加巴噴丁減輕骨折模型大鼠焦慮情緒及海馬神經炎癥的作用機制研究

徐禮玲，付恒，曾思

作者單位：1自貢市精神衛生中心，四川 自貢 643020；

2四川省醫學科學院，四川 成都610000

骨折屬于臨床常見骨科疾病，各年齡階段均有較高發生率，尤其是兒童及老年人［1］。骨折后易合并感染、神經血管損傷等并發癥，還可能誘發焦慮抑郁疾病等心理疾病，對病人生活質量產生極大影響［2-3］。外科手術屬于疾病治療首選方案。圍手術期病人普遍存在骨折疼痛、手術應激反應，誘發焦慮情緒風險較高，因此臨床認為有必要加強骨折疾病病人管理［4-5］。加巴噴丁成分為加巴噴丁和普瑞巴林，最早主要用于抗癲癇輔助治療［6］。近年來逐漸應用于各類疼痛相關治療，諸多研究證實加巴噴丁對骨折疼痛［7-9］、疼痛誘發的焦慮有著重要價值。Huo 等［10］研究中報道，骨折將增加小鼠中風損傷及中風后記憶功能障礙，其影響機制與 α-7 煙堿型乙酰膽堿受體 （α-7 nAchR） 誘發神經炎癥，導致神經元受損有著密切關聯性。海馬區作為大腦中具有豐富神經連接環路區域，具有記憶、信息儲存等功能，同時還參與了情感、認知活動調控機制，其神經炎癥與手術應激反應、焦慮情緒發病有著密切關聯性［11-13］。目前臨床對加巴噴丁治療骨折所致的焦慮情緒及海馬神經炎癥的影響機制未見相關報道，仍有待進一步研究及論證。基于此，本研究自2022年1—6 月將加巴噴丁對骨折模型大鼠焦慮情緒及海馬神經炎癥的影響進行分析，旨在通過動物實驗研究作用機制，為后續臨床試驗研究提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物選擇健康雄性無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級SD 大鼠48 只，雌雄各半，體質量范圍為200～300 g，3 月齡，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供［SCXK（滬）2019-0033］。大鼠培養環境：溫度22～25 ℃，濕度49%～51%，12 h 光亮/12 h 黑暗交替培養，自由飲水攝食。所有動物均分籠適應性喂養5 d（每4 只為1 籠），方可用于實驗。本研究中對于大鼠的處理符合動物倫理學相關標準。

1.2 主要試劑及儀器加巴噴丁來自于海南賽立克藥業有限公司，戊巴比妥鈉來自于上海市欣誠化工有限公司，大鼠白細胞介素-4（interleukin-4，IL-4）、白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）酶聯免疫吸附（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）測定試劑盒來自于上海臻科生物科技有限公司，谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）比色法試劑盒來自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，超氧化物歧化酶（SOD）ELISA試劑盒來自上海信裕生物工程有限公司，丙二醛（malondialdehyde，MDA）ELISA 試劑盒來自上海滬震生物科技有限公司。蘇木素伊紅（hematoxylin eosin，HE）染色液來自于錸博（上海）生化科技有限公司，BCA 試劑盒來自于上海炎熙生物科技有限公司，Tris-HCl 緩沖鹽溶液來自于北京匯智和源生物技術有限公司，兔抗鼠二抗稀釋液來自于上海優寧維生物科技股份有限公司。大鼠高架十字迷宮（型號PM-200）來自于成都泰盟軟件有限公司，酶標儀（MK3 型）來自于美國Thermo 公司，光學顯微鏡（Primo Vert 型）來自于德國Leica 公司，凝膠成像分析儀（ChemiDoc XRS+型）來自于美國 Bio-Rad公司。

1.3 分組采用隨機數字表法將48 只大鼠分為假手術組、模型組、治療組，各16只。假手術組正常飼養，未做任何處理，其余兩組大鼠均進行骨折造模。治療組給予加巴噴丁干預，將1 mg/kg 加巴噴丁與0.9%氯化鈉注射液配置為水溶液100 mg/kg，并給予腹腔注射。模型組給予生理鹽水干預，腹部注射等量0.9%氯化鈉注射液代替。兩組均連續給藥12 d。

1.4 骨折動物模型準備操作方法［14］：采用40 mg/kg 的1%戊巴比妥鈉實施腹腔麻醉，確定右下肢髕骨內緣做一1 cm 的縱行切口，并對其股四頭肌腱性組織部分進行縱行分離；緩慢屈曲膝關節，并對髕骨進行外側脫位牽拉，充分暴露股骨髁間凹；確定股骨髁間凹處采用手鉆逆行髓腔鉆入直徑1.0 mm克氏針，當遇到股骨大轉子阻力時可往回抽，并進行切斷操作，將斷段埋于膝關節軟骨表面下，并對其切口進行逐層閉合。將大鼠調整為仰臥體位，保持右下肢外展內旋，并將其固定于造模支架的鐵砧間距15 mm的調節砧上。將造模支架中柱下端的骨刀放置并壓在大腿中部，由實驗助手提起500 g的砝碼調整到20 cm 處，并讓其沿導桿保持自由落體撞擊到鋼板，導致大鼠發生股骨中段骨折。并基于X線輔助下完成對骨折動物模型的檢查。

1.5 觀察指標

1.5.1焦慮情緒 高架十字迷宮實驗：高架十字迷宮區域包括2 個開放臂（50 cm×10 cm）、2 個閉合臂（50 cm×10 cm×40 cm）、中央區（10 cm×10 cm），迷宮距離地面50 cm。測試前將大鼠放入實驗環境中適應30 s再進行正式實驗。正式實驗中將大鼠放置于開放臂、閉合臂交界處，且大鼠頭部面向開放臂；實驗人員遠離迷宮并進行同步攝像，設置觀察時間為5 min。采用軟件分析大鼠總穿臂次數（TE）、進入比例（OE）、停留時間比例（OT）。采用軟件分析大鼠中央區運動距離、進入次數、停留時間及總運動距離。每只動物完成實驗后均需要采用10%乙醇對方箱內壁及底面進行清洗，以消除上只動物殘留的氣味、大小便等信息。進入開放臂次數越少，停留時間越短表明動物焦慮情緒越嚴重。

1.5.2海馬神經炎癥、氧化應激因子 實驗結束后，對每組大鼠進行斷頭取海馬組織操作，并在冰上進行海馬組織（選擇自枕骨大孔沿矢狀縫撬開顱骨，采用玻璃分針撥開大腦皮層，充分暴露海馬區域）剝離與稱重，并將其分為3 份，分別用于炎癥因子檢測、蘇木素染色、蛋白質印跡法。

（1）炎癥因子IL-4、IL-6、IL-1β 及SOD、MDA、GSH-Px的檢測：加入生理鹽水制備10%大鼠海馬組織勻漿液，進行10 min 離心操作（12 000 r/min）后獲取上層清液，采用對應ELISA 試劑盒檢測海馬勻漿液中的炎癥因子（IL-4、IL-6、IL-1β）、SOD、MDA 水平，采用比色法檢測GSH-Px，具體操作按照對應試劑盒說明書進行操作，包括稀釋、加樣、溫育、洗滌、加酶、顯色、終止反應。并將酶標儀調零后，確定450 nm 波長參數，并檢測海馬組織中IL-4、IL-6、IL-1β、GSH-Px、SOD 的OD 值，并通過標準曲線計算樣品中對應因子的濃度。

（2）海馬區HE 染色：將大鼠腦組織進行常規脫水、包埋、冰凍切片操作。加入HE 染色，20 min 二甲苯透明，并采用中性樹脂封片。選擇海馬區域5個視野（400 倍），于光學顯微鏡下觀察其形態學變化。

（3）蛋白質印跡法：取出海馬組織進行碾磨、裂解、提取蛋白操作。用含有蛋白質酶抑制劑的裂解液制備海馬組織蛋白質提取物，應用BCA 法檢測蛋白濃度。加入10% 十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）完分離蛋白質，并轉移到硝酸纖維素膜上，并將膜在5%脫脂乳中封閉 1 h。采用去離子水稀釋Tris-HCl 緩沖鹽溶液一抗（1∶1 000），保持 4 ℃孵育過夜；TBS 漂洗3 次，每次3 min，再加入兔抗鼠二抗稀釋液（1∶8 000），保持37 ℃恒溫箱內避光孵育2 h，進行3 次同樣的漂洗，應用電化學發光（electrochemiluminescence，ECL）顯影液顯色，并采用凝膠成像系統完成膠片曝光和成像操作，采用軟件測量相應蛋白條帶灰度值［腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor，TNF-α）、人核因子κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）］。

1.6 統計學方法使用SPSS 23.0 軟件進行數據分析，計量資料以±s表示，計量資料采用單因素方差分析，多組之間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 三組大鼠焦慮情緒比較假手術組大鼠TE、

OE、OT均高于治療組、模型組大鼠，治療組大鼠TE、OE、OT均高于模型組（P＜0.05）。見表1。

表1 三組大鼠焦慮情緒比較/± s

表1 三組大鼠焦慮情緒比較/± s

注：TE為總穿臂次數，OE為進入比例，OT為停留時間比例。①與假手術組比較，P＜0.05。②與模型組比較，P＜0.05。

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2.2 三組大鼠海馬神經炎癥因子的比較假手術組大鼠IL-4、IL-6、IL-1β 均低于治療組、模型組大鼠，治療組大鼠IL-4、IL-6、IL-1β 均低于模型組（P＜0.05）。見表2。

表2 三組大鼠海馬神經炎癥因子比較/（ng/L，± s）

表2 三組大鼠海馬神經炎癥因子比較/（ng/L，± s）

注：IL為白細胞介素。①與假手術組比較，P＜0.05。②與模型組比較，P＜0.05。

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2.3 三組大鼠海馬神經氧化應激因子比較假手術組大鼠GSH-Px、SOD 均高于治療組、模型組大鼠，MDA 低于兩組；且治療組大鼠GSH-Px、SOD 均低高于模型組，MDA低于該組（P＜0.05）。見表3。

表3 三組大鼠海馬神經氧化應激因子比較/± s

表3 三組大鼠海馬神經氧化應激因子比較/± s

注：GSH-Px 為谷胱甘肽過氧化物酶，SOD 為超氧化物歧化酶，MDA為丙二醛。①與假手術組比較，P＜0.05。②與模型組比較，P＜0.05。

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2.4 大鼠海馬組織病理形態分析假手術組大鼠（圖1A）海馬神經元呈現排列規則、分布均勻特征，且胞體無空泡癥狀。模型組大鼠（圖1B）表現出部分海馬區域神經元散亂特征，可見點狀軟化灶，且胞體表現出空泡現象，神經細胞存在崩解、碎裂、深染等明顯凋亡特征。治療組大鼠（圖1C）神經元損傷現象出現好轉，其海馬區域神經元呈現排列相對規則、分布相對均勻特征，且變形壞死的細胞數量較模型組明顯較少，但仍存在部分細胞空泡化。

圖1 大鼠海馬組織神經元排列特征（ HE染色×200）：A為假手術組；B為模型組；C為治療組

2.5 三組大鼠海馬組織蛋白表達量比較假手術組大鼠NF-κB、TNF-α 蛋白表達均低于治療組、模型組大鼠，差異有統計學意義（P＜0.05）；而治療組大鼠NF-κB、TNF-α 蛋白表達均低于模型組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖2；表4。

圖2 各組大鼠海馬NF-κB、TNF-α蛋白表達電泳

表4 三組大鼠海馬組織蛋白表達量的比較/± s

表4 三組大鼠海馬組織蛋白表達量的比較/± s

注：TNF-α為腫瘤壞死因子α，NF-κB為核因子κB。①與假手術組比較，P＜0.05。②與模型組比較，P＜0.05。

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3 討論

很多研究顯示，骨折后疼痛、外科手術治療應激反應不僅會增加軀體痛苦感覺，還易誘發抑郁不良情緒［15-20］。因此有必要加強骨折導致的焦慮情緒病人臨床管理，干預致病病理機制，降低疾病風險。加巴噴丁屬于GABA結構類似物，既往研究證實，該藥物具有良好鎮痛效應，其藥理機制通過結合突觸前膜鈣通道GABA亞型，發揮抑制鈣離子內流功效，繼而阻斷神經細胞的病理傳導通路，減少興奮性遞質濃度，阻斷神經凋亡途徑及相關蛋白［21-22］。

近年來相關研究發現加巴噴丁有著確切海馬功能及神經保護作用。Swartzwelder 等［23］研究顯示，加巴噴丁可以通過拮抗血小板反應蛋白 （TSPs） 與α2δ-1 受體的相互作用，逆轉或改善青少年間歇性乙醇 （AIE）對海馬功能的影響。臧穎卓等［24］研究顯示，加巴噴丁可以通過抑制海馬神經元組織學改變，影響凋亡相關基因P75NTR 表達，發揮神經保護作用。本研究結果顯示，治療組大鼠TE、OE、OT 均高于模型組。說明骨折狀態下，大鼠出現焦慮情緒較高；而加巴噴丁應用可以改善焦慮癥狀。治療組大鼠神經元損傷現象出現好轉，其海馬區域神經元呈現排列相對規則、分布相對均勻特征，且變形壞死的細胞數量較模型組明顯較少，但仍存在部分細胞空泡化。說明加巴噴丁可以減輕海馬區神經元損傷及凋亡。其原因可能是病理狀態下，炎癥因子升高將影響血腦屏障通透性，增加氧自由基水平，繼而導致海馬神經元凋亡，促使其細胞加速死亡［25］。而加巴噴丁可以通過干預炎癥機制，保護神經元，修復海馬神經元形態，維持神經突觸可塑性。

治療組大鼠IL-4、IL-6、IL-1β、MDA 均低于模型組，GSH-Px、SOD 均高于模型組。治療組大鼠NFκB、TNF-α 蛋白表達均低于模型組。說明加巴噴丁可以改善海馬區神經炎癥狀態。NF-κB、TNF-α 炎癥因子可以激活神經病理狀態，對5-HT釋放及合成產生影響，繼而增加焦慮病情。該藥物可以改善骨折引起的焦慮狀態，其作用機制可能與下調海馬神經炎癥因子表達，減少NF-κB/TNF-α 信號通路含量，繼而改善海馬神經元認知功能障礙有關。

綜上所述，骨折導致大鼠焦慮情緒增加，而加巴噴丁可以有效削弱骨折大鼠的焦慮情緒，可能與加巴噴丁減弱海馬炎癥反應有關，從而增強NF-κB/TNF-α信號通路對海馬神經的保護作用。