EBV 感染與鼻咽癌患者CD4+CD25+Treg 及相關(guān)細(xì)胞因子的相關(guān)性分析

胡 欽

（咸寧市咸安區(qū)疾控中心檢驗(yàn)科，湖北 咸寧 437000）

鼻咽癌（NPC）是指位于鼻咽腔頂部和側(cè)壁的惡性腫瘤，是我國(guó)常見(jiàn)的惡性腫瘤，尤其在華南地區(qū)發(fā)病率較高，發(fā)病率約為50 人/10 萬(wàn)[1]。EB 病毒（EBV）屬γ皰疹病毒科，為線性雙鏈DNA 病毒，除可感染B 淋巴細(xì)胞，也可感染上皮細(xì)胞或成纖維細(xì)胞[2]。EBV 感染診斷與臨床應(yīng)用共識(shí)指出，NPC 是目前最為明確的與EBV感染相關(guān)的人類上皮性腫瘤[3]。有文獻(xiàn)指出，EBV 可感染B 淋巴細(xì)胞及上皮細(xì)胞，在感染免疫功能正常的個(gè)體后通常會(huì)進(jìn)入休眠狀態(tài)，而在免疫功能低下的宿主體內(nèi)，EBV 大量增殖，并可異位感染T 細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞等，導(dǎo)致宿主免疫系統(tǒng)功能紊亂[4]。近年研究還發(fā)現(xiàn)，調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（Treg）可經(jīng)多種途徑直接或間接影響機(jī)體的免疫應(yīng)答，其中CD4+CD25+Treg 是維持機(jī)體免疫耐受的重要細(xì)胞，也是維持Th17/Treg 平衡的關(guān)鍵，Th17/Treg 平衡紊亂則可引起白介素-17（IL-17）、白介素-10（IL-10）等細(xì)胞因子過(guò)度分泌或抑制，介導(dǎo)腫瘤的發(fā)生發(fā)展[5]。但EBV 感染是否能通過(guò)調(diào)節(jié)CD4+CD25+Treg 介導(dǎo)NPC 的發(fā)生及進(jìn)展，目前相關(guān)報(bào)道不多。基于此，本研究選取120 例NPC 患者、30 例鼻咽炎患者和30 例體檢健康者作為研究對(duì)象，以探究EBV 感染與NPC 患者CD4+CD25+Treg及IL-17、IL-10水平的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

納入2019 年1 月至2022 年12 月間收治的NPC 患者120 例、鼻咽炎患者30 例和同期體檢健康者30 例作為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：NPC 和鼻咽炎均經(jīng)病理檢查和影像學(xué)檢查鑒別診斷；NPC 患者均為初治者；年齡＞18歲者；患者臨床資料完整；經(jīng)我院倫理委員會(huì)審核通過(guò)。排除標(biāo)準(zhǔn)：行手術(shù)、放化療等抗癌治療的NPC 患者；合并其他原發(fā)惡性腫瘤者；其他免疫系統(tǒng)疾病者。NPC 患者：男女分別為91 例、29 例，年齡32 ～72 歲、平均年齡（54.06±9.49）歲。鼻咽炎患者：男女分別為18 例、12 例，年齡27 ～75 歲、平均年齡（52.94±9.87）歲。體檢健康者：男女分別為18 例、12 例，年齡20 ～65 歲、平均年齡（52.67±9.45）。三組一般資料對(duì)比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

1.2 檢測(cè)方法

采集所有研究對(duì)象的外周血，采用COULTER Epics XL 型流式細(xì)胞儀（美國(guó)貝克曼公司生產(chǎn)）測(cè)定CD4+CD25+Treg 水平，采用酶聯(lián)免疫法（試劑盒由北京北方生物技術(shù)研究所有限公司生產(chǎn)，檢測(cè)步驟嚴(yán)格按試劑盒要求步驟完成）測(cè)定白介素-17（IL-17）、白介素-10（IL-10）水平；采用實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈（PCR）測(cè)定EBV DNA，EBV 核酸定量測(cè)定試劑盒由艾康生物技術(shù)有限公司提供，全自動(dòng)熒光定量PCR儀（Light Cycler 2.0）由瑞士羅氏公司生產(chǎn)，DNA 拷貝數(shù)＜500 copies/mL 記為EBV 陰性，反之記為EBV 陽(yáng)性。

1.3 觀察指標(biāo)

比較各組的外周血Treg 及其相關(guān)細(xì)胞因子（IL-10、IL-17）水平；對(duì)NPC 患者進(jìn)行EBV DNA 檢測(cè)，比較EBV 為陰性、陽(yáng)性的NPC 患者臨床病理特征差異及外周血Treg、IL-17、IL-10 水平，采用Spearman 相關(guān)分析法分析EBV DNA 與NPC 者Treg、IL-17、IL-10 水平的相關(guān)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，三組間對(duì)比采用單因素方差分析，兩兩對(duì)比采用LSD-t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)以[n(%)]表示，行χ2檢驗(yàn)；采用Spearman 進(jìn)行相關(guān)分析，并繪制ROC曲線，采用logistics回歸分析EBV感染影響因素，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組外周血Treg 及其相關(guān)細(xì)胞因子水平對(duì)比

NPC 患者CD4+CD25+Treg、IL-10 水平均高于和鼻咽炎患者和體檢健康者（P＜0.05），IL-17 水平低于鼻咽炎患者和體檢健康者（P＜0.05）；鼻咽炎患者的CD4+CD25+Treg、IL-10 水平低于體檢健康者（P＜0.05），IL-17 水平高于體檢健康者（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 各組外周血Treg 及其相關(guān)細(xì)胞因子水平對(duì)比（±s）

表1 各組外周血Treg 及其相關(guān)細(xì)胞因子水平對(duì)比（±s）

注，與體檢健康者比較，aP ＜0.05；與鼻咽炎比較，bP ＜0.05。

組別例數(shù)CD4+CD25+Treg （%）IL-10（pg/mL）IL-17（pg/mL）NPC 患者1206.65±1.80ab1.26±0.41ab4.33±1.57ab鼻咽炎患者302.70±0.82a0.48±0.18a9.77±4.73a體檢健康者304.20±1.290.76±0.097.27±2.35 F 值-27.655133.59543.590 P 值-＜0.0001＜0.0001＜0.0001

2.2 EBV 陰性者、陽(yáng)性者的臨床病理特征對(duì)比

120 例NPC 患者中EBV 陽(yáng)性者58 例、EBV 陰性者62 例。EBV 陽(yáng)性者和EBV 陰性者的臨床分期、病理類型、TNM 分期對(duì)比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），兩者性別、年齡、是否發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移對(duì)比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表2。

表2 EBV 陰性者、陽(yáng)性者的臨床病理特征對(duì)比

2.3 EBV DNA 陰性者、陽(yáng)性者外周血Treg 及IL-17、IL-10 水平對(duì)比

EBV 陽(yáng)性者的CD4+CD25+Treg、IL-10 水平高于EBV 陰性者（P＜0.05），其IL-17 水平低于EBV 陰性者（P＜0.05），見(jiàn)表3。

表3 EBV DNA 陰性者、陽(yáng)性者外周血Treg 細(xì)胞及IL-17、IL-10 水平對(duì)比（±s）

表3 EBV DNA 陰性者、陽(yáng)性者外周血Treg 細(xì)胞及IL-17、IL-10 水平對(duì)比（±s）

組別例數(shù)CD4+CD25+Treg（%）IL-10（pg/mL）IL-17（pg/mL）EBV 陽(yáng)性586.75±1.421.45±0.403.19±0.61 EBV 陰性625.30±1.491.07±0.465.47±1.01 t 值-5.4494.81514.843 P 值-<0.0001<0.0001<0.0001

2.4 外周血CD4+CD25+Treg 水平對(duì)NPC 合并EBV 感染的診斷價(jià)值分析

ROC 曲線顯示，外周血CD4+CD25+Treg 診斷NPC患者發(fā)生EBV 感染的臨界值為5.42%，AUC 為0.867，診斷敏感度為89.65%，特異度為87.10%。見(jiàn)圖1。

圖1 外周血CD4+CD25+Treg 水平對(duì)NPC 合并EBV 感染的診斷價(jià)值分析

2.5 NPC 患者EBV 感染與Treg 及IL-17、IL-10 水平的相關(guān)性分析

Spearman 相關(guān)分析顯示：EBV DNA 與NPC 患者外周血CD4+CD25+Treg、IL-10 呈正相關(guān)關(guān)系（r=0.478，0.358，P=0.000），與IL-17 呈顯著負(fù)相關(guān)性（r=0.411，P=0.000）。以NPC 合并EBV 感染作為因變量，納入年齡、性別作為校正因素進(jìn)行l(wèi)ogistics 回歸分析，結(jié)果顯示：CD4+CD25+Treg ＞5.42%是影響NPC 合并EBV 感染的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（OR=2.062,95%CI 1.574～2.703,P＜0.05）。

3 討論

Treg 細(xì)胞能通過(guò)多種機(jī)制如細(xì)胞-細(xì)胞接觸、分泌抑制性細(xì)胞因子、干擾細(xì)胞代謝等方式直接或間接影響機(jī)體的免疫應(yīng)答、產(chǎn)生免疫抑制作用[6]。目前已有研究發(fā)現(xiàn)多種惡性腫瘤與Treg 細(xì)胞的關(guān)系。張至惠等[7]學(xué)者的研究顯示，胃癌患者存在Th17/CD4+CD25+Treg 細(xì)胞漂移現(xiàn)象，Th17 細(xì)胞計(jì)數(shù)減少，細(xì)胞因子受到抑制，與此同時(shí)CD4+CD25+Treg 細(xì)胞增多，細(xì)胞因子大量分泌。曾琛等[8]學(xué)者的研究則顯示，EBV 感染、機(jī)體免疫失衡與NPC 發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，且EBV 感染可能通過(guò)募集Treg 細(xì)胞參與NPC 的免疫逃逸。張勇[9]的研究發(fā)現(xiàn)，CD4+Foxp3+Treg 細(xì)胞可通過(guò)影響Th17 的活化及增殖，調(diào)節(jié)NPC 的發(fā)生、發(fā)展，與NPC 轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)密切相關(guān)。目前普遍認(rèn)同EBV 感染與NPC 的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)[10]。但EBV 感染是否能通過(guò)調(diào)節(jié)CD4+CD25+Treg 細(xì)胞，介導(dǎo)NPC 的患病及進(jìn)展，相關(guān)研究仍較少，故本研究從此入手，分析EBV 對(duì)NPC 患者CD4+CD25+Treg 的影響。

本研究結(jié)果顯示，NPC 患者CD4+CD25+Treg 水平均高于體檢健康者和鼻咽炎患者，且鼻咽炎患者Treg 水平低于體檢健康者，出現(xiàn)這種狀況考慮與本研究納入變應(yīng)性鼻炎病例較多有關(guān)。Treg 在抑制炎癥及維持機(jī)體免疫穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮重要作用[11]，Treg 降低時(shí)會(huì)導(dǎo)致Th17/Treg細(xì)胞失衡，導(dǎo)致機(jī)體炎性反應(yīng)加重，參與鼻咽炎病情進(jìn)展。而IL-17 是Th17 細(xì)胞的主要效應(yīng)因子，具有強(qiáng)大的促炎效應(yīng)[12]。IL-10 是一種免疫抑制因子，主要由Th輔助因子T 細(xì)胞分泌[13]。NPC 患者表現(xiàn)出更高的IL-10水平和更低的IL-17 水平，提示NPC 患者有更嚴(yán)重的Th17/Treg 和Th1/Th2 失衡狀況，可能與腫瘤細(xì)胞免疫逃逸的機(jī)制有關(guān)。對(duì)比EBV 陰性和陽(yáng)性患者外周血Treg發(fā)現(xiàn)，NPC 患者EBV 呈陰性、陽(yáng)性者Treg 均出現(xiàn)上升趨勢(shì)，與前述結(jié)論相符。同時(shí)，NPC 患者EBV 呈陽(yáng)性者CD4+CD25+Treg、IL-10 水平明顯高于EBV 陰性者，這表示EBV 感染確對(duì)NPC 患者免疫功能產(chǎn)生影響。有研究認(rèn)為EBV 感染機(jī)體后，可引起T 淋巴細(xì)胞功能缺陷，還能導(dǎo)致T 淋巴細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)及T、B 淋巴細(xì)胞相互作用異常，導(dǎo)致機(jī)體免疫缺陷[14]。B 細(xì)胞是原發(fā)性EBV 感染的最初靶細(xì)胞，可介導(dǎo)原發(fā)性、持續(xù)性的EBV 感染，感染后EBV 能無(wú)限增殖，機(jī)體正常免疫狀態(tài)下異常增殖B 細(xì)胞會(huì)刺激T 細(xì)胞免疫反應(yīng)，但在T 淋巴細(xì)胞缺陷情況下則可能出現(xiàn)傳染性單核細(xì)胞增多癥或類似情況[15]。因此，EBV 感染導(dǎo)致Treg 細(xì)胞增多、免疫系統(tǒng)紊亂的機(jī)制是多方面的，與B 細(xì)胞和T 細(xì)胞均有關(guān)，仍需進(jìn)一步研究。

宗井鳳等[16]指出，治療前EBV DNA 水平可用于NPC 遠(yuǎn)期預(yù)后檢測(cè)，EBV DNA 陰性患者2 年無(wú)病生存率高于陽(yáng)性患者，且EBV DNA 拷貝數(shù)高者遠(yuǎn)期預(yù)后要比拷貝數(shù)低者差。本研究受限于隨訪時(shí)間和研究設(shè)計(jì)，未對(duì)EBV 感染與NPC 患者預(yù)后的相關(guān)性進(jìn)行分析。但本研究結(jié)果顯示，EBV 呈陽(yáng)性的NPC 患者未分化癌、TNM Ⅲ～Ⅳ期、臨床Ⅲ～Ⅳ期比例明顯高于EBV 呈陰性者，推測(cè)原因是EBV 導(dǎo)致Treg 增高、免疫抑制增強(qiáng)，使腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲能力增強(qiáng)，進(jìn)而促使NPC 病情進(jìn)展更快。ROC 曲線顯示，EBV 陽(yáng)性發(fā)生的CD4+CD25+Treg 臨界值為5.42%，可在臨床篩查中作為參考，對(duì)NPC 患者CD4+CD25+Treg 高于5.42%者進(jìn)行進(jìn)一步的診治。

綜上，EBV 感染與NPC 發(fā)生及進(jìn)展有一定聯(lián)系，CD4+CD25+Treg 及其細(xì)胞因子可能是二者聯(lián)系的關(guān)鍵。