5'端和3'端連接形成的共價閉合環新型RNA，其主要功能是作為miRNA 海綿，通過抑制miRNA 來調節靶基因的表達[1]。多項研究表明，circRNA 表達失調與腫瘤細胞增殖、轉移、凋亡的化療敏感性或耐藥性之間存在聯系，靶向特定circRNA 可能是抑制腫瘤進展的潛在方法[2-3]。研究指出環狀RNA CRK 樣原癌基因（circRNA CRK like proto-oncogene, circCRKL）在前列腺癌中表達降低，過表達circCRKL 抑制癌細胞周期進展和侵襲，抑制腫瘤生長[4]。但circCRKL在骨肉瘤中的功能未見報道。miR-942-5p是一種致癌因子，下調miR-942-5p表達水平對肺癌、結直腸癌細胞惡性行為均有抑制作用[5-6]。靶基因預測到miR-942-5p 是circCRKL 的潛在靶點，但circCRKL 靶向miR-942-5p是否調控骨肉瘤進展仍需探討。因此，本研究重點分析了骨肉瘤組織中circCRKL 和miR-942-5p 的表達情況，并探討circCRKL 靶向miR-942-5p 對骨肉瘤Saos-2細胞生物行為的影響。

1 資料與方法

1.1 骨肉瘤組織和細胞

納入標準：①經組織病理學檢查確診為股骨遠端或脛骨近端骨肉瘤；②年齡10～65歲；③生存期＞3個月；④既往無化療史；⑤功能狀態評分≥60分。排除標準：①服用止吐藥物或影響胃腸動力藥物者；②肝腎功能不全者；③有腦部轉移者；④有嚴重免疫系統疾病者；⑤妊娠期或哺乳期婦女；⑥有精神疾病或認知障礙者；⑦伴其他惡性腫瘤者。

回顧性分析2018 年1 月至2022 年12 月于荊州市第一人民醫院接受新輔助化療的41例骨肉瘤患者的臨床資料。男25 例，女16 例；年齡5～25 歲，年齡13.0（10.0，17.5）歲。所有患者在接受此次治療前均未接受任何抗腫瘤治療，手術時取骨肉瘤組織和瘤旁組織。采集組織標本后，立即保存于液氮中。

本研究獲得荊州市第一人民醫院醫學倫理委員會審批通過（JZ202212013），患者豁免知情同意。

1.2 主要試劑

TRIzol 試劑、SYBR Green PCR Master mix、PrimeScript 逆轉錄試劑盒購自大連寶生物公司；熒光素酶報告質粒、pcDNA、pcDNA-circCRKL、si-NC、si-circCRKL、anti-miR-942-5p、anti-miR-NC、miR-942-5p模擬物、miR-NC 由蘇州鴻迅生物公司提供；CCK-8試劑盒購自南京恩晶生物公司；兔抗N 鈣黏蛋白（N-cadherin）抗體（AF0243）、兔抗E-cadherin 抗體（AF6759）、兔抗磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）抗體（AF1186）、羊抗兔IgG 二抗（A0208）購自上海碧云天生物公司。人成骨肉瘤細胞Saos-2 購自美國細胞培養物收藏中心。

1.3 研究方法

1.3.1 RT-qPCR評估circCRKL和miR-942-5p表達

TRIzol 法分離組織樣本的總RNA，按照PrimeScript 逆轉錄試劑盒說明合成cDNA，隨后用SYBR Green PCR Master mix 進行RT-qPCR 反應。按照2-ΔΔCt方法計算RT-qPCR 檢測結果。circCRKL上游5′-ACCTGCTCATGCATACGCTC-3′，下游5′-AGATCCCATTGGTGGGCTTG-3′；內參GAPDH上游5′-GTCAACGGATTTGGTCTGTATT-3′，下游5′-AGTCTTCTGGGTGGCAGTGAT-3′；miR-942-5p上游5′-CCGTCTTCTCTGTTTTGGCCATGTG-3′，下游5′-GAAGGATGACACGCAAATTCG-3′；內參U6 上游5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，5′-AACG CTTCACGAATTTGCGT-3′。

1.3.2 細胞培養和分組

選擇包含10%胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素的DMEM 培養基放入含5%二氧化碳、37℃培養箱中培養Saos-2細胞。將對數期Saos-2細胞以每孔5×103個細胞的密度接種24 孔板，在細胞60%匯合時，將Lipo2000 與載體或序列片段復合物加入到Saos-2 細胞中，根據轉染載體或序列不同分為pcDNA 組、pcDNA-circCRKL 組、si-NC 組、si-circCRKL 組、anti-miR-NC 組、pcDNA-circCRKL+miR-NC 組、anti-miR-942-5p 組、pcDNA-circCRKL+miR-942-5p組。收集轉染48 h細胞，RT-qPCR檢測轉染結果。

1.3.3 CCK-8法檢測細胞活力

將轉染細胞以每孔5×103個細胞的密度接種96孔板，常規培養48 h，更換為含10%CCK-8的培養液，繼續孵育2 h，酶標儀測量孔在450 nm 處的光密度（optical density, OD）值。

1.3.4 劃痕愈合實驗檢測細胞遷移

將轉染細胞以6×104/孔接種6 孔板，培養過夜直到細胞達到90%匯合，用100 μL移液管尖端在細胞表面劃線。用PBS清洗平板中損傷細胞，加入無血清培養基在培養0 h和48 h時拍照，使用Image J軟件檢測劃痕距離。劃痕愈合率（%）=［（0 h劃痕距離-24 h劃痕距離）/0 h劃痕距離］×100%

1.3.5 Transwell實驗檢測細胞侵襲

將200 μL無血清培養基重懸的細胞懸液（含1×105個轉染細胞）接種預涂有基質膠的上腔，將500 μL 含有10%胎牛血清的培養基加入下室。在37℃孵育24 h 后，用4%多聚甲醛固定膜下表面細胞，用0.5%結晶紫染色。顯微鏡下隨機選擇3 個視野拍照和計數，以細胞平均數表示侵襲數。

1.3.6 集落形成實驗檢測細胞克隆能力

將轉染細胞以800/孔接種6 孔板，37℃常規培養14 d 直到細胞集落。用4%多聚甲醛固定菌落，0.5%結晶紫染色。計數大于50個細胞的克隆數。

1.3.7 蛋白質印跡法檢測N-cadherin 和E-cadherin 蛋白水平

向轉染細胞中加入RIPA 緩沖液裂解細胞，收集上清液測定濃度和純度。通過十二烷基硫酸鈉凝膠電泳分離后，在半干轉膜儀中完成轉膜。將膜置于5%脫脂牛奶中封閉，然后與抗N-cadherin 抗體、抗E-cadherin 抗體、抗GAPDH 抗體在4℃孵育10 h；隨后與二抗在37℃孵育2 h。用化學發光法顯色，用Image Lab軟件測定其相對于GAPDH的灰度值。

1.3.8 雙熒光素酶報告基因實驗

基于Starbase 預測結合位點合成circCRKL 野生序列或突變序列，將上述序列克隆到psiCHECK-2 載體構建circCRKL 野生型（wild type, WT）報告質粒（WT-circCRKL）和circCRKL 突變型（mutant, MUT）報告質粒（MUT-circCRKL）。將構建的質粒與miR-942-5p 模擬物、miR-NC 分別共轉染Saos-2 細胞，培養48 h后檢測細胞相對熒光素酶活性。

1.4 統計學方法

用SPSS 18.0軟件進行統計學分析，實驗重復3次，每次重復3遍，計量資料以均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組比較采用單因素方差分析和t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 circCRKL 和miR-942-5p 在骨肉瘤組織中的表達

骨肉瘤組織中circCRKL相對表達水平顯著低于瘤旁組織（P＜0.05），miR-942-5p 相對表達水平顯著高于瘤旁組織（P＜0.05），見表1。

表1 circCRKL和miR-942-5p在骨肉瘤組織中的表達（n=41，±s）

表1 circCRKL和miR-942-5p在骨肉瘤組織中的表達（n=41，±s）

分組瘤旁組織骨肉瘤組織t值P值circCRKL相對表達水平1.00±0.08 0.36±0.04 45.817＜0.001 miR-942-5p相對表達水平1.00±0.11 4.56±0.39 56.254＜0.001

2.2 circCRKL 過表達對骨肉瘤Saos-2 細胞增殖的影響

pcDNA-circCRKL 組細胞circCRKL 相對表達水平顯著高于pcDNA 組（P＜0.05），與pcDNA 組比較，pcDNA-circCRKL 組Saos-2 細胞OD 值、克隆數顯著降低（P均＜0.05），見表2。

表2 circCRKL過表達對骨肉瘤Saos-2細胞增殖的影響（n=9，±s）

表2 circCRKL過表達對骨肉瘤Saos-2細胞增殖的影響（n=9，±s）

分組pcDNA組pcDNA-circCRKL組t值P值circCRKL相對表達水平1.00±0.00 2.84±0.27 20.444＜0.001 OD值0.76±0.06 0.37±0.03 17.441＜0.001細胞克隆形成數（個）84.01±7.05 38.28±3.36 17.567＜0.001

2.3 circCRKL 過表達對骨肉瘤Saos-2 細胞遷移侵襲的影響

與pcDNA組比較，pcDNA-circCRKL組Saos-2細胞劃痕愈合率、侵襲數、N-cadherin蛋白相對表達水平顯著降低（P均＜0.05），E-cadherin蛋白相對表達水平顯著升高（P＜0.05），見圖1和表3。

圖1 circCRKL過表達對骨肉瘤Saos-2細胞遷移侵襲相關蛋白表達的影響

表3 circCRKL過表達對骨肉瘤Saos-2細胞遷移侵襲的影響（n=9，±s）

表3 circCRKL過表達對骨肉瘤Saos-2細胞遷移侵襲的影響（n=9，±s）

分組pcDNA組pcDNAcircCRKL組t值P值劃痕愈合率（%）64.08±5.63 24.12±2.23 19.797＜0.001侵襲細胞數（個）109.86±10.53 52.93±5.19 14.548＜0.001 E-cadherin蛋白相對表達水平0.24±0.03 0.73±0.06 21.913＜0.001 N-cadherin蛋白相對表達水平0.61±0.05 0.21±0.02 22.283＜0.001

2.4 circCRKL靶向調控miR-942-5p的表達

StarBase 預測得到circCRKL 的序列中含有與miR-942-5p存在互補序列（圖2）。同與WT-circCRKL共轉染時，轉染miR-942-5p模擬物與轉染miR-NC 相比導致細胞相對熒光素酶活性降低（P＜0.05，表4）。pcDNA-circCRKL組與pcDNA組比較細胞miR-942-5p相對表達水平顯著降低（P＜0.05），si-circCRKL 組與si-NC組比較細胞miR-942-5p相對表達水平顯著升高（P＜0.05），見表5。

圖2 circCRKL序列中含有與miR-942-5p互補的核苷酸序列

表4 雙熒光素酶報告實驗（n=9，±s）

表4 雙熒光素酶報告實驗（n=9，±s）

分組miR-NC miR-942-5p t值P值WT-circCRKL相對表達水平1.01±0.05 0.52±0.05 20.789＜0.001 MUT-circCRK相對表達水平1.03±0.05 1.00±0.06 1.152 0.266

表5 circCRKL調控miR-942-5p的表達（n=9，±s）

表5 circCRKL調控miR-942-5p的表達（n=9，±s）

注：①與pcDNA組比較，P＜0.05；②與si-NC組比較，P＜0.05。

分組pcDNA組pcDNA-circCRKL組si-NC組si-circCRKL組F值P值miR-942-5p相對表達水平1.00±0.00 0.34±0.03①0.98±0.06 2.71±0.23②647.012＜0.001

2.5 干擾miR-942-5p 表達對骨肉瘤Saos-2 細胞增殖、遷移侵襲的影響

與anti-miR-NC組比較，anti-miR-942-5p組Saos-2細胞OD 值、克隆數、miR-942-5p 相對表達水平、劃痕愈合率、侵襲數、N-cadherin 蛋白相對表達水平顯著降低（P均＜0.05），E-cadherin 蛋白相對表達水平顯著升高（P＜0.05），見圖3和表6。

圖3 干擾miR-942-5p表達對骨肉瘤Saos-2細胞遷移侵襲相關蛋白表達的影響

表6 干擾miR-942-5p表達對骨肉瘤Saos-2細胞增殖、遷移侵襲的影響（n=9，±s）

表6 干擾miR-942-5p表達對骨肉瘤Saos-2細胞增殖、遷移侵襲的影響（n=9，±s）

分組anti-miR-NC組anti-miR-942-5p組t值P值miR-942-5p相對表達水平1.00±0.00 0.24±0.03 76.000＜0.001 OD值0.78±0.06 0.42±0.04 14.977＜0.001細胞克隆形成數（個）87.21±6.37 42.94±4.12 17.507＜0.001劃痕愈合率（%）67.03±4.92 28.65±3.37 19.307＜0.001侵襲細胞數（個）107.37±12.19 58.71±4.23 11.314＜0.001 E-cadherin蛋白相對表達水平0.23±0.02 0.68±0.04 30.187＜0.001 N-cadherin蛋白相對表達水平0.63±0.05 0.28±0.02 19.498＜0.001

2.6 上調miR-942-5p 表達逆轉了circCRKL 過表達對骨肉瘤Saos-2細胞增殖、遷移侵襲的作用

與pcDNA-circCRKL+miR-NC 組比較，pcDNAcircCRKL+miR-942-5p組Saos-2細胞OD值、克隆數、miR-942-5p 相對表達水平、劃痕愈合率、侵襲數、N-cadherin蛋白相對表達水平顯著升高（P均＜0.05），E-cadherin 蛋白相對表達水平顯著降低（P＜0.05），見圖4和表7。

圖4 上調miR-942-5p表達逆轉了circCRKL過表達對骨肉瘤Saos-2細胞遷移侵襲相關蛋白表達的作用

表7 上調miR-942-5p表達逆轉了circCRKL過表達對骨肉瘤Saos-2細胞增殖、遷移侵襲的作用（n=9，±s）

表7 上調miR-942-5p表達逆轉了circCRKL過表達對骨肉瘤Saos-2細胞增殖、遷移侵襲的作用（n=9，±s）

分組pcDNA-circCRKL+miR-NC組pcDNA-circCRKL+miR-942-5p組t值P值miR-942-5p相對表達水平1.00±0.00 2.96±0.24 24.500＜0.001 OD值0.35±0.03 0.67±0.05 16.464＜0.001細胞克隆形成數（個）36.91±3.13 73.12±6.42 15.209＜0.001劃痕愈合率（%）23.15±2.26 54.68±4.81 17.799＜0.001侵襲細胞數（個）50.85±4.05 89.97±7.05 14.435＜0.001 E-cadherin蛋白相對表達水平0.75±0.05 0.35±0.03 20.580＜0.001 N-cadherin蛋白相對表達水平0.20±0.02 0.53±0.04 22.137＜0.001

3 討論

circRNA 可能在骨肉瘤中起到抑癌或致癌作用，并已用于調節癌細胞惡性行為和化療耐藥。研究發現，骨肉瘤中circ_0021347 低表達與較高的TNM 分期、較短的總生存期有關[7]。circ_0000190 過表達可抑制骨肉瘤細胞侵襲行為[8]。環狀RNA la 相關RNA結合蛋白4（circular RNA La-related RNA-binding protein 4，circ-LARP4）高表達與骨肉瘤患者無病生存期延長相關，并可增強其對阿霉素和順鉑的敏感性[9]。然而，circ_001621、circ_0000285、circ_0001658等circRNA 在骨肉瘤中上調并促進其惡性增殖和遷移行為[10-12]。本研究結果顯示，骨肉瘤組織中circCRKL 相對表達水平降低，提示circCRKL 下調可能促進骨肉瘤進展。為揭示circCRKL 生物學功能，本研究轉染si-circCRKL 至Saos-2 細胞，結果表明，circCRKL 過表達導致細胞活力和克隆能力下降，這與circCRKL 在白血病中的抗增殖作用相同[13]，表明circCRKL 是骨肉瘤的抑癌因子。上皮間質轉化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）可促進腫瘤侵襲性表型，并通過淋巴和血液循環導致局部侵襲和遠處轉移[14]。研究報道在骨肉瘤中circ_03955、circ_0001721 均通過調節EMT 來加速腫瘤進展[15-16]。上皮表型喪失和間質特性獲得是EMT 的基本特征，本研究發現circCRKL過表達導致Saos-2細胞遷移和侵襲能力降低，并伴隨上皮表型分子E-cadherin 上調和間質表型分子N-cadherin 下調，這提示circCRKL通過阻礙EMT進而抑制骨肉瘤侵襲轉移。

目前已在前列腺癌、白血病中報道circCRKL 的致癌作用，其作用機制均與調控miRNA 表達有關[4,13]，但circCRKL是否通過吸附miRNA發揮骨肉瘤調控作用尚不清楚。miR-942-5p 在黑色素瘤中表達上調，miR-942-5p 高表達預示黑色素瘤患者預后不良，下調miR-942-5p可有效抑制黑色素瘤細胞惡性行為[17]。miR-942-5p高表達還參與肝癌的EMT、糖酵解和侵襲過程[18]。在宮頸癌和口腔鱗癌中miR-942-5p可作為circ-EPSTI1、circ-AKT1的靶miRNA來抑制腫瘤進展[19-20]。本研究證實，骨肉瘤組織中miR-942-5p相對表達水平升高，干擾miR-942-5p表達可導致細胞活力和克隆能力下降，E-cadherin 蛋白相對表達水平升高，N-cadherin蛋白相對表達水平降低，細胞遷移和侵襲能力下降。同時，本研究證實miR-942-5p 是circCRKL 的直接靶點，且circCRKL 靶向負性調控miR-942-5p 表達，且干擾miR-942-5p 表達和circCRKL過表達的抗骨肉瘤活性一致，提示骨肉瘤中可能存在circCRKL/miR-942-5p調控途徑。本研究在Saos-2細胞中共轉染anti-miR-942-5p和si-circCRKL，結果表明，上調miR-942-5p表達顯著減弱了circCRKL過表達對骨肉瘤Saos-2 細胞增殖、E-cadherin 和N-cadherin 表達以及遷移、侵襲的作用，進一步證實circCRKL 通過靶向下調miR-942-5p 抑制骨肉瘤Saos-2細胞惡性行為。

4 結論

骨肉瘤中circCRKL 表達降低，miR-942-5p 表達升高。circCRKL通過靶向下調miR-942-5p表達來抑制骨肉瘤Saos-2 的增殖、遷移和侵襲，這可能為改善骨肉瘤治療提供新的分子靶點。

【利益沖突】所有作者均聲明不存在利益沖突