核酸適配體的應用現狀及其在骨科領域的應用研究進展

楊錢冬，周江玲，楊明，侯天勇

核酸適配體是經指數富集的配體系統進化（systematic evolution of ligands by exponential enrichment, SELEX）技術篩選得到的短的單鏈寡核苷酸（DNA 或RNA）分子，是由20～110 個核苷酸構成的具有多樣性的隨機序列和特殊固定序列，其通過折疊可以形成具有三級結構的、高親和力的、能特異性結合靶分子的小分子基團[1-2]。目前，核酸適配體已被廣泛應用于食品安全保障和環境監測等領域[3-6]。與抗體相比，核酸適配體具有生產時間更短、制造成本更低、可修飾性更高、熱穩定性更好等優點[7]，并且因其對目標細胞的高度特異性，在骨科領域具有廣闊的應用前景。本文對核酸適配體的基本概念及其在骨科領域的應用研究進展進行綜述。

1 核酸適配體應用現狀

1.1 核酸適配體的篩選及合成

SELEX 技術是一種生成核酸適配體的標準技術，其基本思想是在體外通過化學方法，合成一個單鏈寡核苷酸池，即SELEX文庫，然后將感興趣的靶向分子放入含有1014～1016個單鏈隨機寡核苷酸池（SELEX 文庫中的隨機寡核苷酸通常由40～100 個核苷酸基團組成）進行孵育。隨后，首先用磷酸緩沖生理鹽水（phosphate buffer saline, PBS）或去離子水直接沖刷，將未與靶向分子結合的寡核苷酸分離，再用高鹽溶液（可改變與靶分子結合的核酸適配體的構象使其分離）洗脫得到能結合目標物的寡核苷酸，并將結合目標物的寡核苷酸通過聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction, PCR）擴增，進行下一輪的篩選。采用上述方法重復進行幾輪篩選，將能與靶向分子特異性結合的核苷酸片段從之前生成的非常大的隨機核苷酸文庫中分離出來，且特異性隨著SELEX 過程的重復而增高[7]。除用于DNA 核酸適配體的篩選外，SELEX 技術同樣可用于RNA 核酸適配體的篩選，但篩選RNA 核酸適配體與DNA 核酸適配體的SELEX 技術有一定差異，在目標為篩選RNA 核酸適配體的情況下，首先必須將RNA 逆轉錄成雙鏈DNA，再進行SELEX 技術的操作[3-5]。DNA 核酸適配體與RNA 核酸適配體具有各自的優勢：相較于RNA核酸適配體，DNA 核酸適配體本身更穩定，相關的制造成本也更低[8-9]；而RNA 核酸適配體通常具有更多樣化的三維構象和更強的鏈內基團相互作用，可能會增加核酸適配體的親和力和特異性。有研究報道，部分RNA 核酸適配體-靶標復合物的解離常數（Kd 值）可達到皮摩爾級，顯示出了核酸適配體與靶分子的親和力優于抗體與抗原之間的作用力[10]。

對于核酸適配體的篩選，由于SELEX 技術本身需要構建數量巨大的單鏈隨機寡核苷酸池，如果重復次數不夠將造成核酸適配體親和力和特異性低等問題。因此，提高SELEX 技術的成功率和特異性對推廣其應用來說至關重要。近年來，隨著分子生物學技術的發展，出現了一系列對傳統SELEX技術的改進，包括改變結合的條件和進行篩選的平臺、靶類型、文庫設計和固定基質，其衍生出的一系列技術包括免疫沉淀耦合的SELEX（immunoprecipitation-SELEX,IP-SELEX）、細胞捕獲的SELEX（cell-SELEX）、毛細管電泳的SELEX（capillary electrophoresis-SELEX,CE-SELEX）、原子力顯微鏡的SELEX（atomic force microscope-SELEX, AFM-SELEX）和人工擴大遺傳信息系統的SELEX（aegis-SELEX）等來提高SELEX技術的成功率[11-13]。但是，上述技術對操作人員的技術要求較高，學習曲線較長，在一定程度上限制了新型核酸適配體的開發及其在各領域的應用。

在通過SELEX 技術篩選得到目標核苷酸序列后，即可通過生物合成方法或化學合成方法合成目標核苷酸序列。化學合成方法是在體外通過一系列化學反應將核酸適配體的單元（核苷酸）連接起來，通常采用固相合成技術；生物合成方法是通過生物體內的酶催化反應將核酸適配體的單元連接起來，通常采用核酸酶反應[4-7]。

1.2 核酸適配體的特點

與抗體相對較大的體積（150～180 kDa，15 nm）相比，核酸適配體具有體積較小（6～30 kDa，2 nm）和更加靈活的特點，可以結合相對較小的靶向分子或細胞[14]。同時，由于抗體體積較大，在其需要穿透組織發揮作用時，可能表現出更多的局限性，特別是在腫瘤的靶向治療中，可能會由于其較大的體積影響治療效果[15]。但核酸適配體由于體積較小，存在更加容易被腎臟過濾及在體內循環時間較短等缺點。有研究表明，可以通過合理的化學修飾改變其藥代動力學特征，延長其在體內的半衰期，避免其在體內代謝較快這一缺陷[16]。相較于抗體較長的合成周期及較高的合成費用，核酸適配體在幾天內就可以完成合成，且費用較低，并且核酸適配體的篩選及制備過程完全是在體外進行的，僅依賴于化學合成過程，污染風險較低[4-7]。除此之外，核酸適配體最大的優勢在于其不具備免疫原性，所以不會像抗體一樣造成免疫排斥反應[17]（表1）。

表1 核酸適配體與抗體特性比較

1.3 核酸適配體的應用

1.3.1 再生醫學

再生醫學的主要原理之一在于干細胞技術的合理應用[18]。干細胞理論上可以無限分裂和增殖，廣泛存在于各種組織中，具有在特定環境刺激下衍生和分化成各種類型細胞的潛力。基于這一原理，再生醫學在組織與器官修復和再生方面取得了一定成果，但如何高效地獲得存活率較高的目標干細胞[19]及整個技術流程較高的生產成本等問題對其推廣應用造成一定的限制。核酸適配體作為一種新的細胞分選工具和一種新的細胞趨化劑和誘捕劑，與傳統的以活性蛋白分子（抗體等）為代表的再生因子相比，具有更高效的細胞分選效率和更好的體內適應性[20-21]，可以在組織損傷部位特異性捕獲和募集內源性干細胞，從而促進組織的再生和修復。盡管目前已有大量研究報道證實了核酸適配體在再生醫學的組織和器官修復應用的優勢[15]，但還沒有關于人體試驗的報道。在應用于人體之前，研究者們還需要在成本控制、提高篩選效率等方面深入探討，以更好地推進動物實驗和人體試驗[22]。

1.3.2 靶向藥物治療

研究報道，以核酸適配體-藥物偶聯物（aptamerdrug conjugates, ApDCs）形式的靶向藥物可以發揮治療作用，典型的ApDCs 由三部分組成：核酸適配體、藥物和中間的連接體，目前有一部分ApDCs 已經被美國食品藥品監督管理局（Food and Drug Administration, FDA）批準應用于臨床[23-24]。與傳統的抗體- 藥物偶聯物（antibody-drug conjugates,ADCs）[25]相比，ApDCs 具有多種潛在優勢：一方面，核酸適配體可以通過分子層面上的化學修飾，與發揮治療作用的藥物進行更加牢固的生物偶聯；另一方面，ApDCs 分子量相對較小，因此具備更快、更深的組織滲透能力。此外，通過將納米技術引入ApDCs 可以提高載藥能力和被動給藥效率，進一步推動ApDCs的發展。

盡管已有獲批的藥物用于臨床治療[26-30]，但在核酸適配體靶向藥物治療方面，從基礎向臨床的轉化仍然是目前面臨的巨大問題。此外，如何進一步優化核酸適配體-藥物的生物偶聯及其適用性和毒理學方面的問題仍需進一步研究[31]。

1.3.3 疾病診斷

近年來，由于核酸適配體的各種優勢，大量含有特定功能的核酸適配體被用于設計新的生物傳感器，用于各種病原微生物或疾病的早期診斷[32]。迄今為止開發的基于核酸適配體的診斷型生物傳感器根據其檢測的目標致病性分析物可分為兩類，其中包括針對致病性毒素或蛋白質的一類大分子物質，以及針對致病性細胞和核酸等的一系列小分子物質；可早期診斷的疾病包括獲得性免疫缺陷綜合征[33]、新型冠狀病毒肺炎及一系列特異性微生物感染疾病等[34]。然而，由于SELEX 技術過于繁瑣的流程及較高的失敗率限制了其應用，目前需解決的主要問題是擴大覆蓋更多病原體的核酸適配體庫[33,35]，再與生物傳感技術聯用，用于提高疾病的早期診斷率，有可能進一步減輕疾病對患者造成的經濟負擔。

但相對于傳統檢測手段，基于核酸適配體的新型檢測生物傳感器的研究仍處于早期階段，其敏感性和安全性仍需進一步的驗證，并且其昂貴的造價及較短的保存周期是目前亟需解決的問題[32]。

2 核酸適配體在骨科領域的應用前景

2.1 骨與軟骨組織再生

核酸適配體對目標干細胞有特異性捕獲能力，其在骨科修復領域有著較大的應用前景。Wang等[36]通過SELEX 技術，以人胚胎干細胞（embryonic stem cell, ESC）為靶向分子，篩選出了一種對ESC 具有特異性捕獲能力的核酸適配體HM69，并將HM69 與納米材料通過化學連接的方法進行結合，研究結果表明，功能化的納米顆粒材料在體內外表現出募集間充質干細胞（mesenchymal stem cell, MSC）的能力，并在大鼠模型中獲得了更好的骨缺損修復結果。Yang等[20]將核酸適配體HM69 與脫細胞軟骨細胞外基質連接，并與富含轉化生長因子β3（transforming growth factor β3, TGF-β3）的甲基丙烯酸明膠混合制成生物墨水，添加于3D 打印技術制成的聚己內酯（polycaprolactone, PCL），構建了一種新型的軟骨修復材料，進一步證實了核酸適配體HM69對脂肪干細胞（adipose-derived stem cell, ADSC）的特異性捕獲和募集作用，能夠在缺損原位促進軟骨的修復。隨后Li等[37]將另一種對人MSC 有特異性捕獲作用的核酸適配體Apt19s 與脫細胞半月板細胞外基質結合，同時與甲基丙烯酸酯明膠混合，并添加納米粒子，構建了一種可促進半月板再生的新型材料，同樣在兔的半月板缺損模型上得到了驗證。Sun 等[38]和Yao 等[39]同樣利用核酸適配體Apt19s 證明了與核酸適配體結合的原位支架材料對骨缺損修復的促進作用，其連接的材料分別為連接了人胎盤生長因子2 氨基酸123～144 肽段的PCL 和脫鈣骨基質（decalcified bone matrix, DBM）。此外，在骨缺損的治療過程中，能夠向細胞傳遞氧氣和營養物質的功能性血管再生是影響體內植入后存活率的最關鍵因素[40]，因此，內皮祖細胞（endothelial progenitor cells, EPC）與MSC 聯用已是目前骨修復領域的全新熱點[41]。Qi 等[42]的研究證實了一種對EPC 有特異性捕獲能力的核酸適配體，可與聚合烯丙胺涂層結合，用于促進血管的再生和目標部位的血運重建。

綜上所述，只要在適當的條件下，對干細胞有較高特異性識別能力的核酸適配體與各種所需的支架材料相結合[43]（文獻報道均為化學鍵相連接），并加以相應的修飾，在骨科修復重建領域具有較大的應用潛力，可實現具有選擇性的、定向捕獲新材料的構建。值得注意的是，上述研究均未對核酸適配體進行作用機制上的探討及研究。目前，由于臨床上醫學倫理問題的限制及核酸適配體成骨、成血管機制尚不明確，因此尚未應用于臨床。

2.2 骨腫瘤疾病的診治

骨組織是腫瘤的常見好發部位，按發病機制可分為原發性骨腫瘤和繼發性轉移骨腫瘤[44]，目前核酸適配體對骨腫瘤的治療應用較少，但一些研究報道了其在骨腫瘤疾病診治領域的良好效果。Hao等[45]研究報道了一種靶向針對前列腺癌細胞的核酸適配體APT A10-3.2，其在轉移骨腫瘤小鼠模型中表現出了良好的腫瘤細胞殺傷效果，可達到抑制繼發性轉移骨腫瘤的目的。而在原發性骨腫瘤方面，Wang 等[46]報道的一種新型核酸適配體LP-16 可以特異性結合骨肉瘤細胞，對骨肉瘤的早期診斷有較大的意義。

目前核酸適配體在骨腫瘤領域應用較少，未來的研究可以將特異性治療骨腫瘤的藥物與核酸適配體結合，達到精準靶向治療的目的。

3 總結

核酸適配體具有合成成本相對較低、熱穩定性更高及不具備免疫原性等優點。在再生醫學領域方面，核酸適配體表現出對干細胞的特異性捕獲和識別能力，在組織再生方面具有良好的應用前景。作為靶向藥物時，核酸適配體可提高藥物對有害細胞或組織的特異性。作為早期診斷手段，核酸適配體可以與生物傳感器相結合，提高檢測效力。目前，核酸適配體在骨科領域的應用較少，主要應用于骨與軟骨再生和骨腫瘤疾病的診治。SELEX 技術繁瑣的流程及較高的失敗率嚴重限制了核酸適配體的臨床應用，未來對核酸適配體的研究重點在于如何進一步簡化新型核酸適配體的篩選流程，以及如何提高其對特異性細胞識別的親和力和靶向性。在骨科領域，如何發揮核酸適配體特異性識別、募集目標細胞的能力，如何通過特異性識別目標細胞表面的分子信號實現對細胞的特異性刺激，如何促進細胞增殖和分化，并探索其作用的具體機制，以進一步推動核酸適配體從基礎實驗到臨床應用的轉化。

【利益沖突】所有作者均聲明不存在利益沖突