不同產(chǎn)地滇黃精高效液相色譜法指紋圖譜的建立及其多糖含量測定*

馬琴, 郭思濰, 杜強, 楊國海, 王才武, 周雪*, 吳林菁*

(1.貴州醫(yī)科大學 藥學院 天然藥物資源優(yōu)效利用重點實驗室 & 貴州省高等學校天然藥理與成藥性評價重點實驗室, 貴州 貴陽 561113; 2.貴州省農(nóng)業(yè)科學院, 貴州 貴陽 550025; 3.天柱縣三方田種植專業(yè)合作社, 貴州 天柱 556608)

滇黃精(PolygonatumkingianumColl. et Hemsl.)是百合科黃精屬草本植物,收載于歷版《中國藥典》[1-2],其干燥塊莖可加工成傳統(tǒng)中藥,是我國知名的“藥食同源”類植物[3-4]。有研究表明滇黃精有效化學成分多樣[5-6],主要含有多糖、黃酮、皂苷等化學成分[7-8],具有保護腎臟、保護心臟、抗糖尿病及抗衰老等藥理作用[9-12]。滇黃精活性成分多樣,且作用機制復雜,不同種屬和產(chǎn)地的生物功能活性和成分含量也會有所差別,主要分布在云南、貴州等地[13]。目前廣西、四川、云南及貴州各地區(qū)均有種植[14-16],而不同的種植生態(tài)環(huán)境是否會對滇黃精的質(zhì)量產(chǎn)生一定影響,目前尚未見相關(guān)研究報道。中藥指紋圖譜是目前被國內(nèi)外均認可的有效質(zhì)量控制方法[13],其技術(shù)涉及眾多方法,其中高效液相色譜法(high performance liquid chromatography, HPLC)具有高效迅速、重現(xiàn)性好及靈敏度高等多個優(yōu)點,當前已成為中藥指紋圖譜研究中的首選方法[17]。由于野生資源逐漸無法滿足市場需求,因此人工栽培滇黃精的經(jīng)濟效益逐漸顯現(xiàn),具有良好的發(fā)展前景[18-20]。滇黃精喜陰濕的氣候環(huán)境,具有耐寒、怕干旱等特性,為明確滇黃精不同產(chǎn)地和有效成分含量的關(guān)系,本研究基于HPLC建立貴州不同產(chǎn)地及臨近省份廣西、四川的滇黃精指紋圖譜,并結(jié)合主要有效成分黃精多糖的含量測定,希望能為有效推動高質(zhì)量滇黃精人工種植的發(fā)展提供一定參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1藥材來源 試驗樣品收集于貴州各地,并經(jīng)貴州民族大學民族醫(yī)藥學院王祥培教授鑒定為百合科植物滇黃精PolygonatumkingianumColl.et Hemsl.,樣品來源詳見表1。

表1 不同滇黃精藥材樣品的產(chǎn)地來源及批號Tab.1 Source and batch No. information of nine batches of Polygonatum kingianum

1.1.2主要試劑與儀器 無水葡萄糖(批號CHB190213,HPLC≥98%)購自成都克洛瑪生物科技有限公司,甲醇、乙腈是色譜純,其余試劑均是分析純,水是純化水;UV-2700紫外可見光分光光度計[島津儀器(蘇州)有限公司],Ultimate 3000 HPLC高效液相色譜儀(美國 Thermo Fisher Scientific公司,配備系統(tǒng)控制器、脫氣組件、自動進樣器、柱溫箱、溫控樣品室、四元梯度泵、Chromeleon色譜數(shù)據(jù)工作站),SH2-D(Ⅲ) 循環(huán)水式多用真空泵(鄭州豫華儀器制造有限公司),RV3 ECO S096旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器[德國IKA(廣州)儀器設(shè)備有限公司],AE-240型電子天平[Mettler toledo國際貿(mào)易(上海)儀器有限公司],KQ5200E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 研究方法

1.2.1色譜條件 色譜柱為DiKMA Platisll ODS C18(250 mm×4.6 mm,5 μm),流動相為乙腈(A)-0.05%磷酸水溶液(B),體積分數(shù)線性梯度洗脫:0～30 min(10%～22%A)、30～50 min(22%～25%A)、50～75 min(25%～38%A)、75～80 min(38%～46%A)、80～90 min(46%～84%A)、90～105 min(84%～100%A);進樣量20 μL,流速1 mL/min,柱溫35 ℃,檢測波長203 nm。

1.2.2供試品溶液的制備 精密稱取黃精藥材粉末1 g,置三角燒瓶,加80%乙醇10 mL,室溫超聲處理30 min(功率250 W,頻率40 kHz),過濾取濾液,80%乙醇40 mL溶解濾渣,超聲處理30 min,合并2次濾液,60 ℃水浴蒸干,50%甲醇定容至5 mL,搖勻,0.22 μm微孔濾膜濾過,取續(xù)濾液,即得供試品溶液。

1.2.3HPLC指紋圖譜的建立 (1)精密度試驗:精密吸取滇黃精供試品溶液(S9),按“1.2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次。(2)穩(wěn)定性試驗:精密吸取滇黃精供試品溶液(S9)于第0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h時依次進樣測定。(3)重復性試驗:按“1.2.2”項下方法平行制備6份S9號滇黃精供試品溶液,依次進樣測定。分別對各樣品共有峰保留時間和峰面積進行統(tǒng)計并計算相對標準偏差(relative standard deviation,RSD)。(4)對照指紋圖譜的建立:取各批次滇黃精供試品溶液進樣測定,記錄色譜圖。采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012版)”建立9批不同產(chǎn)地滇黃精指紋圖譜,并統(tǒng)計各樣品的共有色譜峰及計算相似度。

1.2.4多糖對照品溶液的制備及線性關(guān)系考察 參照2020年《中國藥典》方法[1]配制葡萄糖對照品溶液,方法稍加改進,精密稱取無水葡萄糖10 mg于100 mL量瓶,加水溶解并稀釋至刻度,搖勻,即得多糖對照品溶液。精密吸取適量對照品溶液于5 mL試管,加水至1 mL,搖勻,冰水浴中滴加0.2%蒽酮-硫酸溶液至刻度,混勻、放冷,水浴保溫10 min,取出置冰水浴10 min,即得各濃度對照品溶液;于紫外-可見分光光度計582 nm波長處測定吸光值,以吸光度值為縱坐標,濃度(mg/L)為橫坐標,繪制標準曲線。

1.2.5滇黃精多糖含量測定 (1)供試品溶液的制備:分別取各批次滇黃精樣品0.25 g,加80%乙醇150 mL,加熱回流1 h,趁熱濾過,殘渣用80%乙醇洗滌3次;殘渣及濾紙置燒瓶中,加水30 mL,置沸水浴中加熱回流1 h,趁熱濾過;殘渣及燒瓶用熱水洗滌4次,合并濾液與洗液,放冷,轉(zhuǎn)移至250 mL量瓶,加水定容,取1 mL置5 mL試管,照“1.2.4”項下自“加水至1.0 mL”起進行制備。(2)精密度試驗:取滇黃精供試品溶液(S9),重復測定6次得各樣品吸光度值。(3)穩(wěn)定性試驗:取滇黃精供試品溶液(S9),分別于第0、20、40、60、80、100及120 min測定吸光度。(4)重復性試驗:制備S9號滇黃精供試品溶液6份,依次測定各樣品吸光度。(5)加樣回收率:精密吸取S9號滇黃精溶液9份,測定各樣品吸光度并計算多糖含量;根據(jù)多糖含量的50%、100%及150%質(zhì)量分數(shù)設(shè)定低、中、高3個含量梯度,加無水葡萄糖對照品,每組平行制備3份,測定吸光度,并計算多糖加樣回收率。(6)滇黃精多糖含量測定:取各批次滇黃精供試品溶液,測定各樣品吸光度并計算多糖含量。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用 Excel 2013 軟件進行數(shù)據(jù)處理;標準曲線利用Origin 2021軟件進行繪圖;通過SPSS 20.0軟件進行 Pearson 相關(guān)分析和系統(tǒng)聚類分析及主成分因子分析。

2 結(jié)果

2.1 滇黃精HPLC指紋圖譜的建立

2.1.1HPLC指紋圖譜的構(gòu)建及共有峰的確認 滇黃精HPLC對照指紋圖譜圖和9批次樣品疊加圖譜見圖1,共標定了12個共有色譜峰,設(shè)定保留時間適中、分離度較好、峰面積較大及峰形較穩(wěn)定的7號共有峰作為參比峰(S),計算指紋圖譜中各共有峰相對保留時間(表2)和相對峰面積(表3);9批不同產(chǎn)地滇黃精樣品相似度介于0.762～0.946,除S8號樣品外,其余8批滇黃精相似度均在0.8以上(表4)。

注：A為對照指紋圖,B為9批次樣品疊加指紋圖。

表2 不同產(chǎn)地滇黃精樣品共有峰的相對保留時間Tab.2 Relative retention time of common peaks of Polygonatum kingianum from different origins

表3 不同產(chǎn)地滇黃精樣品共有峰的相對峰面積Tab.3 Relative peak areas of common peaks of Polygonatum kingianum from different origins

表4 不同產(chǎn)地滇黃精樣品指紋圖譜的相似度Tab.4 Similarity of fingerprint profiles of Polygonatum kingianum from different origins

2.1.2方法學驗證 精密度試驗測得滇黃精峰面積和共有峰保留時間的RSD值范圍分別為0.30%～2.24%和0.08%～0.55%,提示本研究所用儀器平行性好、精密度高;重復性試驗測得滇黃精峰面積和共有峰保留時間RSD值范圍分別為2.13%～2.70%和0.02%～0.58%,提示本法的重復性良好;穩(wěn)定性試驗測得滇黃精峰面積和共有峰保留時間RSD值范圍分別為0.80%～2.83%和0.12%～0.53%,提示供試品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.3聚類分析 滇黃精樣品共有峰峰面積的系統(tǒng)聚類分析結(jié)果表明(圖2),當歐氏距離>10時,不同來源的9批滇黃精最終分為3類,貴州貴陽、廣西百色、貴州劍河、貴州銅仁及四川內(nèi)江聚為一類,貴州赤水和貴州安順聚為一類,貴州納雍和貴州天柱聚為一類。

圖2 不同產(chǎn)地滇黃精樣品共有峰峰面積的聚類分析Fig.2 Cluster analysis of common peak areas of Polygonatum kingianum of different origins

2.1.4主成分分析 由表5可知,共有3個主成分因子的特征值符合要求,分別為5.273、3.069及2.118;3個主成分因子的累積方差貢獻率為 87.162%,說明前3個主成分可代表樣品大部分信息,適用于主成分分析;依據(jù)主因子載荷絕對值越大,對主成分貢獻越大,由表6可知,主成分因子1反映了峰2、3、4、8、9、10及11的信息,主成分因子2反映了峰 6、7、11及12的信息,峰 1、5及10在主成分因子3上有較高的載荷,載荷圖詳見圖3;通過3個主成分因子對9批滇黃精樣品進行了綜合評分,結(jié)果見表7,主成分因子綜合得分(major factor synthesis score,MFSC)中S9號滇黃精(貴州天柱)最高,相較而言,貴州滇黃精整體質(zhì)量較好,特別是貴州天柱、貴州赤水、貴州納雍及貴州銅仁產(chǎn)地。

圖3 滇黃精的主因子載荷Fig.3 Principal factor loadings of Polygonatum kingianum

表5 滇黃精主成分因子的特征值和方差貢獻率Tab.5 Eigenvalues and variance contributions of the principal component factors of Polygonatum kingianum

表6 旋轉(zhuǎn)后的滇黃精主因子載荷矩陣表Tab.6 Rotated principal factor loading matrix for Polygonatum kingianum

表7 滇黃精的主成分因子得分及排序Tab.7 Principal component factor scores and ranking of Polygonatum kingianum

2.2 滇黃精多糖含量測定

2.2.1多糖標準曲線的繪制 按照“1.2.4”項下方法對梯度質(zhì)量濃度的標準品溶液進行線性回歸,質(zhì)量濃度與吸光值之間呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系(圖4),得出多糖的線性回歸方程:y=0.052 3x-0.025 5,決定系數(shù)r2=0.999 3。

圖4 多糖標準曲線Fig.4 Standard curve of polysaccharide

2.2.2方法學驗證 精密度試驗測得滇黃精6次吸光度的RSD值分別為0.15%;重復性試驗測得7個時間點的滇黃精樣品吸光度的RSD值為1.05%;穩(wěn)定性試驗測得6份滇黃精樣品吸光度的的RSD值為0.65%。50%、100%及150%濃度的樣品量、加入量、測得量及回收率見表8,最后計算3個不同比例加入量的黃精多糖含量的平均回收率為98.81%,RSD值為1.03 %,表明該方法的準確度良好。

表8 滇黃精多糖的加樣回收率Tab.8 Spiked recoveries of Polygonatum kingianum polysaccharide

2.2.3多糖含量測定 按照“1.2.5(1)”項下制備各批次供試品溶液,按照“1.2.5(6)”項下方法測定樣品吸光度,9批滇黃精多糖含量為7.16%～27.27%(表9),均符合2020版《中國藥典》(一部)規(guī)定的黃精多糖含量>7%的標準。該檢測結(jié)果說明9個產(chǎn)地的黃精質(zhì)量均較好,但不同產(chǎn)地間多糖含量存在一定差異,依次為貴州劍河>貴州安順>貴州天柱>貴州銅仁>貴州赤水>貴州貴陽>貴州納雍>廣西百色>四川內(nèi)江。

表9 不同產(chǎn)地滇黃精樣品的多糖含量Tab.9 Polysaccharide content of Polygonatum kingianum samples from different origins

3 討論

黃精作為藥食兩用大宗藥材,用途廣泛,始載于《名醫(yī)別錄》,其味甘、性平,具有補氣養(yǎng)陰、健脾、潤肺及益腎的功效,用于陰虛肺燥、陰血不足及脾胃虛弱之證[21]。據(jù)《中國植物志》記載,黃精屬植物約60種,其中有20種為我國特有種,用途廣泛,多做藥用[22]。《中國藥典》(2020版)收載黃精藥材來源于百合科黃精屬黃精、多花黃精及滇黃精3種原植物的干燥根狀莖[1],其中滇黃精主要分布在云南、貴州、四川及廣西等西南地區(qū)[22]。黃精屬植物主要含多糖類、甾體皂苷類、黃酮類、三萜皂苷類、生物堿類及木脂素類等多種類型的化學成分[9]。其中甾體皂苷類成分(如薯蕷皂苷和原薯蕷皂苷)可通過降低胰島素耐受等發(fā)揮降糖作用,且可通過抑制癌癥細胞的增殖等發(fā)揮抗腫瘤作用[23]。三萜皂苷類成分(如羥基積雪草苷)在抗氧化、神經(jīng)保護及抗腫瘤等方面具有廣泛的藥理作用[24];人參皂苷Rb1可通過提高胰島素敏感性發(fā)揮降糖作用[25];黃酮類成分(如甲基麥冬二氫高異黃酮)不僅可通過抑制糖尿病大鼠糖基化終產(chǎn)物(advanced glycation end-product, AEG)的形成等發(fā)揮降糖作用,還可通過阻滯細胞周期等發(fā)揮抗腫瘤作用[26-27]。此外,蘆丁、新甘草苷等黃酮類成分雖廣泛存在于植物體中,但在抗氧化、抗糖尿病等方面具有重要作用,也可以作為該屬植物發(fā)揮藥效的基礎(chǔ)物質(zhì)[28-29]。

中藥色譜指紋圖譜具有“整體性”和“模糊性”兩個基本屬性,在物種區(qū)分、中藥質(zhì)量評價等方面具有明顯優(yōu)勢,可從化學成分分布及含量分布比例等方面實現(xiàn)對同屬不同物種、同一物種不同樣品間的整體相似度進行比較[30]。本研究首先通過HPLC法構(gòu)建了9批不同產(chǎn)地滇黃精指紋圖譜,相似度評價良好,確認了12個共有峰;方法學考察精密度、重復性及穩(wěn)定性良好(RSD<3%),提示此法準確可靠,可作為滇黃精藥材的定性鑒定和質(zhì)量評價的參考依據(jù)。9批不同產(chǎn)地來源的滇黃精指紋圖譜相似度評價結(jié)果顯示,除四川內(nèi)江(S8)的相似度低于0.8,其余8批滇黃精藥材的相似度均高于0.800,其中有7批藥材來源于貴州,尤其是貴州納雍(S3)、貴州安順(S5)、貴州天柱(S10),相似系數(shù)均高于0.9,有效反映了貴州滇黃精均一性好、藥材質(zhì)量穩(wěn)定。

多糖是黃精屬植物的主要活性成分,是歷版《中國藥典》中黃精質(zhì)量控制的指標。本研究參照2020版《中國藥典》以蒽酮-硫酸法測定滇黃精多糖[1],9批滇黃精均符合藥典標準,且黃精多糖含量均高于7%,其中含量高于20%的依次是貴州劍河、貴州安順及貴州天柱,雖氣候環(huán)境的不同會對黃精的質(zhì)量產(chǎn)生一定影響,但實驗結(jié)果顯示貴州多數(shù)地區(qū)產(chǎn)的黃精質(zhì)量略優(yōu)于鄰近省份。

通過指紋圖譜共有峰的HCA結(jié)果顯示,雖然歐氏距離>10時,四川內(nèi)江、廣西百色與貴州貴陽、貴州銅仁、貴州劍河存在交叉情況,但四川、廣西兩省的滇黃精多糖含量分別為7.16%和7.99%,而貴州各地區(qū)的黃精多糖含量均在12.67%及以上;主成分因子綜合得分中貴州天柱產(chǎn)黃精最高,相較而言,貴州滇黃精整體質(zhì)量較好,特別是貴州天柱、貴州赤水、貴州納雍及貴州銅仁產(chǎn)地。

目前,黃精在農(nóng)業(yè)、醫(yī)療保健、食品和化妝品等多個領(lǐng)域的開發(fā)都取得了顯著的進展,市場對黃精的需求量巨大,以黃精作為主要原料的藥品、食品及保健品種類繁多[31-32]。黃精藥理活性顯著,原料需求量正隨著新產(chǎn)品的研發(fā)問世逐年增加,但黃精野生資源有限,已遠遠不能滿足市場需求[33-34]。為擴大黃精產(chǎn)業(yè)未來發(fā)展,加強對黃精進行規(guī)范化種植,從源頭保證黃精品質(zhì),深入探究不同產(chǎn)地、種屬黃精及生態(tài)環(huán)境差異與質(zhì)量間的關(guān)系,為全面健康的開發(fā)黃精產(chǎn)業(yè)資源提供支撐和參考依據(jù)。

綜上所述,本研究通過建立滇黃精HPLC指紋圖譜及黃精多糖含量測定,并采用聚類分析和主成分分析對9批滇黃精質(zhì)量進行綜合評價,不僅對黔產(chǎn)滇黃精的質(zhì)量具有更加清晰的認識,研究結(jié)果也反映了貴州滇黃精均一性好,藥材質(zhì)量穩(wěn)定,相較于鄰近兩省黔產(chǎn)滇黃精具有更優(yōu)的質(zhì)量,為貴州大宗藥材的種植產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供一定的科學依據(jù)。