海拔高度對煙葉生長代謝及烤后品質的影響

宋紹森，楊 杰，段旺軍，陳思昂，王衛民，張 力，許嘉陽，4，韓 丹，許自成，賈 瑋

（1.河南農業大學 煙草學院，河南 鄭州 450046；2.四川中煙工業有限責任公司，四川 成都 610011；3.浙江中煙工業有限責任公司，浙江 杭州 310009；4.河南農業大學 資源與環境學院，河南 鄭州 450046）

煙草為環境敏感型作物。海拔高度是影響煙葉產質量的重要生態因素之一，海拔高度不同，空氣溫濕度、光照強度、光照時間、降雨量等生態指標也有所差異[1-4]。研究表明，在一定范圍內，隨著海拔升高，煙田降雨量增多、日照時數增加、溫度降低，達到適宜煙草生長的要求，煙葉農藝性狀較為優良，總糖含量升高，糖堿比適宜，化學成分趨于協調，烤煙品質顯著上升[5]。但海拔過高時，光照過強、溫度過低、晝夜溫差大等因素會導致烤煙品質顯著下降。甚至有研究發現，同一種植區，海拔高度對烤煙質量的影響顯著高于植煙土壤差異造成的影響[6-7]。目前，雖然有相關研究探討海拔與煙葉品質的關系，但均限于海拔與烤后煙葉質量的關系，尚未有海拔對鮮煙葉品質影響的相關報道。

代謝組學研究始于20 世紀90 年代，由英國倫敦帝國大學NICHOLSON 等[8]提出，是一種研究生命體受外界因素干擾后體內代謝產物水平變化規律的系統生物學。植物代謝組學是代謝組學的一個分支，可用于研究不同環境條件下植物體內次生代謝物的變化特征[9-11]。因其能夠直接、準確地反映生物體的生理狀態，揭示生命活動機制，近年來在煙草中被廣泛應用[12]。如MHLONGO 等[13-14]用植物防御誘導劑刺激煙草細胞，發現脂多糖等植物誘導劑可引起煙草細胞中綠原酸的積累，進一步運用代謝組學方法揭示了植物中產生順式綠原酸異構體的生物途徑。近年來，生態環境對煙葉代謝的影響逐漸受到學者們關注。如LI 等[15]使用代謝組學分析方法分析了河南、云南、貴州3個煙區的煙草差異代謝物及其與氣候因子（降雨、日照和溫度）的關系。SUN 等[16]采用GC-MS 技術分析了云南玉溪和湖北宣恩2 個煙草品種（翠碧-1 與中煙-100）的代謝譜，論證了不同地區2 個品種的代謝產物差異，并強調了環境和品種對煙葉代謝的影響。盡管越來越多的研究基于代謝組學分析環境因子對煙葉代謝的影響，但罕見有關海拔影響煙葉代謝的報道。因此，采用非靶向代謝組學技術探討不同海拔高度下煙葉的代謝差異特征，并結合葉片超微結構變化規律，明確海拔因子對煙葉品質形成的影響，為培育優質煙葉提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗供試烤煙品種為YKS-9，供試煙田土壤類型為紅壤。海拔1 800 m 處試驗地紅壤基本理化性質為有效氮含量107.24 mg/kg、速效磷含量38.35 mg/kg、有效鉀含量160.03 mg/kg、有機質含量27.32 g/kg，pH 值6.52；海拔2 000 m 處試驗地紅壤基本理化性質為有效氮含量114.44 mg/kg、速效磷含量36.24 mg/kg、有效鉀含量163.04 mg/kg、有機質含量26.02 g/kg，pH值6.42；海拔2 200 m處試驗地紅壤基本理化性質為有效氮含量122.12 mg/kg、速效磷含量32.07 mg/kg、有效鉀含量154.35 mg/kg、有機質含量24.25 g/kg，pH值6.32。

1.2 試驗設計

試驗于2020年在四川省涼山州會東縣進行，選取1 800、2 000、2 200 m 三種海拔高度。試驗共設計3 組處理：海拔1 800 m（M1800）、海拔2 000 m（M2000）和海拔2 200 m（M2200）。各海拔地區試驗地四周設保護行，每塊試驗地面積為80 m2。煙株行距為120 cm，株距為0.5 m，每株留葉數為20～22片。各處理的煙草生產管理除試驗設計和試驗操作的要求外，其他生產管理措施均按照當地優質煙葉生產技術標準執行。

1.3 測定項目及方法

1.3.1 煙株農藝性狀 大田成熟期，從3 個海拔高度各選取10 株代表性煙株，參照YC/T 142—2010《煙草農藝性狀調查測量方法》測定農藝性狀，指標包括株高、葉片數、莖圍、節距、腰葉長和腰葉寬。

1.3.2 烤后煙葉外觀質量 待煙葉烘烤、分級后取C3F 檔次的烤煙，按照GB 2635—1992 測定方法對煙葉外觀質量進行評定。

1.3.3 烤后煙葉常規化學成分 待煙葉烘烤、分級后取C3F 檔次的烤煙，采用近紅外光譜法檢測常規化學成分。

1.3.4 烤后煙葉感官質量 待煙葉烘烤、分級后取C3F檔次的烤煙，參照YC/T 530—2015，由評吸專家對其感官質量進行打分評判。

1.3.5 鮮煙葉超微結構 待煙草生長發育至大田成熟期，各處理選取10 株代表性煙株，對從下往上數第10 葉位煙葉進行取樣。取樣時煙葉樣品必須保證盡可能新鮮，1～3 min 完成取樣，樣品組織大小2 mm×2 mm，盡量薄。將樣品組織投入電鏡固定液（2.5%戊二醛），用濾紙將樣品組織塞進固定液內，不能使其漂浮在固定液表面，4 ℃冰袋保存。

使用0.1 mol/L 磷酸緩沖液（pH 值7.4）漂洗煙葉樣品組織后，再進行后固定處理，然后依次放入30%、50%、70%、80%、95%、100%、100%乙醇中進行脫水。完成脫水處理后，依次進行滲透包埋、聚合處理、切片和染色。最后，將銅網盒內干燥的樣品放置在透射電子顯微鏡下進行觀察，采集圖像。

1.3.6 鮮煙葉代謝組的測定 待煙草生長發育至大田成熟期，各處理選取10 株代表性煙株，對從下往上數第10 葉位煙葉進行取樣。使用AB Triple TOF 6600 質 譜 儀 和Agilent 1290 Infinity LC 超 高 壓液相色譜儀進行代謝組學試驗，取樣時避開葉脈，用剪刀剪碎煙葉，迅速放入用液氮預冷的離心管中，將離心管置于干冰中保存運輸。將煙葉樣本在4 ℃環境下緩慢解凍后，取適量樣本加入預冷甲醇/乙腈/水溶液（2∶2∶1，V/V），渦旋混合，低溫超聲30 min，-20 ℃靜 置10 min，14 000×g4 ℃離 心20 min，取上清真空干燥，質譜分析時加入100 μL乙腈/水溶液（1∶1，V/V）復溶，渦旋，14 000×g4 ℃離心15 min，取上清液進樣分析。

上清液采用Agilent 1290 Infinity LC 超高效液相色譜系統（UHPLC）HILIC 色譜柱進行分離，樣本隊列中插入質量控制樣品（QC 樣品），用于監測和評價系統的穩定性及試驗數據的可靠性。對得到的數據，首先進行代謝物結構鑒定、數據預處理，然后進行試驗數據質量評價，最后再進行單變量統計分析、多維統計分析、差異代謝物篩選、差異代謝物相關性分析、KEGG通路分析等數據分析。

2 結果與分析

2.1 不同海拔高度對煙株農藝性狀和烤后煙葉品質的影響

2.1.1 煙株農藝性狀 農藝性狀能夠直觀地反映植物本身的生長狀態，整體來看，煙株長勢以M2000 處理最好，相較于M2200 處理，株高、葉片數、莖圍、腰葉長和腰葉寬分別提高了11.0%、23.0%、5.2%、16.3% 和17.0%（表1）。M2000 和M1800 處理的葉片數、腰葉長和腰葉寬均高于M2200 處理，除M1800 處理株高和莖圍顯著低于M2000 處理外，M2000 與M1800 處理其余指標差異均不顯著。由此可知，M2000 處理煙株農藝性狀表現較好，而M1800、M2200處理表現稍差。

表1 不同海拔高度對煙株農藝性狀的影響Tab.1 Effect of different altitudes on agronomic traits of tobacco plants

2.1.2 烤后煙葉外觀質量 如表2 所示，3 個海拔高度處理的烤煙外觀質量幾乎相同，僅M2200 處理烤后煙葉身份和油分指標分別表現為稍薄—中等和有—稍有，略差于M1800、M2000處理。

表2 不同海拔高度對烤后煙葉外觀質量的影響Tab.2 Effects of different altitudes on appearance quality of flue-cured tobacco

2.1.3 烤后煙葉化學成分 不同海拔高度對烤煙化學成分的影響如表3所示，整體來看，隨著海拔高度的升高，烤煙的還原糖、總糖、總煙堿含量均呈先升高后降低的趨勢，其中M2000 處理總糖、還原糖、總煙堿的含量最高，顯著高于M1800、M2200 處理，M1800 和M2000 處理糖堿比和氮堿比顯著低于M2200 處理，糖堿比更接近10，氮堿比在0.8 左右，均處于適宜范圍。整體而言，與M1800 和M2200 處理相比，M2000 處理烤煙兩糖含量較高、化學成分更加協調。

表3 不同海拔高度對烤后煙葉化學成分的影響Tab.3 Effects of different altitudes on chemical quality of flue-cured tobacco

2.1.4 烤后煙葉感官質量 感觀質量是烤煙品質好壞最直觀的評判依據，不同海拔高度對烤后煙葉感官質量的影響如表4 所示，總分結果為M2000＞M1800＞M2200，其中M2000 處理的香氣量、雜氣、柔和度、干燥感、余味得分均高于其他處理，而M1800處理的香氣質和細膩度高于M2200 處理。M2000處理C3F 等級烤后煙葉感官質量評價分數較高，煙葉質量較好。

表4 不同海拔高度對烤后煙葉感官質量的影響Tab.4 Effects of different altitudes on sensory quality of flue-cured tobacco

總之，從煙株農藝性狀，烤后煙葉外觀質量、化學成分和感官質量四方面綜合判斷，2 000 m海拔處的煙葉質量最好。

2.2 不同海拔高度對鮮煙葉超微結構的影響

液泡是植物細胞特有的細胞器，具有貯藏營養物質、維持細胞滲透壓、促進物質交流等多種生理功能。隨著海拔的升高，煙葉細胞內的液泡呈現出增大的趨勢（圖1）。

圖1 不同海拔高度下鮮煙葉葉肉細胞亞顯微結構（比例尺=20.0 μm）Fig.1 Submicroscopic structure of tobacco leaf mesophyll cells under different altitudes（bar=20.0 μm）

較低海拔高度下，葉綠體貼細胞壁排列且有部分淀粉粒產生（圖1a、b），隨著海拔高度的不斷升高，葉綠體內累積的淀粉粒數目逐漸增多，體積逐漸增大，M2200 處理葉肉細胞內的葉綠體向細胞中間轉移（圖1b、c）。

如圖2a—c 所示，M1800 處理煙葉細胞葉綠體中的基粒片層較多，隨著海拔高度升高，葉綠體中嗜鋨顆粒體積明顯增大。M1800 處理葉綠體的基粒數目較多、類囊體垛疊程度清晰完整，而M2200處理葉綠體基粒片層數與類囊體垛疊程度明顯降低，類囊體被膜逐漸降解，結構變得不完整。

圖2 不同海拔高度下鮮煙葉葉綠體及線粒體超微結構（比例尺=1.0 μm）Fig.2 Ultrastructure of tobacco leaf chloroplasts and mitochondria under different altitudes（bar=1.0 μm）

海拔高度的升高造成植物細胞內產生更多、更小的線粒體（圖2d—f）。高海拔下的植物細胞線粒體和葉綠體逐漸靠近，分布間距變小，甚至出現了線粒體嵌入葉綠體內部的現象（圖2e、f）。

2.3 不同海拔高度對鮮煙葉代謝物的影響

2.3.1 總體樣本主成分分析（PCA） 從圖3 可以看出，正、負離子模式下QC 樣本緊密聚集在一起，這說明試驗的重復性好，數據可靠。M1800、M2000、M2200 三個處理均處不同象限，間隔較遠，表明各組樣品間差異顯著。

圖3 正、負離子模式總體樣本的PCA分析Fig.3 PCA analysis of overall samples under positive and negative ion modes

2.3.2 代謝物鑒定 正負離子模式合并后共鑒定到354 種代謝物，其中正離子模式下鑒定到212 種代謝物，負離子模式下鑒定到179 種。各代謝物的化學分類歸屬信息如圖4 所示。鑒定到的代謝物中，有機酸及其衍生物占比最大，達13.559%；其次是有機氧化合物，占比12.147%；之后是脂質及類脂質分子，占比10.452%。

圖4 鑒定的代謝物在各化學分類的數量占比Fig.4 The number proportion of identified metabolites in various chemical classification

2.3.3 差異代謝物篩選 經由OPLS-DA（正交偏最小二乘判別分析）模型得到變量權重值（Variable importance for the projection，VIP）。 本 試 驗 以OPLS-DA VIP＞1 和P＜0.05 為顯著差異代謝物篩選標準。

經數據處理后，共篩選出102 種顯著差異代謝物，如圖5 所示，M1800、M2200 處理與M2000 處理間分別存在68、56 種差異代謝物。M1800 vs M2000組有18 種特有的差異代謝物，表明這18 種差異代謝物對海拔1 800～2 000 m 變化的響應更為強烈。而M2000 vs M2200 組中特有的差異代謝物僅有3種，表明這3 種差異代謝物對海拔2 000～2 200 m變化的響應更為強烈。而M1800 vs M2200 組中特有差異代謝物有9種，而這9種代謝物在另外2組中變化不顯著，表明這些物質是通過緩慢積累來響應海拔高度的變化。整體來看，3 個對比組中有13 種共同差異代謝物，與其他代謝物相比，這13 種代謝物可能更易受到海拔高度變化的擾動。

圖5 不同海拔處理間煙葉差異代謝物Venn圖Fig.5 Venn diagram of differential metabolites in tobacco leaf treated at different altitudes

2.3.4 差異代謝物鑒定 隨著海拔高度的變化，代謝物差異倍數的變化趨勢如圖6A、B 所示，整體而言，L-天冬酰胺、L-色氨酸、L-組氨酸、煙酰胺、D-脯氨酸、L-谷氨酰胺、2-氨基-2-甲基-1，3-丙二醇、D-葡萄糖酸鹽、2，3-二羥基-3-甲基丁酸、莽草酸、間氯硫嘌呤酸、泛酸、胸苷、二氫胸腺素、α-D-葡萄糖、D-來蘇糖等代謝物差異倍數大于1，顯著上調，表明此類差異代謝物在低海拔（1 800 m）地區相對含量較高。而L-苯丙氨酸、檸檬酸、丙醇二酸、腺嘌呤、鳥苷、奎尼酸、綠原酸、莨菪亭、山奈酚、蕓香苷（蘆丁）、麥芽糖、蔗糖、D-塔格糖、D-甘露糖、D-阿洛糖、新煙堿等差異代謝物差異倍數小于1，呈顯著下調趨勢，表明這些差異代謝物在高海拔地區（2 200 m）相對含量較高，在低海拔（1 800 m）地區相對含量較低，且差異顯著。

圖6 不同海拔處理間煙葉差異代謝物鑒定信息Fig.6 Differential metabolites identification information in tobacco leaf treated at different altitudes

但由圖6C—F 發現，隨海拔高度的變化，多數物質相對含量變化趨勢也會發生改變。如D-甘露糖、D-阿洛糖、D-塔格糖、奎尼酸、琥珀酸鹽、L-天門冬氨酸、L-瓜氨酸、D-半乳糖醛酸、L-蘇氨酸、D-脯氨酸、2，3-二羥基-3-甲基丁酸等代謝物差異倍數的變化趨勢為在M1800 vs M2000 組中顯著下調，在M2000 vs M2200 組中顯著上調，表明此類差異代謝物相對含量隨著海拔升高呈先升后降的趨勢。而L-色氨酸、L-異亮氨酸、文多靈堿、異莨菪亭、4-氨基丁酸、3-甲基吲哚、二十碳五烯酸、薰衣草醇等物質的差異倍數則在M1800 vs M2000 組中顯著上調，在M2000 vs M2200 組中顯著下調，表明其相對含量隨著海拔升高呈先降后升的趨勢。但也有一些物質在2 組對比中表現出相同的變化趨勢，如腺嘌呤和綠原酸，它們的差異倍數在M1800 vs M2000組和M2000 vs M2200組中均呈顯著下調趨勢。

2.3.5 代謝網絡分析 如圖7 所示，不同海拔之間的差異代謝物主要集中在氨基酸代謝、半乳糖代謝、果糖和甘露糖代謝、莽草酸代謝、TCA 循環、嘌呤代謝等通路中。在糖類的相關代謝途徑中，D-半乳糖酸、D-甘露糖、D-阿洛糖、D-塔格糖的含量隨海拔升高呈現先升后降的變化趨勢，而D-果糖、蔗糖、乳糖含量則在M2200 處理中升高，果糖含量在M2200 處理升高的原因可能為D-阿洛糖和D-塔格糖的轉化，同時，也正因為D-果糖、蔗糖、乳糖含量在M2200 處理中較高，它們的分解產物α-D-葡萄糖含量在M2000 以及M2200 處理中下調的趨勢得到緩解；嘌呤代謝中，L-谷氨酰胺含量隨海拔升高急劇下降，鳥嘌呤、腺苷含量急劇上升，這也是一種受海拔高度影響的較為直接的轉化關系。根據烤煙品質以及超微結構的變化趨勢綜合考量發現，烤煙品質也是隨海拔的升高呈現出先升后降的趨勢，在海拔2 000 m處最優。因此，α-D-葡萄糖、D-半乳糖酸、D-甘露糖、D-阿洛糖、D-塔格糖等糖類物質，莽草酸、奎尼酸、琥珀酸等有機酸，苯丙氨酸、丙氨酸、脯氨酸等氨基酸，這些差異代謝物含量的變化趨勢與煙株品質變化趨勢較為一致或完全相反，表明這些差異代謝物在受到海拔因素調控的同時，也較易受到煙株自身代謝系統的調控，且該類物質可能與煙株品質密切相關。值得注意的是，苯丙氨酸與脯氨酸含量雖先升后降，但與M1800 處理相比，M2200 處理仍有上調趨勢。隨著海拔高度的升高，蔗糖、乳糖、D-果糖、組氨酸、L-谷氨酰胺、鳥苷、腺嘌呤等物質的含量遞增或遞減，表明此類物質可能對海拔變化的響應更為強烈，其含量與海拔高度直接相關。

圖7 不同海拔高度下煙葉差異代謝物的網絡分析Fig.7 Network analysis of differential metabolites in tobacco at different altitudes

2.3.6 KEGG 途徑富集分析 根據農藝性狀以及代謝物特征結果發現，M2000 處理煙株長勢最好，3 種不同海拔高度煙株的烤后煙葉品質整體呈先升后降的趨勢。因此，以M1800 vs M2000 和M2000 vs M2200 兩組對比為主進行數據分析，對篩選出的差異代謝通路進行差異豐度得分比較（圖8）。M1800 vs M2000對比下共篩選出27個代謝通路，而M2000 vs M2200 對比下僅篩選出18 個代謝通路。其中氨基酸代謝相關通路中，2 個對比組均有6 條代謝通路，但隨著海拔高度上升，除纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸生物合成代謝通路的表達趨勢無明顯變化，色氨酸代謝通路的表達呈先降后升趨勢外，其余氨基酸代謝通路的表達均呈先升后降的趨勢；碳水化合物代謝途徑中，僅半乳糖代謝和丙酮酸代謝的表達隨海拔升高呈先升后降的趨勢，其余碳水化合物代謝途徑的表達趨勢均表現為在海拔1 800～2 000 m 顯著上升，在海拔2 000～2 200 m 無顯著變化；脂質代謝、膜運輸、輔助因子和維生素的代謝、其他氨基酸的代謝、翻譯等代謝途徑中，除不飽和脂肪酸的生物合成、β-丙氨酸的代謝以及氨酰基-tRNA 的生物合成3 種代謝通路的表達在海拔1 800～2 000 m 隨海拔升高而下降，在海拔2 000～2 200 m處無顯著差異外，其余代謝通路均表現出先升后降，或先無顯著變化后降低的表達趨勢。整體而言，在海拔1 800～2 000 m下，隨高度升高，煙株代謝通路的表達多呈現升高的趨勢；而在海拔2 000～2 200 m，隨高度升高，煙株代謝通路的表達多數為降低趨勢。

圖8 所有差異代謝通路的差異豐度得分Fig.8 Differential abundance score of all the differential metabolic pathways

3 結論與討論

3.1 海拔高度對煙草品質的影響

整體而言，不同海拔處理烤煙的農藝性狀、外觀質量、化學質量、評吸質量指標表現為M2000＞M1800＞M2200，隨著海拔高度的增加，烤后煙葉品質呈先升高后降低的趨勢。這一變化規律與魏國平等[4]、李雪芳等[5]的研究結果一致，均表現為在某一海拔高度區間內，隨著海拔的升高，烤煙產質量先升后減。其主要原因在于煙草種植的海拔高度不同，煙株生長發育所處氣候環境不同，環境溫濕度、光照強度、光照時間等生態指標隨之改變，在適宜的海拔高度下，煙株生長的環境條件良好，農藝性狀較為優良，烤煙品質顯著上升。但當海拔過高時，高海拔地區的天氣變化會使煙草遭受冷脅迫，損害煙葉的產質量。LI等[17]發現，海拔2 450 m以上的煙草種植區，晝夜溫差突變（日氣溫下降20 ℃以上）和降雨會對大田種植煙草造成冷脅迫；而OVERSTREET 等[18]研究表明，冷脅迫會降低鮮煙葉的品質。在海拔高度的變化過程中，光照強度、輻射、溫度等環境因素的變化可能是調控煙草內部代謝，影響烤后煙葉最終品質的關鍵因素。

3.2 海拔高度對煙葉超微結構的影響

本研究表明，隨著海拔的升高，煙葉細胞內的液泡體積變大，淀粉粒數目逐漸增多，但是葉綠體片層數和類囊體垛疊程度降低，而夏春等[19]發現，隨著液泡面積增大，植物細胞中葉綠體等細胞器數量減少，與本研究結論一致。說明高海拔地區對煙株產生了一定的非生物脅迫，促使煙葉細胞改變其自身結構來抵御此類脅迫。

海拔高度過高時，會對植物產生低溫、強輻射等脅迫效應，淀粉粒的積累是高海拔植物對低溫環境的一種適應性表現，隨著海拔高度的升高，葉綠體內累積的淀粉粒數目逐漸增多，體積逐漸增大；海拔高度過高時，強輻射等脅迫效應促使葉綠體的基粒片層數和類囊體垛疊程度在膜結構的降解下逐漸降低，結構被破壞[20]。葉綠體片層數減少、片層垛疊程度降低也可能是葉肉細胞在高海拔地區的適應性變化，這種變化能有效地降低植物的光捕獲能力，從而保護葉綠體免受捕獲過多光能所造成的傷害[21-22]。本研究中，在2 200 m 高度下，葉肉細胞內的葉綠體向細胞中間轉移，這可能是由于高海拔下，紫外輻射較強，光能相對豐富甚至過剩，葉綠體位置內移甚至在細胞中央分布，可以有效地減少光線的直接穿透，避免強輻射的灼傷；海拔高度的升高造成植物細胞內產生更多、更小的線粒體，低CO2分壓下生長的高山植物通過增加線粒體數目、縮小線粒體體積從而擴大內膜系統來提高植物的呼吸速率，保證植物即使處于極端環境中，也有正常的能量供應。以上這些變化都是植物對高海拔環境的一種有效適應。王玉萍等[23]發現，珠芽蓼葉片中嗜鋨顆粒與淀粉粒的數目隨海拔升高而增加，而葉綠體基粒數目和類囊體垛疊程度均隨海拔升高呈現先升后降的趨勢，與本研究結論基本一致。

本研究中，高海拔下的植物細胞線粒體和葉綠體逐漸靠近，分布間距變小，甚至出現線粒體嵌入葉綠體內部的現象。這種“零接觸”現象作為植物適應高海拔條件的特殊生存方式，是為了縮短兩者之間代謝物質、能量和氣體的運輸和交換距離，提高植物物質與能量利用的有效性[24]。

3.3 海拔高度對煙葉代謝物的影響

差異代謝物分析結果表明，除α-D-葡萄糖、D-來蘇糖以外，多數糖類物質以及山奈酚、蕓香苷、莨菪亭等多酚類香氣物質的相對含量隨著海拔升高呈顯著上升趨勢；而多數氨基酸類化合物的相對含量隨著海拔的升高呈顯著下降趨勢。結合代謝網絡分析與KEGG 富集途徑分析發現，多數糖類代謝通路、氨基酸的生物合成代謝通路的表達及其相關代謝物相對含量的變化均呈先升后降趨勢，如D-脯氨酸、丙氨酸參與的丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝途徑，莽草酸、奎尼酸參與的莽草酸代謝途徑（苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成）以及D-半乳糖酸、D-甘露糖、D-阿洛糖、D-塔格糖參與的相關糖類代謝途徑，這些差異代謝物的含量及其所在的代謝通路表達趨勢在海拔1 800～2 000 m 升高的原因可能是，在適宜的海拔高度會促進煙草的生長發育，使烤煙煙葉內含物增多，化學成分更加協調，而在海拔2 000～2 200 m，因海拔高度過高，氣溫較低，光照過強，煙株部分生理代謝功能受到抑制，此時，煙株體內會產生一系列的變化來應對外界環境脅迫，如產生嘌呤類物質以緩解輻射脅迫，增加糖類物質以及部分氨基酸的積累以緩解冷脅迫[25]。

蔗糖可被水解為葡萄糖和果糖，為植物生理代謝功能運轉提供能量，其含量增加是植物在逆境中生長發育的基礎。在植物應對強輻射脅迫的過程中，核苷類物質扮演著重要角色，過強的紫外線照射可使DNA 分子中同一條鏈兩相鄰的胸腺嘧啶堿基之間形成二聚體，影響DNA 的雙螺旋結構，使其復制和轉錄功能均受到阻礙，故胸苷、二氫胸腺素的相對含量因海拔過高而下降；而腺嘌呤是維持生物體代謝功能的必要成分，鳥苷的重要組成部分之一鳥嘌呤則對紫外線有強烈的吸收性，故兩者含量隨著海拔高度升高而升高。

植物遭受冷脅迫時，苯丙氨酸不但是多酚類物質生成的重要前體物，在寒冷條件下還可激活植物體內活性氧清除系統來提高植物自身的耐寒性[26]。隨著海拔高度的改變，多數氨基酸相對含量在2 200 m 處下調，而L-苯丙氨酸相對含量在代謝網絡圖中海拔2 200 m 處較高，可能與植物抵御冷脅迫的機制有關。而苯丙氨酸經過苯丙烷途徑的降解，其轉化生成的多酚類物質也隨海拔升高而升高。多酚類物質對植物生長和植物防御機制至關重要，同時也是煙草中重要的香味物質，很大程度上影響著烤煙的香吃味。大量研究表明，酚類物質往往具有抗氧化能力，多酚的積累可以保護細胞免受低溫應激產生自由基所引起的氧化損傷[27-28]，SUN等[16]研究表明，煙葉中多酚含量主要受溫度和陽光照射的影響，與溫度呈負相關。本試驗發現，奎尼酸、綠原酸、莨菪亭、山奈酚、蕓香苷（蘆丁）等多酚類物質相對含量隨海拔升高而升高，該結論與此前報道[29-30]基本一致。

綜上，根據烤煙質量評價結果以及代謝組學鑒定結果綜合考量發現，隨海拔升高，涼山會東煙區煙株品質整體呈現先升后降的趨勢，以海拔2 000 m處的烤煙品質最好，海拔升高至2 200 m 處烤煙品質較差；隨海拔升高，煙葉細胞內液泡體積增大，線粒體數目增多，葉綠體內淀粉粒數目增多，體積增大，但葉綠體片層數和垛疊程度減少，線粒體與葉綠體間開始出現“零接觸”現象；氨基酸代謝、糖類代謝、莽草酸代謝途徑發生顯著變化，在響應海拔高度變化的過程中起著關鍵作用。