酸性微環境對巨噬細胞中周期生物鐘1的表達及M2型極化的影響*

劉新宇, 趙茂, 楊穎穎, 邱煒

(貴州醫科大學 生物與工程學院 & 健康醫藥現代產業學院, 貴州 貴陽 550025)

包括黑色素瘤在內的多種腫瘤中,無論是否有氧氣參與,腫瘤細胞都會傾向將丙酮酸轉換為乳酸,這種狀態被稱為“Warburg效應”[1]。隨著乳酸代謝物不斷積累,最終形成pH介于5.8～7.4的腫瘤酸性微環境[2]。腫瘤酸性微環境能誘導腫瘤相關巨噬細胞(tumor-associated macrophages,TAMs)向替代途徑激活的巨噬細胞(alternatively activated or healing macrophage,M2型)極化[3-5]。M2型TAMs通過分泌血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、精氨酸酶-1(arginase1,ARG-1)等細胞因子促進腫瘤血管生成、腫瘤細胞侵襲與轉移[6-9]。同時,M2型TAMs積累也被認為是患者預后不良的原因之一[8,10]。因此,腫瘤微環境中酸性特性如何誘導TAMs向M2型極化已成為TAMs腫瘤治療的重點研究方向之一[11]。陽離子脂質體具有生物相容性好、合成簡單及可塑性良好等特點,是當前靶向特定組織和細胞進行基因治療的優良載體[12]。周期生物鐘1(period 1,PER1)是晝夜節律的核心基因之一,在控制哺乳動物晝夜節律、細胞周期及DNA損傷反應中起關鍵作用[13];PER1的異常表達與結腸癌、前列腺癌、乳腺癌等惡性腫瘤的發生和發展密切相關[14-16]。然而,目前PER1對巨噬細胞極化的相關研究較少。因此,本研究通過構建陽離子脂質體輔助遞送PER1-小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA),進而研究PER1對巨噬細胞極化的影響,為基于巨噬細胞極化的腫瘤免疫治療提供新的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1動物及細胞來源 6～8周齡C57/6J雌性小鼠20只,體質量18～20 g,購自學校動物實驗中心[SYXK(貴)2023-0001],B16-F10黑色素瘤細胞和RAW264.7巨噬細胞購自武漢普諾賽生物科技有限公司。

1.1.2主要試劑和儀器 RPMI-1640培養基、DMEM培養基、胎牛血清(美國Gibco公司),溴化三甲基-2, 3-二油酰氧基丙基銨(1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane, DOTAP)、二油酰基磷酰基乙醇胺(1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, DOPE)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(2000)-琥珀酰胺(DSPE-PEG2000-NHS,西安瑞禧生物技術有限公司),膽固醇(上海默克化工有限公司),TB Green Premix Ex Taq、TaKaRa PrimeScript RT reagent Kit逆轉錄試劑盒及Trizol試劑(寶日醫生物技術有限公司),藻紅蛋白-成熟小鼠巨噬細胞標志物(phycoerythrin-anti-mouse EGF-like module-containing mucin-like hormone receptor-like 1,PE-F4/80)、別藻藍蛋白-甘露糖受體(allophycocyanin- anti-mannose receptor,APC-CD206;賽默飛世爾科技有限公司),PER1-siRNA以及實時熒光定量PCR(real-time quantitative PCR detecting,RT-PCR)引物都由上海生工生物技術有限公司合成,其他試劑耗材購自無錫耐斯特生物技術股份有限公司;QuantStudio 3型實時熒光定量PCR系統(賽默飛世爾科技), 激光共聚焦顯微鏡(日本Olympus公司),F-4600熒光分光光度計(日本Hitachi公司),精密酸度計(上海大普儀器有限公司)。

1.2 研究方法

1.2.1小鼠腹腔巨噬細胞提取培養及分組 小鼠飼養于清潔環境,腹腔注射含5%淀粉的生理鹽水2 mL,連續3 d,麻醉處死,75%酒精浸泡5 min,置于無菌超凈臺;去除小鼠腹部皮膚,腹腔注射RPMI-1640培養基5 mL,按摩1～2 min,靜置5 min,回收小鼠腹腔內溶液至50 mL離心管;800 r/min離心5 min,棄上清;含10%血清、1%雙抗的RPMI-1640培養基重懸細胞,調整至合適密度接種至6孔板,置于37 ℃的5%CO2培養箱培養2 h;去除懸液,磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)溶液清洗6孔板,加完全培養基培養,貼壁細胞即為小鼠腹腔巨噬細胞;將等滲鹽酸加入RPMI-1640中,將培養基pH分別調至6.5、7.3;將1 mol/L乳酸加到pH7.3的RPMI-1640中,使培養基中乳酸的終濃度為20 mmol/L;小鼠腹腔巨噬細胞分組設為pH7.3組、pH6.5組、0.02 mol/L乳酸組,分別加pH7.3、pH6.5、乳酸終濃度為0.02 mol/L的培養基,于37 ℃的5%CO2培養箱中培養。

1.2.2實時熒光定量PCR(real-time quantitative PCR detecting,RT-PCR)檢測小鼠腹腔巨噬細胞中白介素1β(inerleukins-1β,IL-1β)、缺氧誘導因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)、ARG-1、VEGF及PER1的表達 取“1.2.1”項下提取3組小鼠腹腔巨噬細胞,于37 ℃的5%CO2培養箱中培養24 h,PBS溶液清洗3次;Trizol試劑提取總RNA,使用微量核酸儀測定所提取RNA濃度和純度,瓊脂糖膠電泳檢測RNA降解情況;使用TaKaRa PrimeScript RT reagent Kit 逆轉錄試劑盒逆轉錄為互補DNA(complementary DNA,cDNA);以此cDNA為模板進行RT-PCR檢測,反應條件:95 ℃預變性30 s,95 ℃變性5 s、60 ℃復性34 s、72 ℃延伸30 s、40個循環;采用2-ΔΔCt法計算相關基因表達量。RT-PCR引物序列見表1。

表1 腹腔巨噬細胞極化相關基因RT-PCR引物序列Tab.1 RT-PCR primer sequences for polarization-related genes in peritoneal macrophages

1.2.3酶聯免疫吸附劑測定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)檢測巨噬細胞極化相關分子IL-10、IL-12、VEGF、TNF-α的分泌量 取“1.2.1”項下3組小鼠腹腔巨噬細胞,于各自培養基中培養24 h,收集上清液,1 700 r/min離心10 min。根據ELISA試劑盒說明書檢測IL-10、IL-12、VEGF、TNF-α的分泌水平。

1.2.4陽離子脂質體制備和鑒定 通過薄膜水合法制備陽離子脂質體。首先,稱量DOTAP 1.265 mg、DOPE 1.35 mg、膽固醇0.5 mg、DSPE-PEG2000-NHS(摩爾比為7∶7∶5∶1)0.75 mg充分溶解于氯仿溶液3 mL中,使用旋轉蒸發儀以60 ℃、120 r/min條件旋蒸1 h,形成脂質體薄膜;其次,加無核酸酶雙蒸水5 mL,超聲水浴儀60℃超聲30 min,置于冰上,超聲探頭超聲水合5 min;最后,使用小型擠壓器按400 nm、200 nm、100 nm的順序通過聚碳酸酯膜得到單層脂質體,置于4℃避光保存。使用無酶水溶解siRNA,將siRNA與脂質體溶液按照1∶10的質量比于室溫下震蕩混勻;隨后按照1∶1 000體積比加APC-CD206抗體,室溫避光孵育30 min得到脂質體-PER1復合體(liposome-PER1,Lipo-PER1)陽離子脂質體。取Lipo-PER1 2 mL按體積比1∶10、1∶100及1∶500加無菌無酶雙蒸水稀釋,分別滴加至銅網,2%磷鎢酸負染,室溫通風干燥,透射電子顯微鏡于200 KV電壓觀察樣品。PER1-siRNA序列:sense為GACCATTCCCCTATTCGCT,Anti-sense為CTTTATGGCGACCCAACAC。

1.2.5B16-F10黑色素瘤細胞、RAW264.7巨噬細胞培養及共聚焦顯微鏡觀察Lipo-PER1靶向巨噬細胞 B16-F10黑色素瘤細胞、RAW264.7巨噬細胞加入含10%胎牛血清、1%青霉素鏈霉素的高糖培養基,置于37 ℃的5%CO2培養箱培養;對數生長期的RAW264.7、B16-F10細胞按1∶1比例混合并調整至合適密度,以1∶1 000體積比加PE-F4/80抗體避光孵育30 min;細胞接種至蓋玻片,加三甲川花菁染料(cyanine 3,cy3)標記的Lipo-PER1,加OPTI-MEM無血清培養基,置于37 ℃的5%CO2培養箱避光培養6 h,使用共聚焦顯微鏡對細胞進行觀察并拍照。

1.2.6RT-PCR檢測Lipo-PER1對巨噬細胞極化相關因子CD86、IL-1β、ARG-1及IL-10表達的影響 RAW264.7巨噬細胞接種至6孔板中培養,分為空白對照(Control)組、liposomes(Lps)空白脂質體對照組、Lipo-NC陰性對照組及Lipo-PER1組,后3組分別加空白脂質體、Lipo-NC、Lipo-PER1;加無血清OPTI-MEM培養基混勻,置于37 ℃的5%CO2培養箱培養6 h;更換完全培養基培養24 h;PBS溶液清洗3次,Trizol試劑提取總RNA,使用微量核酸儀測定所提取RNA濃度和純度,瓊脂糖膠電泳檢測RNA降解情況;使用TaKaRa PrimeScript RT reagent Kit 逆轉錄試劑盒合成cDNA,以此cDNA為模板使用TB Green Premix Ex Taq進行RT-PCR檢測;反應條件為95 ℃預變性30 s,95 ℃變性5 s、60 ℃復性34 s、72 ℃延伸30 s、40個循環;采用2-ΔΔCt法計算CD86、IL-1β、ARG-1及IL-10基因的表達。RT-PCR引物序列見表2。

表2 RAW264.7巨噬細胞極化相關基因RT-PCR引物序列Tab.2 RAW264.7 RT-PCR primer sequence of macrophage polarization-related gene

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 腹腔巨噬細胞中ARG-1、VEGF、HIF-1α、PER1 mRNA和蛋白的表達

RT-PCR結果表明(圖1),與pH7.3組對比,pH6.5組和0.02 mol/L乳酸組小鼠腹腔巨噬細胞IL-1β mRNA表達下調(P<0.05),ARG-1、VEGF、HIF-1α及PER1mRNA表達上調(P<0.05);ELISA結果表明(圖2),相比于pH7.3組,pH6.5與0.02 mol/L乳酸組小鼠腹腔巨噬細胞IL-12、TNF-α蛋白水平減少(P<0.000 1),IL-10、VEGF蛋白水平增加(P<0.01)。

注：與pH7.3組比較,(1)P<0.05,(2)P<0.01。

注：與pH7.3組比較,(1)P<0.01,(2)P<0.0001。

2.2 納米顆粒的表面特征

Lipo-PER1冷凍透射電鏡觀察結果顯示(圖3),Lipo-PER1是具有明顯雙層膜的類球狀脂質體,其粒徑為(113.2±21.03)nm。

注：A為Lipo-PER1的冷凍透射電鏡圖(12 000×); B為Lipo-PER1粒徑分布統計。

2.3 Lipo-PER1轉染RAW264.7巨噬細胞

共聚焦顯微鏡觀察結果顯示(圖4),Lipo-PER1能夠成功包裹PER1-siRNA(紅色熒光)被RAW264.7巨噬細胞(綠色熒光)攝取,而黑色箭頭指向B16-F10黑色素瘤細胞內部無熒光;RT-PCR結果表明,與Lipo-NC組相比,Lipo-PER1組RAW264.7巨噬細胞中PER1 mRNA表達下調(P<0.000 1)。

注：A為共聚焦顯微鏡觀測Lipo-PER1靶向RAW264.7巨噬細胞(600×),綠色熒光為PE-F4/80代表RAW264.7巨噬細胞,紅色熒光代表Cy3-PER1-siRNA,黑色箭頭指向B16-F10黑色素瘤細胞;B為RT-PCR檢測RAW264.7巨噬細胞中PER1的相對表達量;(1)與Lipo-NC組比較,P<0.000 1。

2.4 RAW264.7巨噬細胞中IL-1β、CD86、ARG-1、IL-10 mRNA和蛋白的表達

RT-PCR結果表明(圖5),與Lipo-NC組相比,Lipo-PER1組RAW264.7巨噬細胞中IL-1β、CD86mRNA表達上調(P<0.05或P<0.001),ARG-1、IL-10 mRNA表達下調(P<0.01或P<0.05);ELISA結果表明(圖6),與Lipo-NC組相比,Lipo-PER1組RAW264.7巨噬細胞中TGF-β蛋白表達增加(P<0.000 1),TNF-α蛋白表達減少(P<0.05)。

注：與Lipo-NC比較,(1)P<0.05,(2)P<0.001,(3)P<0.01。

注：與Lipo-NC相比,(1)P<0.05,(2)P<0.0001。

3 討論

巨噬細胞源自于骨髓中前體細胞,是先天免疫反應中重要成員之一[17]。巨噬細胞在不同的刺激下改變其表型,如:經典途徑激活的巨噬細胞M1型和M2型[18]。M1巨噬細胞由輔助性T細胞1型細胞因子如干擾素-γ(interferon γ,IFN-γ)、脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)等誘導激活。M1巨噬細胞能表達IL-1β、IL-6及TNF-α等細胞因子,進而發揮抗腫瘤作用[19]。M2巨噬細胞由IL-4及IL-13等細胞因子誘導激活,并通過表達M2標志分子如TGF-β、VEGF等進而抑制炎癥和促進傷口愈合[20];腫瘤細胞的高糖酵解可導致乳酸和H離子積累,并最終形成腫瘤酸性微環境[21];在缺氧和細胞外高濃度乳酸的條件下,乳酸可以轉運到細胞內,通過不同機制激活HIF-1α進而促進TAMs向M2型極化和ARG-1、VEGF的表達[21]。本研究結果顯示,乳酸和H離子形成的酸性微環境能夠上調小鼠腹腔巨噬細胞中ARG-1、VEGF、HIF-1α、PER1 mRNA表達,抑制IL-1β mRNA表達,表明酸性微環境能促進巨噬細胞M2型極化、抑制M1型極化。這提示PER1可能參與酸性微環境誘導巨噬細胞M2型極化。PER1是生物鐘機制的重要組成部分,而生物鐘功能已被證明可以影響巨噬細胞表型[22];抑制PER1的表達可上調由高脂肪飲食誘導的小鼠的脂肪和肝臟組織炎癥中M1型巨噬細胞占比[23];Xu等[24]發現通過上調PER1的表達,能夠上調骨髓細胞中M2巨噬細胞的占比;Ding 等[25]研究顯示,通過體外模擬低氧環境實驗能上調RAW264.7巨噬細胞中PER1的表達。其研究表明PER1能抑制M1巨噬細胞極化、促進M2巨噬細胞極化。本研究結果也表明,酸性微環境能上調小鼠腹腔巨噬細胞中PER1 mRNA的表達。在腫瘤微環境中由于缺氧和異常的糖酵解形成酸性微環境,這提示腫瘤酸性微環境可能通過上調小鼠腹腔巨噬細胞中PER1的表達,進而促進巨噬細胞M2型極化。

為了進一步驗證PER1對巨噬細胞極化的影響,本研究通過構建Lipo-PER1納米顆粒靶向遞送PER1-siRNA,結果顯示,Lipo-PER1能夠成功靶向RAW264.7巨噬細胞并下調PER1 mRNA的表達。本研究結果表明,在成功沉默PER1的表達后,RAW264.7巨噬細胞中M1標志分子CD86、IL-1β mRNA表達上調,M2標志分子ARG-1、IL-10 mRNA表達下調。同時,ELISA結果顯示,相比Lipo-NC組,Lipo-PER1組RAW264.7巨噬細胞中TGF-β的分泌量上調,TNF-α的分泌量下調。TGF-β是M2型巨噬細胞分泌的主要免疫抑制細胞因子之一。上述結果提示PER1能促進RAW264.7巨噬細胞M2型極化、抑制M1型極化。

綜上所述,腫瘤酸性微環境能上調巨噬細胞中PER1的表達,進而可能促進巨噬細胞M2型極化。但本研究還存在一定的局限性,PER1調控巨噬細胞M2型極化的具體機制與Lipo-PER1體內靶向研究是本課題今后進一步的研究方向。