宏基因組二代測序在下呼吸道感染患者支氣管肺泡灌洗液中的病原學診斷價值

程長昆 姜長舟

下呼吸道感染是指喉以下的氣管、支氣管、肺泡等部位發生的感染性疾病［1］。下呼吸道感染的病原體十分復雜，以細菌和真菌為主要致病因素［2］。及時準確地鑒定下呼吸道感染的病原體，對于指導臨床合理用藥、降低耐藥率、改善患者預后具有重要意義［3］。目前，臨床上常用的下呼吸道感染病原體檢測方法主要有傳統的微生物培養、分子生物學檢測和宏基因組二代測序（metagenomics next-generation sequencing，mNGS）等［4-7］。近年來，mNGS在下呼吸道感染的病原學診斷中逐漸展現出其優勢和潛力［8-10］。支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）是利用支氣管鏡對肺段或亞肺段進行灌洗后采集到的肺泡表面液體，是目前最能反映下呼吸道感染的病原體分布情況的標本，具有較高的代表性和準確性［11］。因此，本研究采用mNGS和常規培養檢測方法對下呼吸道感染患者BALF中的病原體進行分析，探討2種方法的優缺點和一致性，以及mNGS檢出陽性與患者臨床指標和預后的關系，為臨床提供有價值的參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧性收集2020年4月至2023年3月安慶市望江縣醫院內科130例下呼吸道感染患者的臨床資料。根據mNGS是否檢出病原體，將患者分為檢出組100例和未檢出組30例。兩組患者年齡、性別和基礎疾病比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表1。本研究符合倫理原則，經過醫院倫理委員會批準（倫理編號：2023-LC-003）。

表1 兩組患者一般資料比較

1.2 納入與排除標準 納入標準：①年齡≥18歲者；②以《諸福棠實用兒科學》（第8版）［12］中下呼吸道感染的診斷標準為金標準，包括社區獲得性肺炎、醫院獲得性肺炎、呼吸機相關性肺炎等者；③入院后24 h內進行支氣管鏡檢查并采集BALF樣本者；④BALF樣本同時進行mNGS和常規培養檢測者。排除標準：①合并其他部位的感染性疾病者；②BALF樣本不符合質量要求，如回收率低于30%、細胞總數低于104/mL、中性粒細胞比例高于80%等者；③BALF樣本在運輸或保存過程中發生污染或損壞者；④患者或其家屬不同意參與本研究者。

1.3 方法 所有患者均在入院后24 h內進行支氣管鏡檢查，按照標準操作程序采集BALF樣本，每個肺段或亞肺段灌注生理鹽水20～40 mL，回收率不低于30%，回收液體立即分裝為2份，一份用于mNGS檢測，另一份用于常規培養檢測。

1.3.1 mNGS檢測 采用QIAamp DNA Mini Kit（Qiagen，德國）提取BALF樣本中的總核酸，采用NEBNext Ultra Ⅱ DNA Library Prep Kit for Illumina（NEB，美國）構建文庫，采用Illumina NovaSeq 6000平臺進行雙端150 bp高通量測序。測序數據經過質量控制、去除人源序列、去除低質量序列、去除重復序列等步驟后，與NCBI數據庫進行比對分析，根據比對結果確定病原體種類和相對豐度。設定檢出閾值為每百萬條reads中至少有5條reads與目標序列匹配。

1.3.2 常規培養檢測 將BALF樣本接種于血瓊脂培養基、巧克力瓊脂培養基、MacConkey瓊脂培養基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基等不同培養基上，置于37℃恒溫箱中培養24～48 h，觀察菌落生長情況，按照常規方法進行菌種鑒定和藥敏試驗。同時將BALF樣本接種于液體培養基中，置于自動血培養儀中培養5 d，觀察是否有陽性信號產生，如有陽性信號，則進行菌種鑒定和藥敏試驗。另外，將BALF樣本制成涂片，在油鏡下觀察是否有真菌或寄生蟲存在。

1.4 觀察指標 主要觀察指標為mNGS和常規培養檢測的陽性率、檢測病原體的分布、病原體檢測的一致性。次要觀察指標為mNGS檢出組和未檢出組患者的臨床指標、治療方案、預后情況及影響mNGS檢出陽性的因素。其中，臨床指標包括外周血白細胞、C反應蛋白、降鈣素原、中性粒細胞計數及血清中細胞因子的濃度。預后情況包括住院時間、轉入ICU的比例、機械通氣的比例及病死率等。

1.5 統計學方法 采用SPSS 22.0軟件進行數據分析。計量資料均符合正態分布以表示，兩組間均數比較采用t檢驗；計數資料以頻數和百分比表示，兩組間比較采用χ2檢驗。mNGS與常規培養檢測結果的一致性采用Kappa系數進行評價，Kappa值在0.01～0.20為無一致性，0.21～0.40為較低一致性，0.41～0.60為中等一致性，0.61～0.80為較高一致性，0.81～1.00為完全一致性。影響mNGS檢出陽性的因素采用logistic多因素回歸分析，以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 mNGS和常規培養檢測結果比較 mNGS檢測結果顯示，130例下呼吸道感染患者BALF中共檢出病原體100株，未檢出寄生蟲。mNGS檢出陽性率為76.9%（100/130）。常規培養檢測結果顯示，130例下呼吸道感染患者BALF中共檢出病原體56株，未檢出非典型病原體和寄生蟲。mNGS與常規培養檢測的陽性率比較，差異有統計學意義（χ2=31.026，P＜0.001）。見表2。以《諸福棠實用兒科學》（第8版）中下呼吸道感染的診斷標準為金標準，分別以常規培養及mNGS檢測結果為檢驗變量，繪制受試者工作特征（receiver operator characteristic，ROC）曲線。ROC曲線顯示，mNGS檢測的曲線下面積（area under the curveAUC）為0.84，而常規培養檢測的AUC為0.76。見圖1。

圖1 mNGS與常規培養的ROC曲線分析

表2 mNGS和常規培養檢測的陽性率和病原體分布比較

2.3 兩組患者臨床指標和預后比較 mNGS檢出組與未檢出組在外周血白細胞、C反應蛋白、降鈣素原、中性粒細胞計數及血清中細胞因子濃度差異均有統計學意義（P＜0.05）。mNGS檢出組患者的住院時間、轉入ICU的比例、機械通氣的比例、病死率等預后指標均高于未檢出組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表3。

表3 兩組患者臨床指標比較

2.4 影響mNGS檢出陽性的多因素logistic回歸分析將mNGS檢出陽性作為因變量，將年齡、性別、基礎疾病、外周血白細胞、C反應蛋白、降鈣素原、中性粒細胞計數及血清中細胞因子等作為自變量。連續變量（年齡、外周血細胞、C反應蛋白、降鈣素原、中性粒細胞計數、血清中細胞因子）以原始數值表示，二分類變量：性別（0=女性，1=男性）和基礎疾病（0=無，1=有）。采用逐步回歸法進行多因素logistic回歸分析，結果顯示，年齡、基礎疾病、外周血白細胞和C反應蛋白是影響mNGS檢出陽性的危險因素。見表4。

表4 影響mNGS檢出陽性的多因素logistic回歸分析

3 討論

下呼吸道感染是一種常見的呼吸系統疾病，其病原體復雜多樣，及時準確地鑒定病原體對于指導臨床合理用藥、降低耐藥率、改善患者預后具有重要意義。本研究采用mNGS和常規培養檢測方法對下呼吸道感染患者BALF中的病原體進行分析，探討兩種方法的優缺點和一致性，以及mNGS檢出陽性與患者臨床指標和預后的關系，為臨床提供有價值的參考。

本研究結果顯示，mNGS檢出陽性率高于常規培養檢測，差異有統計學意義（P＜0.001），與張彩霞等［13］的研究結果一致。這可能與mNGS能夠同時檢測樣本中所有類型的核酸序列，從而鑒定出多種已知或未知的微生物有關，而常規培養檢測受限于培養條件、培養時間、抗生素干擾等因素，不能檢測非培養性或難培養性微生物。

本研究結果顯示，mNGS與常規培養檢測結果在細菌、真菌和非典型病原體方面具有中等一致性（Kappa=0.42～0.54），在病毒和寄生蟲方面具有較低一致性（Kappa=0.12～0.25）。可能與以下原因有關：①mNGS能夠檢測出常規培養檢測難以發現的病原體，如非培養性或難培養性微生物、新發現的微生物等；②mNGS能夠區分不同菌屬或菌種之間的微小差異，而常規培養檢測可能將其歸為同一類；③mNGS可能檢測到一些非致病性或低致病性的微生物，如皮膚或口腔的正常菌群，而常規培養檢測可能忽略其存在；④mNGS可能檢測到一些已經死亡或被抑制的微生物的核酸殘留，而常規培養檢測只能檢測活性的微生物［14-15］。因此，mNGS與常規培養檢測結果之間存在一定的差異，不能完全替代或否定彼此，而應結合臨床綜合判斷。

本研究結果顯示，mNGS檢出陽性與患者年齡、基礎疾病、外周血白細胞和C反應蛋白等因素相關，提示mNGS可作為下呼吸道感染患者病情評估和預后判斷的輔助手段。mNGS檢出組患者的外周血白細胞、C反應蛋白、降鈣素原、中性粒細胞計數及血清中細胞因子等炎癥指標均高于未檢出組，差異有統計學意義（P＜0.05），表明mNGS檢出陽性反映了患者體內存在較強的炎癥反應［16-17］。mNGS檢出陽性提示患者預后不良［18-19］。多因素logistic回歸分析顯示，年齡、基礎疾病、外周血白細胞和C反應蛋白是影響mNGS檢出陽性的危險因素，表明這些因素與患者體內病原體負荷和感染嚴重程度有關［20］。

本研究有以下局限性：①本研究為回顧性對照研究，存在選擇偏倚和混雜因素的可能；②本研究納入的患者數量較少，可能影響結果的穩定性和可信度；③本研究未對mNGS檢測到的非致病性或低致病性微生物進行進一步驗證，可能導致結果的過度解釋或誤解。

綜上所述，mNGS在下呼吸道感染患者BALF中的病原學診斷中具有較高的敏感性和廣譜性，能夠檢測出常規培養檢測難以發現的病原體，對于指導臨床合理用藥和改善患者預后有重要意義。mNGS與常規培養檢測結果之間存在一定的差異，不能完全替代或否定彼此，而應結合臨床綜合判斷。