蒼術素調節腺苷酸活化蛋白激酶/沉默信息調節因子1信號通路對白細胞介素-1β誘導軟骨細胞自噬和凋亡的影響

沈曉娟，程磊，劉琳

作者單位：上海中醫藥大學附屬龍華醫院藥學部，上海200032

骨關節炎（osteoarthritis，OA）是一種慢性退行性疾病，主要病理改變表現為軟骨退化、骨贅形成、滑膜炎癥，隨著年齡的增長，患病率呈升高趨勢，嚴重影響病人身心健康，OA 的發病機制尚不完全清楚，軟骨細胞凋亡在OA 的發展中發揮重要作用，抑制細胞凋亡是治療OA 的一個方向［1-2］。自噬又稱Ⅱ型程序性細胞死亡，研究顯示，自噬參與OA 的進展，增強自噬可以抑制軟骨細胞凋亡，延緩骨關節炎的進展［3］。腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）是一種能量傳感器，可激活Unc-51 樣自噬激活蛋白酶（Unc-51 like autophagy activating kinase 1，ULK1）正調控自噬，激活AMPK 增強自噬，抑制OA 軟骨細胞凋亡［4］。沉默信息調節因子1（silent message modulator 1，SIRT1）是一種煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+）依賴的去乙酰化酶，磷酸化的AMPK 可提高細胞內NAD+濃度，激活SIRT1 的表達，激活AMPK/SIRT1 信號通路，可抑制炎癥反應，改善OA 癥狀［5］。蒼術素（atractylodin，ATR）是從蒼術中提取有效物質，具有降糖、抗炎、抗氧化及抗腫瘤的作用［6］。研究顯示，蒼術素可抑制白細胞介素1β（interleukin 1β，IL-1β）誘導的軟骨細胞炎癥反應［7］，但其具體作用機制尚不清楚，本研究2022 年1—8 月通過觀察蒼術素對IL-1β 誘導的軟骨細胞自噬及對AMPK/SIRT1信號通路的影響，探索蒼術素對IL-1β 誘導的軟骨細胞凋亡與自噬可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞與試劑1 周齡SD 雄性乳鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，生產許可證號：SCXK（京）2021-0011。蒼術素（HPLC≥98%）購自四川成都/思克生物；重組大鼠IL-1β（GS4468）購自北京百奧萊博科技有限公司；AMPK 抑制劑compound C（純度99.91%）購自美國MCE 公司；Annexin VFITC/PI 凋亡試劑盒（CA1020）、噻唑藍（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）試劑盒（M1020）、單丹磺酰尸胺（montane sulfonyl cadaverine，MDC）試劑盒（G0170）、TUNEL 凋亡檢測試劑盒（綠色熒光）（T2130）購自北京索萊寶生物科技有限公司；LC3（AL221）、Beclin-1（AF5123）、Atg5（AF2269）、AMPK（AF1627）、p-AMPK（AF2677）、SIRT1（AF5300）抗體購自碧云天生物科技有限公司，ULK1（ab167139）、p-ULK1（ab203207）抗體購自美國Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1軟骨細胞的分離與鑒定 1 周齡SD 乳鼠麻醉后處死，根據參考文獻［8］，無菌條件下取軟骨組織，采用胰蛋白酶和Ⅱ型膠原酶兩步酶消化法提取軟骨細胞，原代細胞培養3 d 后，顯微鏡觀察細胞生長情況，采用甲苯胺藍染色與Ⅱ型膠原蛋白（collagen Ⅱ）免疫熒光染色進行鑒定，鑒定過的細胞傳代培養，選取第3代細胞進行后續實驗。

1.2.2蒼術素濃度的篩選 第3代軟骨細胞融合至80%左右時，按照4×104個接種于96 孔板中，使用不同濃度的蒼術素（0、5.0、10.0、20.0、40.0、80.0 μmol/L）處理軟骨細胞，同時加入10 μg/L 的IL-1β 共同處理24 h 后，另設正常培養的細胞為對照組，加入20 μL 的MTT 溶液，孵育4 h 后，加入DMSO 終止反應，檢測490 nm處的光密度值（OD值）。

1.2.3細胞培養及分組 將軟骨細胞隨機分成4組，分別為對照組、IL-1β 組、蒼術素組（蒼術素組）、蒼術素+AMPK 抑制劑組（蒼術素+compound C 組），其中IL-1β 組使用10 μg/L 的IL-1β［8］誘導24 h，建立細胞模型；蒼術素組使用20 μmol/L 的蒼術素與10 μg/L 的IL-1β 共同處理細胞24 h，蒼術素+compound C 組在建立細胞模型前，使用50 μmol/L 的compound C［9］預處理2h，再使用20 μmol/L 的蒼術素與10 μg/L 的IL-1β 共同處理細胞24 h，對照組用等量的PBS處理細胞。

1.2.4細胞凋亡檢測 將各組處理的軟骨細胞按照4×104個接種于96 孔板中，培養24 h 后，使用Annexin V-FITC/PI試劑盒檢測細胞凋亡。

另取各組處理的軟骨細胞按照1×104個細胞接種于無菌蓋玻片上，培養24 h 后，使用預冷的甲醇固定10 min，加入TUNEL 反應液，37 ℃，染色1 h，光顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.5MDC 染色觀察自噬小體 收集各組處理的軟骨細胞800 ×g離心5 min，使用Wash buffer 將細胞制成109個/升的細胞懸液，取90 μL細胞懸液加入10 μL的MDC 染色液，避光染色30 min，熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.6蛋白質印跡法檢測細胞中自噬及AMPK/SIRT1 通路相關蛋白表達 使用RIPA 裂解液從各組處理的細胞中提取總蛋白，取30 μg 蛋白SDSPAGE電泳、轉膜后封閉，LC3（1∶1 000）、Beclin-1（1∶1 000）、Atg5（1∶1 500）、p-AMPK（1∶1 000）、AMPK（1∶1 500）、SIRT1（1∶1 000）、ULK1（1∶1 500）、p-ULK1（1∶1 500）抗體，4 ℃孵育過夜，再加入酶標二抗（1∶1 000）室溫孵育2 h，ECL 試劑顯色，以β-actin為內參，利用Image J軟件分析蛋白相對表達。

1.3 統計學方法采用SPSS 25.0 軟件進行統計分析，計量資料符以±s表示，數據分布的正態性和方差齊性分別通過Kolmogorov-Smirnov 檢驗和Levene 檢驗進行分析（P＞0.05）；方差齊（P＞0.05）時，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗；方差不齊時，組間兩兩比較采用Games-Howell檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 軟骨細胞的分離與鑒定顯微鏡下觀察顯示，分離的原代大鼠軟骨細胞培養3 d 后，細胞呈橢圓形或梭形，細胞貼壁生長（圖1A），甲苯胺藍染色顯示，細胞核被染成深藍色，核仁呈藍紫色，細胞質褐紅色（圖1B），collagen Ⅱ免疫熒光染色顯示，細胞呈綠色（圖1C），經DAPI染色細胞核呈藍色，證明分離的細胞為軟骨細胞。

2.2 蒼術素對IL-1β誘導的軟骨細胞增殖活性的影響與對照組（1.22±0.11）比較，IL-1β 組軟骨細胞增殖活性（0.60±0.07）顯著降低（F=45.91，P＜0.001）；使用不同濃度蒼術素（5.0、10.0、20.0、40.0、80.0 μmol/L）預處理軟骨細胞后，細胞增殖活性增加（0.63±0.07、0.65±0.08、0.78±0.08、0.95±0.09、1.06±0.10），且蒼術素濃度在20 μmol/L 以上，可顯著促進細胞增殖，因此選擇蒼術素濃度20 μmol/L進行后續實驗。

2.3 蒼術素對IL-1β誘導的軟骨細胞凋亡的影響與對照組（2.54±0.82）%比較，IL-1β 組軟骨細胞凋亡率（28.46±3.55）%顯著升高（P＜0.05）；與IL-1β 組比較，蒼術素組軟骨細胞凋亡率（14.26±2.45）%顯著降低（P＜0.05）；與蒼術素組比較，蒼術素+compound C組軟骨細胞凋亡率（22.36±2.71）%顯著升高（P＜0.05）。

TUNEL 染色結果顯示，凋亡細胞為綠色，細胞核為藍色，與對照組比較，IL-1β 組細胞綠色熒光增多，與IL-1β 組比較，蒼術素組綠色熒光減少；與蒼術素組比較，蒼術素+compound C 組綠色熒光增多，見圖2。

圖2 TUNEL染色觀察蒼術素對IL-1β誘導的乳鼠軟骨細胞凋亡的影響（×1 000）

2.4 蒼術素對IL-1β誘導的軟骨細胞自噬的影響熒光顯微鏡下觀察顯示，MDC 染色自噬小體呈綠色，與對照組相比，IL-1β 組軟骨細胞綠色熒光強度減弱；與IL-1β 組相比，蒼術素組細胞綠色熒光強度顯著增強；與蒼術素組比較，蒼術素+compound C 組細胞綠色熒光強度減弱，見圖3。

圖3 乳鼠軟骨細胞自噬小體（MDC染色×400）：A為對照組；B為I L-1 β組；C為蒼術素組；D為蒼術素+C o m p o u n d 組

2.5 蒼術素對IL-1β誘導的軟骨細胞自噬相關蛋白的影響與對照組比較，IL-1β 組軟骨細胞LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1、Atg5 蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05）；與IL-1β 組相比，蒼術素組軟骨細胞LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1、Atg5 蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05）；與IL-1β+蒼術素組比較，蒼術素+compound C組軟骨細胞LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1、Atg5 蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05）。見圖4；表1。

表1 蒼術素對IL-1β誘導的軟骨細胞LC3、Beclin-1、Atg5表達的影響/± s

表1 蒼術素對IL-1β誘導的軟骨細胞LC3、Beclin-1、Atg5表達的影響/± s

注：LC3為微管相關蛋白輕鏈3，Atg5為自噬相關基因-5。①與對照組比較，P＜0.05。②與IL-1β 組比較，P＜0.05。③與蒼術素組比較，P＜0.05。

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圖4 各組軟骨細胞LC3、Atg5、Beclin-1蛋白表達情況

2.6 蒼術素對IL-1β誘導的軟骨細胞AMPK/SIRT1通路相關蛋白的影響與對照組相比，IL-1β組軟骨細胞中p-AMPK、SIRT1、p-ULK1 蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05）；與IL-1β 組相比，蒼術素組軟骨細胞中p-AMPK、SIRT1、p-ULK1 蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05）；與蒼術素組比較，蒼術素+compound C 組細胞p-AMPK、SIRT1、p-ULK1 蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05），各組之間AMPK、ULK1表達水平比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖5和表2。

表2 各組軟骨細胞SIRT1、p-ULK1/ULK1、p-AMPK/AMPK蛋白表達/± s

表2 各組軟骨細胞SIRT1、p-ULK1/ULK1、p-AMPK/AMPK蛋白表達/± s

注：AMPK 為腺苷酸活化蛋白激酶，SIRT1 為沉默信息調節因子1，ULK1為Unc-51樣自噬激活蛋白酶。①與對照組比較，P＜0.05。②與IL-1β 組比較，P＜0.05。③與蒼術素組比較，P＜0.05。

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圖5 各組軟骨細胞SIRT1、ULK1、p-ULK1、AMPK、p-AMPK蛋白表達情況

3 討論

IL-1β 是一種促炎細胞因子，可通過調節基質金屬蛋白酶與炎癥因子表達，誘導軟骨細胞凋亡，參與OA 進展，常作為誘導OA 細胞模型的因子［10］。本研究從乳鼠軟骨組織分離軟骨細胞，經甲苯胺藍染色和collagen Ⅱ免疫熒光染色證明成功分離軟骨細胞。使用IL-1β 處理軟骨細胞后，細胞增殖活性降低，凋亡率升高，表明OA 細胞模型建模成功。蒼術素為蒼術提取物，可以調控炎癥反應、氧化應激、腫瘤細胞增殖與遷移等，具有多種藥理學作用［11］。研究顯示，蒼術素抑制核苷酸結合結構域-（nucleotide binding domain，NOD-）樣受體蛋白3（like receptor protein 3，NLRP3）炎性體和toll 樣受體4（toll-like receptor 4，TLR4）激活，抑制炎癥反應，減輕脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導的急性肺損傷［12］。蒲博強等［13］發現，蒼術提取物可通過下調miR-378c 表達，抑制IL-1β 誘導的軟骨細胞凋亡，促進細胞增殖。本研究使用不同濃度蒼術素預處理細胞24h，再使用IL-1β 處理細胞，結果顯示細胞增殖活性增加，且在20 μmol/L以上時，細胞增殖活性顯著增加，選擇20 μmol/L 的蒼術素進行后續實驗，發現20 μmol/L 的蒼術素可顯著抑制IL-1β 誘導的軟骨細胞凋亡。這與既往的研究結果［13］一致，再次證實蒼術素是OA的潛在治療藥物。

自噬是依賴溶酶體途徑對細胞器及大分子物質進行降解的過程，具有維持細胞內穩態的作用，參與細胞凋亡過程［14］。研究顯示，自噬參與維持軟骨內平衡，參與OA 進展，激活自噬可減輕OA 嚴重程度［15］。LC3、Beclin-1、Atg5 是自噬通路相關的調控因子，LC3 有LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ兩種形式，發生自噬時，LC3-I 轉化為LC3-Ⅱ，Beclin-1 可調控自噬前體的形成，Atg5 是自噬活性標志物，與Beclin-1 共同參與正向調控自噬［16］。蒼術素參與自噬調節，如在膽管癌細胞中，蒼術素可通過誘導自噬，抑制細胞增殖與遷移［17］。本研究結果顯示，在10 μg/L IL-1β刺激24 h 后，軟骨細胞中自噬小體水平和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1、Atg5 蛋白表達水平顯著降低，表明IL-1β 誘導的軟骨細胞中自噬被抑制；使用20 μmol/L 的蒼術素處理細胞后，IL-1β 誘導的軟骨細胞自噬小體水平及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1、Atg5 蛋白表達水平顯著升高，提示蒼術素可促進IL-1β 誘導的軟骨細胞自噬，降低IL-1β誘導的軟骨細胞凋亡。

AMPK 是細胞ATP 水平的代謝傳感器，參與調節細胞能量代謝，AMPK 激活可使其下游底物磷酸化，ULK1 是AMPK 通路的下游分子，參與自噬的起始，SIRT1是NAD+依賴性組蛋白脫乙酰酶，AMPK可促進NAD+的生成，激活SIRT1 因子［18］。研究顯示，白果內酯通過激活AMPK/SIRT1/mTOR 通路，抑制IL-1β 誘導的軟骨細胞中誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）、環氧合酶2（Cyclooxygenase 2，COX-2）和基質金屬蛋白酶13（Matrix metalloproteinase 13，MMP-13）的產生［19］。蒼術素也參與AMPK/SIRT1 通路的調節，如蒼術素通過Sirt1/AMPK 軸誘導的自噬調節減輕癌癥厭食惡病質綜合征［20］。本研究發現，使用蒼術素處理軟骨細胞后，p-AMPK、SIRT1、p-ULK1蛋白表達水平顯著升高，表明蒼術素可能激活SIRT1/AMPK 信號通路。本研究進一步使用AMPK 抑制劑compound C 與蒼術素共同處理軟骨細胞，結果發現compound C 可逆轉蒼術素對軟骨細胞凋亡的抑制作用，提示蒼術素可能通過激活AMPK/SIRT1 信號通路提高IL-1β 誘導的軟骨細胞自噬，降低細胞凋亡。

綜上所述，蒼術素通過激活AMPK/SIRT1 信號通路促進IL-1β 誘導的大鼠軟骨細胞自噬，抑制細胞凋亡。但本研究局限于AMPK/SIRT1 信號通路相關的部分蛋白，蒼術素的具體作用機制仍須結合動物模型做更深入的研究。