基于基因表達綜合數據庫和網絡藥理學探討香參丸治療潰瘍性結腸炎的分子機制

繆濤聲，李逸婷，鄭鴻銘，胡芝凡，莫喬蘭，邱澤鑫，陳斌

作者單位：1廣州中醫藥大學第一臨床醫學院，廣東 廣州 510006；

2廣州中醫藥大學第一附屬醫院脾胃科，廣東 廣州510405

潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）是炎癥性腸病（inflammatory bowel disease，IBD）一種常見的慢性、非特異性結、直腸炎性疾病［1］，臨床表現主要有腹痛、腹瀉、黏液膿血便等，如今UC 因其發病率的不斷上升已成為全球公共衛生問題［2］。UC 目前的治療藥物主要有5-氨基水楊酸、生物制劑及激素等，但仍具有藥物依賴性、病人經濟負擔較大等問題［3］，因此迫切需要為UC 病人開發新型有效、副作用較低且經濟實惠的治療方法。

中醫藥是我國重要的醫學資源寶庫，具有經濟負擔與副作用較低、療效較好、病人依從性較高等優勢。香參丸出自《奇方類編》，由木香、苦參以及甘草組成，具有清熱燥濕、行氣止痛的功效，常用于治療痢疾。最新研究表明香參丸可用于治療UC［4-5］，但目前關于香參丸治療UC 的臨床研究相對較少，且相應作用機制尚未明確，本研究自2023年1—5 月通過生物信息學和網絡藥理學探討香參丸治療UC 的分子機制，以期為香參丸的臨床應用提供依據，并為其作用機制的進一步研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料基因表達綜合（GEO）數據庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/），中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP，https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php），蛋白質數據庫UniProt（https：//www.uniprot.org/），STRING 數據庫（https：//cn.string-db.org/），Metascape 數據庫（https：//metascape.org/），Cytoscape3.7.2軟件，GraphPad Prism 9.0 軟件，R 語言4.0.1 軟件，Autodock4.0 軟件，PyMOL2.5軟件。

1.2 方法

1.2.1GEO 數據庫潰瘍性結腸炎差異表達基因篩選 從GEO 數據庫中搜索“ Ulcerative colitis”，篩選并下載GSE38713芯片，其平臺為GPL570，該芯片有43 個樣本，其中包括13 例健康受試者與15 例活動期潰瘍性結腸炎病人。以log|FC|≥1，校正P＜0.05 為條件進行差異基因表達分析。

1.2.2加權共表達分析 將GEO 數據庫獲取的差異基因數據導入R 語言進行加權共表達分析，構建無標度共表達網絡。利用R 語言WGCNA 包goodSamplesGenes 方法去除離群的基因和樣本，使用冪函數a_mn=|C_mn|^β（a_mn：基因與基因的鄰間矩陣；C_mn：所有基因對的皮爾遜相關性獲得的相似性矩陣；β：軟閾值）構建加權鄰接矩陣，并轉換為拓撲重疊矩陣（TOM）及其相關的相似度（1-tom），以最小基因組數30 和敏感度3 為條件構建1-tom 矩陣的層次聚類樹。在與潰瘍性結腸炎高度相關的模塊中根據|MM|＞0.8 篩選獲得潰瘍性結腸炎的HUB基因。

1.2.3香參丸化學成分的篩選及其靶點的預測利用TCMSP 數據庫，以“木香”“苦參”以及“甘草”分別作為關鍵詞對香參丸的主要化學成分及其相關作用靶點進行搜索。香參丸的主要化學成分的篩選條件為口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和類藥性（drug likeness，DL）≥0.18。將篩選得到的化學成分在TCMSP 數據庫查詢相關靶點信息，并通過UniProt 數據庫將相關靶點信息轉化為基因靶點信息，最終得到243個基因靶點信息。

1.2.4預測香參丸治療UC 的作用靶點 將香參丸UniProt 的基因靶點信息與UC 相關的HUB 基因信息取交集，篩選出可能共同作用的基因靶點信息并繪制韋恩圖，最終得到37個共同作用靶點。

1.2.5PPI 網絡模型的構建與分析 將香參丸與UC 的共同靶點信息導入STRING 數據庫，蛋白種屬設置為“ Homo Sapiens”，得到蛋白質相互作用網絡（protein proteinInteractio，PPI）數據，將數據導入Cytoscape3.7.2 軟件進行進一步可視化處理，得到PPI網絡模型。同時利用Cytoscape 3.7.2 軟件工具中的Network Analyzer 進行拓撲分析，得到香參丸與UC交集靶點的度值。

1.2.6KEGG 與GO 通路富集分析 利用Metascape對香參丸與UC 的共同基因靶點做KEGG 與GO 通路富集分析，蛋白種屬設置為“ Homo Sapiens”，其中GO 通路包括生物學過程（biological process，BP），細胞組分（cellular component，CC），分子功能（molecular function，MF）。將獲得的數據進行進一步可視化處理得到功能富集氣泡圖。

1.2.7“中藥-成分-疾病-靶點-通路”網絡模型的構建與分析 將香參丸的主要成分、香參丸與UC的交集靶點信息、Metascape 數據庫獲得的KEGG 富集通路信息導入Cytoscape3.7.2，構建“中藥-成分-疾病-靶點-通路”網絡模型。

1.2.8分子對接 根據“中藥-成分-疾病-靶點-通路”網絡及PPI網絡模型篩選關鍵藥物成分及靶點，利用Chem3D MM2 進行能量最小化結構優化，利用PyMOL 軟件移除水分子、無機鹽、配體等，通過Autodock軟件對篩選出的核心藥物成分及核心靶點進行半柔性分子對接預測，利用PyMOL 對對接結果進行可視化處理，并通過R 語言pheatmap 包繪制結合能熱圖。

2 結果

2.1 潰瘍性結腸炎差異表達基因篩選從GEO 數據庫下載GSE38713 芯片數據和GPL570 平臺數據，借助R語言對數據進行整理分析。最終獲得潰瘍性結腸炎差異表達基因共8 020 個，其中UC 病人結腸黏膜組織中上調基因3 953 個，下調基因4 067 個，根據UC 差異表達基因篩選結果繪制火山圖與熱圖（圖1）。圖1A 中每個點代表一個基因，其中紅色代表UC 中上調的基因，綠色代表UC 中表達下調的基因。圖1B 中橫坐標為樣本信息，縱坐標為基因名，每一個色塊代表基因在該樣本的表達量。

圖1 潰瘍性結腸炎差異表達基因：A為潰瘍性結腸炎病人結腸黏膜與正常結腸黏膜差異基因火山圖；B為結腸黏膜與正常結腸黏膜差異基因熱圖

2.2 潰瘍性結腸炎差異表達基因加權共表達分析利用函數pick Soft Threshold選擇軟閾值構建無標度網絡（圖2），圖2 中A 和B 的橫坐標為軟閾值，縱坐標分別為相關系數和基因連接數的均值，如圖2 所示β=14 時相關系數為0.85，基因連接數均值為38.13，因此選擇β=14 構建無標度網絡。模塊特征向量分析中共篩選得到4個加權基因模塊（圖3），圖3 的B 中橫坐標代表分組情況，其中藍色為正常結腸黏膜，紅色代表UC 病人的結腸黏膜，縱坐標代表聚類的模塊，圖中左上角的三角色塊代表相關性，右下角三角色塊代表顯著性，其中青色模塊和粉色模塊在UC 與正常組的結腸黏膜之間相關性高，所以選取青色模塊中的796 個基因和粉色模塊中的954 個基因共1 750 個基因用于后續香參丸治療UC的靶點分析。圖3 的C 為青色模塊基因與UC 相關性的散點圖，可見基因集中于y=x 上，位于圖片中央，與UC高度相關。

圖2 潰瘍性結腸炎差異表達基因篩選的散點圖：A為軟閾值與標度獨立性散點圖；B為軟閾值與標度連通性散點圖

圖3 潰瘍性結腸炎差異表達基因加權共表達分析：A為加權共表達分析基因聚類樹；B為聚類模塊與潰瘍性結腸炎（UC）相關性熱圖；C 為cyan青色模塊基因與UC相關性散點圖

2.3 香參丸主要化學成分的篩選與其靶點的預測以OB≥30%，DL≥0.18 為篩選條件利用TCMSP數據庫分別檢索“木香”“苦參”以及“甘草”獲取有效成分，共得到木香主要有效成分6個，苦參主要有效成分45 個，甘草主要有效成分92 個，經去除重復項后共得到香參丸主要有效成分136 個。利用TCMSP 數據庫檢索其主要成分相關作用靶點，經去除重復項、UniProt 數據庫轉化并以“ Reviewed”“ Human”為條件篩選后得到香參丸主要作用靶點243個。

2.4 香參丸與UC 共同作用靶點的獲取將UC 的1 750 個靶點與香參丸的243 個活性成分靶點信息繪制成韋恩圖（圖4），其中左側圓圈代表香參丸的活性成分靶點，右側圓圈為UC 的相關靶點，交集部分為香參丸與UC的共同靶點共37個。

圖4 香參丸與UC的共同靶點韋恩圖

2.5 PPI網絡構建將香參丸與UC 的37個共同靶點導入STRING 數據庫，物種選擇“ Homo Sapiens”，分析得到PPI 網絡數據，將數據導入Cytoscape3.7.2軟件進行可視化（圖5）。該PPI 網絡節點的顏色越深、越靠近中心，大小越大代表其度值越高且同一圓圈上的靶點的度值從大到小以逆時針為順序進行排列。每條邊則是代表PPI 網絡的關系，線條越多關聯度越大。

圖5 香參丸與潰瘍性結腸炎共同靶點PPI網絡圖

2.6 KEGG 與GO 通路富集分析使用Metascape網站對37 個香參丸與UC 的共同靶點進行KEGG 與GO 通路富集分析。KEGG 富集分析共富集至49 條通路，其中主要的通路包括糖尿病并發癥中的AGERAGE 信號通路（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）、松弛素信號通路（Relaxin signaling pathway）、TNF 信號通路（TNF signaling pathway）、Toll 樣受體信號通路（Toll-like receptor signaling pathway）、HIF-1 信號通路（HIF-1 signaling pathway）以及MAPK 信號通路（MAPK signaling pathway）等（圖6）。GO 通路分析包括MF、BP、CC 分析，所有的富集分析按P值大小從小到大進行排序。結果顯示GO 富集分析BP共有440條、CC共有28條、MF共有30條，涉及的生物學過程主要有細胞運動的正調節（positive regulation of cell motility）、對損傷反應的調節（regulation of response to wounding）、血管生成調節（regulation of angiogenesis）等。分子功能夠涉及絲氨酸型內肽酶活性（serine-type endopeptidase activity）、生長因子的結合（growth factor binding）、核受體結合（nuclear receptor binding）、泛素樣蛋白連接酶結合（ubiquitin-like protein ligase binding）等。細胞組分涉及細胞外基質（extracellular matrix）、細胞質的核周區域（serine-type peptidase complex）、內質網腔（endoplasmic reticulum lumen）等（圖7）。

圖6 香參丸與潰瘍性結腸炎共同靶點KEGG富集氣泡圖

圖7 香參丸與潰瘍性結腸炎共同靶點GO富集分析：A為 GO BP分析；B 為GO CC分析；C 為GO MF分析

2.7 “中藥-成分-疾病-靶點-通路”網絡將香參丸所含的中藥、37 個共同作用靶點、含有共同靶點的共90 個成分、KEGG 富集通路導入Cytoscape 3.7.2，構建“中藥-成分-疾病-靶點-通路”網絡（圖8）。其中橙色方塊形節點代表香參丸所含的中藥，紅色菱形節點代表各中藥含有的成分，黃色菱形節點代表中藥間含有的相同成分，位于網絡左側的三個黃色菱形節點為甘草和苦參的共同成分，位于網絡右側黃色菱形節點為甘草和木香的共同成分。藍色橢圓形節點為香參丸與UC 的共同作用靶點。綠色三角形節點為KEGG 富集的主要通路。通過Cytoscape 對網絡中的中藥成分及靶點進行分析得到對應度值，網絡度值＞4 的中藥成分度值排名見表1，主要靶點度值排名見圖9。

表1 香參丸治療UC的主要成分

圖8 “中藥-成分-疾病-靶點-通路”網絡圖

圖9 “中藥-成分-疾病-靶點-通路”網絡靶點度值排序圖

2.8 分子對接利用PubChem 及蛋白質結構數據庫（protein data bank，PDB）獲取小分子配體及蛋白質受體結構文件，利用Chem3D MM2 進行能量最小化結構優化，利用PyMOL 軟件移除水分子、配體、無機鹽等，通過Cytoscape 對“中藥-成分-疾病-靶點-通路”網絡進行分析，根據度值大小排序篩選出度值排名前十的化合物和靶點并利用Autodock 進行半柔性對接（具體排序可見表1及圖9），后通過火山圖對對接結果進行可視化處理，如圖10 所示，橫坐標代表靶點，縱坐標為化合物，熱圖中的數字為對接結合能，平均結合能為-5.598 6 kCal/mol，結果顯示對接良好。結合能排名前四的對接為MMP2和甘草查爾酮B（Licochalcone B，結能為-7.00 kCal/mol）、PDE3A 和豆甾醇（Stigmasterol，結合能為-6.97 kCal/mol）、MMP2 和刺果甘草查耳酮（glypallichalcone，結合能為-6.92 kCal/mol）、ICAM1 和甘草查爾酮B（Licochalcone B，結合能為-6.66 kCal/mol），結果展示見圖11。篩選的核心靶點NOS2、PPARG、PDE3A、IL1B、MMP2、ICAM1、TGFB1、ERBB2、MMP9、STAT1 分別對應的PDB 數據庫X 衍射晶體結構ID 為5XN3、8B8Y、7LRE、7Z3W、8H78、3E2M、1KLC、3BCZ、5OM6以及8D3F。

圖10 分子對接結合能熱圖

圖11 分子對接圖：A為MMP2和Licochalcone B；B為PDE3A和Stigmasterol；C為MMP2和Glypallichalcone；D為ICAM1和Licochalcone B

3 討論

通過分析香參丸治療UC 的“中藥-成分-疾病-靶點-通路”網絡，推測槲皮素（quercetin）、刺芒柄花素（formononetin）、木犀草素（luteolin）以及山柰酚（kaempferol）等成分可能是香參丸治療UC的主要成分。槲皮素為黃酮醇類化合物，具有抗氧化、抗腫瘤等藥理作用［6］，而氧化應激是UC發生的重要機制之一［7］，減輕腸道炎癥以及氧化應激反應則是治療UC 的重要手段，因此槲皮素已被列為治療UC 的重要候選化合物之一［8］。Riemschneider 等［9］通過用槲皮素治療由葡聚糖硫酸鈉誘導的UC 小鼠發現槲皮素可以顯著改善UC 小鼠的癥狀以及結腸的組織病理學評分，經槲皮素治療后小鼠的結腸黏膜上皮炎癥細胞的浸潤減少且腸上皮屏障可以得到一定程度的恢復。另一項研究表明槲皮素可下調LCN-2、TNF-α抑制炎癥介質的表達，從而減輕腸道炎癥，發揮治療UC 的作用［10］。刺芒柄花素是一種異黃酮類化合物，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、促進細胞凋亡的作用［11-12］。Wu 等［13］通過研究證實刺芒柄花素可通過抑制NLRP3 炎性小體通路（NLRP3、ASC、IL-1β等）蛋白水平，并上調緊密連接蛋白（ZO-1、claudin-1等）治療經DSS 誘導的急性結腸炎。楊倩等［14］給予UC 小鼠刺芒柄花素后，結腸的TNF-α、IL-6 以及COX-2 的含量都出現明顯下降，并通過基因敲除等技術推測刺芒柄花素可能通過激活Nrf2 的表達來改善UC 的癥狀。木犀草素和山柰酚與槲皮素一樣也是黃酮類化合物，李越、沈磊［15］發現木犀草素可以顯著降低UC 小鼠疾病活動指數評分（DAI），其機制可能與激活Nrf2信號通路、抑制促炎因子TNF-α、IL-6 mRNA 等表達有關 。Andrade 等［16］證實山柰酚和槲皮素可下調NF-κB 與Toll 樣受體的表達，使促炎、趨化因子及細胞黏附分子減少，改善腸道損傷、減少腸道的氧化應激反應和炎癥細胞的浸潤。

結合PPI 網絡和“中藥-成分-疾病-靶點-通路”網絡，推測NOS2、PPARG、IL1B、MMP2 以及ICAM1等是香參丸治療UC 的靶點。有研究表明NOS2 編碼的誘導型一氧化氮合酶（iNOS）在UC 病人的結腸黏膜上被顯著上調［17］，研究表明iNOS 在炎癥性疾病中發揮著重要作用，其機制可能與超氧陰離子相互作用生成過氧亞硝酸鹽破壞腸上皮有關［18-19］。Bernstein 等［20］則證實抑制NOS2 可以減輕腸道炎癥，所以NOS2 可能是治療UC 的重要靶點。PPARG為過氧化物酶體增生激活受體，可以激活結腸上皮細胞的線粒體增加耗氧量，使結腸黏膜上皮缺氧壞死并破壞腸道菌群穩態［21-22］，Stephanie 等［23］研究表明5-氨基水楊酸可能通過激活腸上皮中的PPAR-γ發揮治療UC 的作用，其機制可能與PPARG 抑制NF-κB 活化［24］和腸黏膜中前列腺素的產生［25］有關。IL1B 即為IL-1β，為促炎細胞因子之一，已有許多研究表明其存在與腸道炎癥關系密切［26-27］。Rawat等［28］證實IL1B 可以上調MIR200C-3p 從而增加腸黏膜的緊密連接降低腸細胞occludin 蛋白的表達，從而增加緊密連接的通透性。

KEGG 富集分析中主要富集在TNF 信號通路、Toll 樣受體信號通路、HIF-1 信號通路以及MAPK 信號通路等。TNF 稱為腫瘤壞死因子，是參與NF-κB通路的重要轉錄調節因子，而NF-κB 信號通路已被證實是參與UC 發生發展的重要通路之一［29-30］。有研究表明NF-κB 信號通路可在UC 的腸固有層中的單核細胞中被激活，參與UC炎癥的產生［31］，目前UC的主要治療藥物柳氮磺胺吡啶和糖皮質激素的作用機制之一就是抑制NF-κB 信號通路的表達［32］。“中藥-成分-疾病-靶點-通路”網絡分析得到的關鍵成分如槲皮素、山柰酚、刺芒柄花素等都能通過調節核因子NF-κB 的表達來抑制腸道炎癥反應減少腸道損傷［14，16］。關鍵靶點PPARG 也被證實可以抑制NF-κB 活化［24］，且NF-κB 信號通路的激活則會通過LPS/IFN-γ 或IL-1β/IFN-γ 誘導關鍵靶點iNOS 的表達［33］，所以富集得到的TNF 信號通路與篩選出的關鍵成分、關鍵靶點相吻合。Toll 樣受體（toll-like receptor，TLR）是一種跨模信號轉運蛋白，參與人體免疫、炎癥反應。有研究表明TLR 可以與相應的配體結合，激活TLR-NF-κB 信號通路，介導IFN-γ、TNF、IL-1β 等因子的釋放［34］，目前研究認為TLR4/NF-κB 信號通路是UC 發生發展的重要信號通路之一，且如山柰酚等香參丸的關鍵成分也可作用于TLR4/NF-κB信號通路發揮對結腸的保護作用［35］，所以Toll 樣受體信號通路可能是香參丸作用于UC 的潛在通路。缺氧誘導因子HF-1 在缺氧狀態下可被誘導產生，活化后可形成HF-1α 介導炎癥、氧化應激等反應。蘇淑伶等［36］表明HIF-1α、COX-2 等因子水平與UC 病情嚴重程度呈正相關，可為臨床診斷及臨床治療評估提供可靠依據。Tang 等［37］則研究證實HF-1α 可激活NF-κB 信號通路，從而介導NLRP3炎癥小體產生，引起一系列級聯炎癥反應，所以HIF-1 信號通路與TNF 信號通路息息相關。如今，MAPK 信號通路在IBD 中的作用已被許多研究所證實，成為研究治療IBD 的經典通路之一［38-39］。在UC中MAPK 信號通路可以調控下游的能調控下游的NF-κB 信號通路，介導TNF-α、IL-6、IL-1等炎癥因子的釋放、嗜中性粒細胞活化和細胞凋亡，誘導細胞內NO的表達，提高細胞內INOS活性［40-41］。

綜上所述，香參丸主要成分槲皮素、刺芒柄花素、木犀草素以及山柰酚等可能通過TNF 信號通路、Toll 樣受體信號通路、HIF-1 信號通路以及MAPK 信號通路作用于NOS2、PPARG、IL1B、MMP2以及ICAM1等靶點發揮治療UC的作用。