右美托咪定對異丙酚誘導的發育期大鼠海馬組織細胞焦亡的作用及機制*

王迪, 何祥, 楊劍

(1.貴州醫科大學附屬醫院 麻醉科, 貴州 貴陽 550004; 2.貴州醫科大學 麻醉學院, 貴州 貴陽 550004; 3.貴州省人民醫院 麻醉科, 貴州 貴陽 550004 )

異丙酚因其具有誘導快速穩定、蘇醒迅速及術后惡心嘔吐發生率低等特點,被廣泛應用于嬰幼兒的全身麻醉手術[1-2]。然而,有動物實驗表明,異丙酚誘導可致新生大鼠神經元細胞焦亡,與異丙酚激活NOD樣受體家族Pyrin域蛋白-3(NOD-like receptor family,pyrin domain containing 3,NLRP3)炎性小體途徑有關[3-5]。NLRP3炎性小體是一種細胞內蛋白復合物,在許多病理學中已成為炎癥的關鍵介質,微生物和危險信號激活NLRP3后,導致促炎細胞因子白細胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)和IL-18的釋放,以及Gasdermin-D蛋白(gasdermin-D protein,GSDMD)介導的焦亡[6]。GSDMD介導的細胞焦亡是一種促炎類型的程序性細胞死亡,其特征是NLRP3炎性小體激活,同時下游天冬氨酸特異性半胱天蛋白酶-1(aspartate-Specific caspase 1,Caspase-1)被激活,影響細胞膜的通透性,釋放IL-1β和IL-18等炎性細胞因子產生炎癥反應,進而引發細胞焦亡[7-10],而神經元炎癥反應和細胞焦亡會引起認知功能障礙[11]。因此,接受異丙酚麻醉后,可能會對新生兒神經系統的結構和功能產生損害。探索降低異丙酚麻醉后對新生大鼠神經元細胞發生焦亡的具體機制,可深入了解降低異丙酚引起的不良反應提供一定的理論依據。右美托咪定是一種高選擇性α2受體激動劑,具有鎮痛、鎮靜、抑制炎癥反應的作用,臨床上常用于鎮靜、麻醉等[12]。不過,目前右美托咪定對大腦神經元細胞焦亡的改善機制還沒有完全清楚。研究發現,通過激活蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)的活性,右美托咪定可以改善神經元的炎癥反應[13],還可以抑制NLRP3炎性小體途徑的炎癥反應,改善神經元細胞焦亡[14-15]。A激酶錨定蛋白150(a-kinase anchoring protein 150,AKAP150)作為A激酶錨定蛋白家族成員,在PKA水平上調控其活性,通過將PKA錨定于適當的底物,提高磷酸化效率和信號傳導的準確性,在信號傳遞中起著重要的作用[16-18]。因此,本研究在前期研究的基礎上[19],對發育期SD大鼠進行異丙酚和AKAP150腺病毒處理,構建發育期大鼠細胞焦亡及AKAP150敲除模型,并通過右美托咪定預處理,探討AKAP150在右美托咪定改善異丙酚誘導的發育期大鼠海馬組織細胞焦亡中的作用,為促進右美托咪定在減輕神經元細胞焦亡領域中的應用提供新的科學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1實驗動物 7 d齡健康新生SD大鼠40只,體質量14～18 g,雌雄不限,購自斯貝福(北京)生物技術有限公司[SCXK(京)2019-0010],所有大鼠均分籠飼養于恒溫標準動物房,12 h光照,環境安靜,溫度20～24 ℃,濕度50%～65%,標準飼料,自由飲食、飲水,定期更換墊料,保持動物房干凈整潔。本研究已獲醫院倫理委員會批準(2001633)。

1.1.2主要儀器和試劑 超微量紫外可見光分光光度計(杭州米歐儀器有限公司),PCR儀(杭州米歐儀器有限公司),臺式高速冷凍離心機(湖南可成儀器設備有限公司),電泳儀電源(北京龍方科技有限公司),垂直電泳槽(北京六一儀器廠),eBlotTML1 快速濕轉儀(金斯瑞生物科技股份有限公司),Multiskan FC型酶標儀(Thermo scientific),透射電子顯微鏡(HITACHI,HT7700);AKAP150腺病毒由復百澳(蘇州)生物醫藥科技有限公司設計并合成,丙泊酚中/長鏈脂肪乳注射液(北京費森尤斯卡比醫藥有限公司),鹽酸右美托咪定注射液(揚子江藥業集團有限公司),胞漿胞核蛋白提取試劑盒(南京凱基生物),所有抗體和引物設計合成均購自武漢華研生物科技有限公司。

1.2 研究方法

1.2.1動物分組及模型建立 40只健康SD大鼠按隨機數字表法均分對照(control,Con)組、異丙酚(propofol,Pro)組、右美托咪定預先給藥(dexmedetomidine was preadministered,DP)組及AKAP150腺病毒+DP(A-kinase anchoring protein 150 adenovirus+DP,ADP)組。Con組大鼠腹腔注射與藥物處理組等容量的生理鹽水;Pro組大鼠首次腹腔注射異丙酚50 mg/kg,待大鼠翻正反射恢復后,即刻追加異丙酚50 mg/kg;DP組大鼠腹腔注射右美托咪定25 μg/kg,20 min后按Pro組給藥方案對大鼠進行異丙酚麻醉;ADP組大鼠予AKAP150腺病毒腹腔注射,注射結束后1 h按DP組方案對大鼠進行藥物處理。

1.2.2標本采集 “1.2.1”項下Con組大鼠于注射結束后2 h、其余組大鼠麻醉蘇醒后2 h,采用頸椎脫臼法處死,取海馬組織,于-80 ℃低溫保存供后續研究檢測。

1.2.3透射電鏡下觀察海馬組織超微結構變化 取各組大鼠海馬組織,2.5%戊二醛固定液固定,餓酸固定,磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline,PBS)沖洗3次,梯度乙醇脫水,丙酮滲透,包埋,制成60～80 nm超薄切片,鈾鉛雙染色各8 min,放入銅網盒內室溫干燥過夜,將切片置于透射電子顯微鏡下觀察,采集圖像分析。

1.2.4蛋白印跡實驗(Western blot)檢測海馬組織AKAP150、磷酸化PKA(phosphorylation-PKA,p-PKA)、NLRP3、GSDMD 、IL-1β及IL-18蛋白的表達 取“1.2.2”項下各組大鼠海馬組織,加細胞裂解液充分裂解,4 ℃下12 000 r/min離心5 min,取上清液分裝于0.5 mL離心管,置于-20 ℃保存;聚氰基丙烯酸正丁酯(bicin choninic acid,BCA)試劑盒測定蛋白濃度,加樣緩沖液,加熱,冷卻后上樣,依次經過電泳、轉膜、封閉、漂洗,加一抗(GAPDH 1∶2 000、AKAP5 1∶1 000、NLRP3 1∶1 000、GSDMD 1∶1 000、IL-1β 1∶1 000、IL-18 1∶1 000及p-PKA 1∶1 000)過夜;洗滌緩沖液(tris-buffered saline and tween,TBST)洗滌5次,加相應的加辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)標記二抗(1∶10 000),室溫搖床孵育2 h;TBST洗滌5次,增強型化學發光試劑(enhanced chemiluminescence,ECL)發光試劑盒進行化學發光、顯影、定影及沖洗膠片,用ipp分析膠片灰度值,以GAPDH為內參計算目標蛋白相對表達量。

1.2.5實時熒光PCR(quantitative reverse transcription PCR,RT-qPCR)檢測海馬組織AKAP150、PKA、NLRP3、GSDMD、IL-1β及IL-18 mRNA表達 取“1.2.2”項下各組大鼠海馬組織100 mg提取總RNA,測定總濃度,使用反轉錄試劑盒反轉錄合成反轉錄DNA(complementary DNA,cDNA)。以cDNA產物作為模版,配置逆轉錄反應體系為正向引物0.4 μL、反向引物0.4 μL、cDNA 10 μL及滅菌水4.8 μL;反應程序為預變性(95 ℃ 10 min)1次循環,變性(95 ℃ 15 s)40次循環,退火延伸(60 ℃ 60 s)40次循環,溶解曲線采集(60 ℃ 60 s、95 ℃ 15 s)1次循環,用2-ΔΔCt分析相關基因轉錄情況。引物序列見表1。

表1 熒光定量PCR引物序列Tab.1 Primer sequences for fluorescent quantitative polymerase chain reaction

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 組織學特征

Con組大鼠海馬組織細胞結構基本正常;Pro組、ADP組大鼠海馬組織損傷程度較高,主要表現為細胞膜破損嚴重,形成孔道;DP組大鼠海馬組織損傷程度較輕,細胞膜結構基本完整。見圖1。

注：箭頭表示細胞膜。

2.2 海馬組織中AKAP150、p-PKA、NLRP3、GSDMD、IL-1β及IL-18 蛋白的表達

Western blot檢測結果顯示(圖2),與Con相比,Pro組、DP組及ADP組大鼠海馬組織AKAP150、p-PKA蛋白表達均下調(P<0.05),NLRP3、GSDMD、IL-1β、IL-18蛋白表達均上調(P<0.05);與Pro組相較,DP組大鼠海馬組織AKAP150、p-PKA蛋白表達均上調,NLRP3、GSDMD 、IL-1β及IL-18蛋白表達均下調(P<0.05);與DP組相比,ADP組大鼠海馬組織AKAP150、p-PKA蛋白表達均下調,NLRP3、GSDMD 、IL-1β、IL-18蛋白表達均上調(P<0.05)。

注：A為各蛋白的電泳結果,B為各蛋白的定量結果;(1)與Con組比較,P<0.05;(2)與Pro組比較,P<0.05;(3)與DP組比較,P<0.05。

2.3 海馬組織中AKAP150、PKA、NLRP3、GSDMD、IL-1β及IL-18 mRNA的表達

RT-qPCR檢測結果顯示(圖3),與Con相比,Pro組、DP組、ADP組大鼠海馬組織AKAP150、PKA mRNA表達均下調(P<0.05),NLRP3、GSDMD 、IL-1β及IL-18 mRNA表達均上調(P<0.05);與Pro組相比,DP組大鼠海馬組織AKAP150、PKA mRNA表達均上調(P<0.05),NLRP3、GSDMD 、IL-1β及IL-18 mRNA表達均下調(P<0.05);與DP組相比,ADP組大鼠海馬組織AKAP150、PKA mRNA表達均下調(P<0.05),NLRP3、GSDMD 、IL-1β及IL-18 mRNA表達均上調(P<0.05)。

注：(1)與Con組比較,P<0.05;(2)與Pro組比較,P<0.05;(3)與DP組比較,P<0.05。

3 討論

越來越多的研究表明,異丙酚麻醉會造成新生大鼠海馬組織細胞焦亡[19-20]。這意味著,異丙酚麻醉可能會對新生兒產生神經毒性,從而影響其大腦認知功能。細胞焦亡是一種炎癥性程序性細胞死亡,其特征是由炎癥小體NLRP3觸發并由GSDMD蛋白執行,造成細胞膜穿孔,進而引起細胞死亡,在死亡的過程中釋放炎性因子IL-1β和IL-18,導致并放大炎癥反應,這也被認為是細胞焦亡的經典信號通路[21]。

因右美托咪定具有良好的鎮靜、鎮痛及抗焦慮等作用,還能抑制炎癥反應[22],在兒科醫學上的應用廣泛[23-25]。研究表明,神經元細胞發生焦亡時,NLRP3、GSDMD表達上調,炎性因子IL-1β和IL-18的合成分泌增多[5-6]。右美托咪定可以通過NLRP3炎癥小體途徑減輕丙泊酚誘導的海馬組織細胞焦亡[4],當PKA的活性增強時,可以抑制NLRP3炎性小體介導的神經元細胞焦亡[14]。最新研究表明,右美托咪定可通過上調PKA活性而改善神經元的炎癥反應及細胞焦亡,PKA參與了調控NLRP3炎癥小體引起的細胞焦亡和炎性反應,當PKA活性增強時,下游的NLRP3、IL-1β及IL-18表達下調,從而減輕了神經元炎性反應和細胞焦亡[13,26-28]。而PKA的活性取決于A激酶錨定蛋白[29],該蛋白通常被認為是PKA的支架蛋白,磷酸化事件通過與各種支架蛋白的相互作用來控制[17]。AKAP150屬于A激酶錨定蛋白家族成員,可精確地調控一系列信號轉導事件的空間位置和時間順序,通過將PKA錨定于適當的底物并形成相應的復合物,在PKA水平上調控其活性,提高磷酸化效率以及確保信號傳導的準確性[16,18]。本研究結果顯示,異丙酚麻醉后的發育期大鼠,海馬組織AKAP150的表達明顯下調,同時PKA活性也隨之下調,細胞焦亡相關蛋白NLRP3、GSDMD以及炎性因子IL-1β、IL-18的表達明顯上調。右美托咪定預先給藥后,海馬組織AKAP150的表達明顯上調,同時PKA活性也隨之上調,細胞焦亡相關蛋白NLRP3、GSDMD以及炎性因子IL-1β、IL-18的表達明顯下調。為進一步驗證AKAP150與PKA、NLRP3、GSDMD以及炎性因子IL-1β、IL-18的相關性,通過腺病毒將AKAP150敲除后發現,AKAP150的表達被抑制的同時,PKA活性也隨之明顯下調,細胞焦亡相關蛋白NLRP3、GSDMD以及炎性因子IL-1β、IL-18的表達則明顯上調。同時,細胞焦亡的特征是膜孔形成,本研究中透射電鏡圖像分析表明,異丙酚麻醉后,海馬組織細胞膜結構破壞,膜孔增加,右美托咪定預給藥后減輕了這一趨勢。綜上所述,有理由考慮,右美托咪定可能通過激活AKAP150表達,增強了PKA的活化水平,抑制了細胞焦亡相關蛋白NLRP3、GSDMD的表達,減少了海馬組織中炎性因子IL-1β和IL-18的合成和分泌,從而發揮出改善異丙酚所致的發育期大鼠海馬組織細胞焦亡的作用。因此,臨床上可考慮將右美托咪定視為一種具有潛力藥用前景的麻醉輔助用藥,但其作用機制和毒理性有待進一步研究。