載阿霉素納米粒溫敏凝膠復合體系的體內緩釋性能和抗腫瘤作用及瘤內滯留性能評價*

杜華康, 陸苑, 金陽, 陳玉穎, 王永林,3, 李勇軍,3, 劉文***

(1.貴州醫科大學 貴州省藥物制劑重點實驗室 & 省部共建藥用植物功效與利用國家重點實驗室, 貴州 貴陽 550004; 2.貴州醫科大學 藥學院, 貴州 貴陽 550004; 3.貴州醫科大學 民族藥與中藥開發應用教育部工程研究中心, 貴州 貴陽 550004)

原發性肝癌是一種致命的消化道惡性腫瘤,其特點是起病隱匿、進展快、生活質量差及生存時間短[1],包括肝細胞癌(75%～85%)、肝內膽管癌(10%～15%)及混合細胞癌(<15%)[2-4]。由于大多數肝癌患者在早期無明顯癥狀,確診時已處于中晚期[5-6]。對于這類中晚期患者,通常采用經肝動脈化療栓塞術(transarterial chemoembolization,TACE),即在數字減影血管造影機引導下,經導管將混有化療藥物的碘油注射至腫瘤組織供血的二級或三級動脈血管中,局部栓塞腫瘤組織的供血,“餓”死腫瘤的同時釋放化療藥物“毒”死腫瘤[7-8]。現已證實,傳統TACE治療后(化療藥物與碘油簡單的混合乳化后注射),與系統給藥方式相比,腫瘤局部藥物濃度雖能在短時間提高100倍以上,但化療藥物會在1～2 d內迅速擴散殆盡,腫瘤局部藥物有效治療濃度維持時間短,難以達到臨床期望效果[9]。為解決傳統TACE中化療藥物維持局部有效濃度時間短的問題,臨床上已廣泛推廣載藥微球(將化療藥物裝載在聚合物材料內,可達到緩慢釋放藥物的目的)[10]。但這類載藥微球價格昂貴,給肝癌患者帶來巨大經濟壓力,且為不可降解材料不利于后續治療。本課題組前期研究制備的通過微導管注射的載阿霉素納米粒溫敏凝膠(doxorubicin-loaded nanoparticles thermosensitive gel,DOX-NPs-Gel)復合體系可較好地解決傳統TACE中阿霉素(doxorubicin,DOX)-碘油乳劑釋藥過快的問題且材料安全、可生物降解,但其在體內的緩釋性能、抗腫瘤作用及瘤內滯留性能尚不明了,因此本研究考察了DOX-NPs-Gel在大鼠體內的緩釋性能和對H22荷瘤模型小鼠的抑瘤效果及瘤內滯留性能。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1動物和細胞來源 雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠18只,體質量(250±20)g,購于遼寧長生生物技術股份有限公司[生產許可號SCXK(遼)2020-0001];美國癌癥研究所(Institute of Cancer Research,ICR)雄性小鼠90只,體質量(20±2)g,購于斯貝福(北京)生物技術有限公司[生產許可號SCXK(京)2019-0010];小鼠肝癌細胞株H22細胞購自武漢普諾賽生命科技有限公司。本研究實驗方案獲得學校實驗動物倫理委員會審查批準(2201022)。

1.1.2主要試劑 DOX(含量>98.0%,大連美倫生物),殼聚糖(脫乙酰度≥95%,上海羅恩試劑),β-甘油磷酸鈉(含量≥98.0%,美國西格瑪奧德里奇),罌粟乙碘油注射液(碘濃度為480 g/L,江蘇恒瑞),PLGA(相對分子量10 kD,西安瑞禧生物),卵磷脂(供口服用藥用輔料,江蘇曼氏生物),吐溫-80(北京索萊寶),阿奇霉素(含量>98.0%,大連美倫生物),其余試劑為分析純。

1.1.3主要儀器 ACQUITY UPLC型超高效液相色譜-三重四級桿質譜串聯儀(美國Waters),Forma 905-ULTS1490醫用低溫冰箱(美國Thermo Fisher),FDU-1100真空冷凍干燥機(日本東京理化器械),JY88-IIN細胞破碎機(寧波新芝生物),90Plus激光粒度儀(美國布魯克),R100旋蒸儀(瑞士步琦),Optima XPN-100超速離心機和Allegra X-30R低溫高速離心機(美國貝克曼庫爾特公司),MSC5R磁力攪拌器(群安實驗),UV-2700紫外可見分光光度儀(島津儀器),IMS-20制冰機(常熟雪科),XYN-15LP氮氣發生器(上海析友),EL204電子天平(上海梅特勒-托利多)。

1.2 研究方法

1.2.1DOX-碘油的配制 用兩注射器分別吸取4 g/L DOX溶液1 mL 與碘油1 mL,通過三通管連通并混勻,臨用前現配。

1.2.2大鼠體內緩釋性能考察 18只雄性SD大鼠隨機均分為DOX組、DOX-碘油組及DOX-NPs-Gel組,分別腹腔注射給予DOX、DOX-碘油及DOX-NPs-Gel(DOX為5 mg/kg,DOX濃度為2 g/L),分別在給藥后不同時間點(5、10、15、30、45、90、150 min及4、12、24、36、48、60、72、96、120、144、168 h)經眼底靜脈叢穿刺取血100 μL,置于肝素化的1.5 mL離心管中,4 000 r/min離心10 min,分離血漿50 μL。參考根據課題組前期確定的樣品處理方法和超高效液相色譜-串聯質譜(ultra performance liquid chromatograph mass spectrometer,UPLC-MS/MS)定量測定血漿中DOX濃度[11-12],經WinNonLin 8.1軟件擬合得到主要藥動學參數,包括半衰期(half life,t1/2)、峰濃度(peak concentration,Cmax)、藥時曲線下面積(area under curve,AUC)、清除率(clearance,CL)及平均駐留時間(mean residence time,MRT)。

1.2.3H22細胞的培養、收集及H22荷瘤模型小鼠的建立 參考文獻方法[13-14]培養、收集H22細胞并建立H22荷瘤小鼠模型。H22細胞懸液經2次小鼠腹水傳代后,PBS稀釋,制成2×1010個/L的腫瘤細胞懸液;取上述腫瘤細胞懸液0.2 mL分別于90只小鼠右腋皮下單次接種,以接種后小鼠右腋出現肉眼可見瘤體為造模成功。

1.2.4小鼠體內抗腫瘤作用 取“1.2.3”項下H22荷瘤模型小鼠36只,隔天測量腫瘤體積,待腫瘤生長至400 mm3時開始給藥。將荷瘤小鼠均分為生理鹽水組、空白NPs-Gel組、碘油組、DOX組、DOX-碘油組及DOX-NPs-Gel組,DOX、DOX-碘油及DOX-NPs-Gel的給藥量為10 mg/kg(以DOX計),DOX濃度為2 g/L。碘油組給藥為碘油與水的乳劑,其制備除將DOX溶液換為生理鹽水外,其它與DOX-碘油制備一致。生理鹽水組、碘油和空白凝膠組給藥體積為5 mL/kg。各組給藥方式均采用瘤內注射,給藥1次,給藥當天記為第0 天,治療周期10 d。

1.2.5小鼠體質量變化及生長情況 取“1.2.4”項下各組小鼠給藥期間每2天稱定體質量1次,繪制體質量變化曲線,計算各組小鼠的體質量變化百分比[體質量變化百分比(%)=當日體質量(mi)/最初體質量(m0)×100%]。

1.2.6小鼠腫瘤生長情況及抑瘤率的計算 取“1.2.5”項下各組小鼠稱重后同時測量瘤體寬度、長度并計算腫瘤體積(volume,V),同時繪制腫瘤生長曲線;給藥10 d后,脫頸處死各組小鼠,完整剝離腫瘤組織,稱取瘤體質量并計算抑瘤率[抑瘤率(%)=(生理鹽水組小鼠平均瘤體質量-各治療組小鼠平均瘤體質量)/生理鹽水組小鼠平均瘤體質量×100%]。

1.2.7小鼠腫瘤組織蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色 取“1.2.6”項下各組小鼠腫瘤組織稱重、拍照記錄后,放置于4%多聚甲醛固定液中保存,常規脫水,石蠟包埋、切片,HE染色,置于顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.8瘤內滯留性能評價 取“1.2.3”項下H22荷瘤小鼠54只,待H22荷瘤小鼠生長至400 mm3左右時開始給藥。將荷瘤小鼠均分為DOX組、DOX-碘油組及DOX-NPs-Gel組,給藥劑量和途徑同“1.2.4”項下操作。各組分別于12、24、48、72、96及120 h時選擇3只小鼠脫頸處死,剝離腫瘤組織,參考課題組前期確定的樣品處理方法和UPLC-MS/MS分析方法測定腫瘤組織中DOX濃度[13-14],計算各時間點下DOX瘤內滯留率(DOX瘤內滯留率=DOX測得量/DOX給藥量×100%)。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 大鼠體內緩釋性能

藥動學結果顯示(圖1和表1),48 h時DOX組和DOX-碘油組大鼠血漿中DOX含量低于檢測限,168 h時DOX-NPs-Gel組大鼠血漿中DOX濃度仍為90.5 μg/L,與DOX組和DOX-碘油組相比,DOX-NPs-Gel組的AUC0-t分別提高7.9倍和12.2倍,CL分別降低96.8%和97.4%,MRT0-∞分別延長4.1倍和3.4倍,Cmax分別提高1.0倍和1.1倍,t1/2分別延長52.1倍和19.7倍。

表1 各組大鼠的主要藥動學參數Tab.1 The main pharmacokinetic parameters of each

圖1 各組大鼠血漿DOX平均血藥質量濃度-時間曲線Fig.1 Average DOX concentration-time curve in plasma of rats in each group

2.2 小鼠生長情況

給藥后荷瘤小鼠體質量的變化趨勢結果顯示(圖2),DOX組、碘油組和DOX-碘油組小鼠體質量于治療后第2天出現下降,下降幅度大小依次為DOX-碘油組>碘油組>DOX組;DOX組和碘油組小鼠體質量第6天恢復到治療前,DOX-碘油組治療結束時體質量仍未恢復至治療前;DOX-NPs-Gel組小鼠體質量與生理鹽水組和空白NPs-Gel組變化趨勢一致,未出現下降,提示DOX-NPs-Gel對機體幾乎無毒副作用。

圖2 各組荷瘤小鼠給藥后的體質量變化Fig.2 Weight change in load tumor mice after administration

2.3 小鼠體內抗腫瘤作用

各組小鼠瘤體質量比較結果見表2所示,生理鹽水組小鼠瘤重與空白NPs-Gel組比較、差異無統計學意義(P>0.05),各治療組小鼠瘤體質量均較生理鹽水組和空白NPs-Gel組下降(P<0.05),DOX-碘油組小鼠瘤體質量較DOX組下降(P<0.05),碘油組小鼠瘤體質量與DOX-碘油組瘤體質量比較、差異無統計學意義(P>0.05),DOX-NPs-Gel組瘤體質量小于其余各治療組(P<0.05),提示其具有較好的抑瘤效果;各組小鼠抑瘤率比較結果見表2所示,碘油組、DOX組、DOX-碘油組和DOX-NPs-Gel組小鼠抑瘤率分別為54.8%、54.1%、68.3%和76.6%。各組小鼠腫瘤生長情況顯示(圖3),治療期間生理鹽水組和空白NPs-Gel組小鼠瘤體生長迅速,其余各治療組瘤體生長速度均降低,其中DOX-NPs-Gel組生長速度最慢;各組小鼠腫瘤組織HE染色結果如圖4所示,生理鹽水組和空白NPs-Gel組小鼠腫瘤組織切片中可見細胞排列緊密、細胞核大、無明顯壞死細胞,表明組織內細胞處于快速增殖狀態,但其它各治療組腫瘤組織切片出現細胞分布不規則、核固縮、破裂、溶解,提示腫瘤細胞壞死,其中DOX-NPs-Gel組腫瘤組織切片中出現大面積的細胞核固縮和溶解。

表2 各組小鼠的瘤體質量和抑瘤率Tab.2 Tumor weight and tumor inhibition rate of rats in each group

注：A為各組腫瘤實體的剖截圖,B為各組腫瘤治療期間腫瘤體積變化情況。

圖4 各組小鼠瘤體的組織學特征(HE,×10)Fig.4 Histological characteristics of the tumor in each group (HE,×10)

2.4 瘤內滯留性能

各組小鼠DOX瘤內滯留率如圖5所示。DOX組與DOX-碘油組小鼠DOX瘤內滯留率變化趨勢基本一致,各時間點下DOX瘤內滯留率比較,差異無統計學意義(P>0.05);第12 h時,2組小鼠DOX瘤內滯留率分別為(57.4±7.6)%和(49.6±4.1)%,96 h時已降至0%;前96 h內所檢測的時間點下DOX-NPs-Gel組小鼠DOX瘤內滯留率均高于其他組(P<0.05),而DOX-NPs-Gel組第120 h時DOX瘤內滯留率仍為(44.1±3.9)%。

注：(1)與DOX組相比,P<0.05;(2)與DOX-碘油組相比,P<0.05。

3 討論

傳統TACE作為中晚期肝細胞癌的一線治療方法,在臨床中得到了廣泛應用。通常化療藥物和碘油是臨用前乳化,但乳化后的乳液穩定性較差[15]。本研究中模擬臨床制備方法制備DOX-碘油,結果顯示DOX-碘油混勻后靜置1 min會出現明顯分層現象,與相關報道一致。

溫敏凝膠的藥動學考察,通常是采用皮下注射的方式給藥[16]。本課題前期預實驗中曾采用皮下注射的給藥方式考察DOX、DOX-碘油和DOX-NPs-Gel在大鼠體內藥代動力學過程,結果顯示各組釋放均較為緩慢且無差異,可能是因為皮下血管較少,吸收過程為限速過程,無法準確模擬肝臟中豐富血管的吸收過程;此外,皮下注射一段時間后,在注射部位會出現結痂,可能是因為局部藥物濃度過高導致的皮膚壞死。因此,本研究采用腹腔注射的方式給藥。為了模擬TACE術后藥物的體內過程,腹膜表面積很大且具有豐富血管,吸收能力強,可較好模擬肝動脈血管環境[17]。本研究藥動學結果表明,DOX-NPs-Gel組與DOX-碘油組相比達峰時間略晚,CL降低,Cmax、t1/2、AUC0-t和MRT0-t均增加;DOX-NPs-Gel組在48～168 h內血藥濃度近乎無波動,這表明此時消除相與吸收相幾乎達到平衡;這種恒速釋放對維持腫瘤內化療藥物高濃度,提高腫瘤的治療效果具有重要意義[18]。

體內抗腫瘤研究結果顯示,DOX-NPs-Gel組小鼠瘤體質量最小、抑瘤率最大,結合其給藥后體質量變化和瘤內滯留性能考察結果,分析原因可能是DOX-NPs粒徑小于<200 nm,根據腫瘤組織的高滲透性和滯留效應,DOX-NPs傾向于滯留在腫瘤組織中,加上凝膠和納米粒本身均具有緩釋作用,因而能有效減少DOX在腫瘤部位的逃逸,降低DOX的毒副作用,延長治療時間,提高治療效果[19]。碘油在肝癌的TACE治療中通常充當顯影劑和栓塞劑的角色[20]。本研究結果提示,碘油具有一定的抑瘤作用,分析其原因可能是碘油將腫瘤細胞完全包裹,阻礙了腫瘤細胞與組織液之間的物質交換,促進了細胞死亡[21]。此外,結合碘油給藥后,荷瘤小鼠體質量變化的結果可推斷碘油存在毒性作用。DOX組與碘油組小鼠瘤重和抑瘤率結果相當,結合其在瘤內滯留性能考察結果和給藥后荷瘤小鼠體質量變化,考慮推測DOX注射到腫瘤后可發揮抑瘤作用,但無法長時間維持治療濃度,DOX暴露在體環境中,引起荷瘤小鼠體質量下降。DOX-碘油組小鼠抑瘤率高于DOX組和碘油組,瘤重小于DOX組和碘油組,表現出較強的抗腫瘤作用,但瘤內滯留性能考察結果表明DOX與DOX-碘油滯留基本一致,推測其抗腫瘤作用是碘油和DOX共同作用的結果。同時受到碘油和DOX的雙重影響,DOX-碘油組荷瘤小鼠在治療期間體質量下降最多。通過分析各組給藥后荷瘤小鼠體質量的變化趨勢可用于評估藥物的毒副作用[22-23]。因此可推測DOX-NPs-Gel具有良好的安全性。

為更加貼合實際,后續研究可考慮采用兔肝癌VX2模型以TACE方式給藥進行藥動學與藥效學考察。腫瘤治療的困難之一是藥物瘤內滯留量不足或維持時間不足,因此理想的藥物遞送系統應可將藥物滯留在靶部位較長時間。瘤內滯留性能考察結果顯示, DOX-NPs-Gel組小鼠DOX瘤內滯留率高于DOX組和DOX-碘油組,具有良好的瘤內滯留性能。

綜上所述,DOX-NPs-Gel在體內可緩慢釋藥,瘤內注射后DOX可長時間滯留于腫瘤組織,從而可有效地抑制腫瘤發展,具有一定的TACE應用前景。