基于網絡藥理學和分子對接法研究參七解郁方治療雙心疾病的分子機制

劉莉，王鳳榮

作者單位：1遼寧中醫藥大學研究生學院，遼寧 沈陽 110847；

2大連大學附屬中山醫院老年病科，遼寧 大連 116001；

3遼寧中醫藥大學附屬醫院心內科，遼寧 沈陽110032

雙心疾病是心血管系統疾病與精神情緒障礙并存的一類疾病，目前常指冠心病合并焦慮抑郁狀態，越來越多的臨床資料顯示冠心病病人常同時合并焦慮抑郁狀態。冠心病與焦慮抑郁相互作用、相互影響，互為因果，會導致疾病進一步惡化。冠心病人群患有焦慮抑郁的發生率明顯高于普通人群［1-2］，這既增加了病人的病痛與經濟負擔，也占用了社會醫療資源，因此對于雙心疾病的防治已經成為我國心血管疾病領域亟需解決的重要公共衛生問題［3］。

中醫經典理論認為心在人體中處于最高主導地位，心主血脈，心藏神，指心既是血液循環的原動力，又是精神、意識和思維活動的中心。《素問·五臟生成論》：“諸血者皆屬于心?！薄端貑枴ち澆叵笳摗罚骸靶恼?，生之本，神之變也?！薄端貑枴れ`蘭秘典論》：“心者，君主之官，神明出焉?！庇纱?，可以看出心主神明的重要生理功能。相反，心主神明功能一旦失司，就會導致情志異常，發展為郁病。因此，雙心理論也是中醫心系疾病理論的重要反應，既體現在生理方面相互依存，又體現在病理方面互為因果。目前，雙心疾病的治療通常是在冠心病治療的基礎上再加用抗焦慮抑郁藥，而長期應用這類藥物會使病人產生很強的依賴性，而且還加重了病人的經濟負擔［4］，而中醫藥對于雙心疾病的治療效果確切，安全性也能得到很好保證，在近十年的發展過程中逐漸受到關注與認可［5］。

王鳳榮教授在古文“開心散”“定志小丸”的基礎上創立了參七解郁方，由遠志、石菖蒲、人參、丹參、三七、郁金、合歡、柴胡、香附、百合、珍珠母、炙甘草組成；其功效為益氣化痰、安神定志，參七解郁方在臨床治療雙心疾病中獲得較好的療效，尤其對PCI術后雙心疾病的干預方面療效可靠。

網絡藥理學是多學科融合形成的新興技術，基于“疾病-基因-靶點-藥物”相互作用網絡，系統綜合地觀察藥物對疾病網絡的干預與影響，主要通過各種組學數據分析和計算機模擬手段構建多層次網絡來實現。分子對接是一種研究小分子配體與蛋白質受體之間相互作用和識別的理論方法。本研究將網絡藥理學和分子對接技術相結合共同研究中藥參七解郁方治療雙心疾病，為活性成分篩選和機制探索提供新的方法［6］。

1 方法

1.1 數據庫與軟件本研究主要應用的生物信息學工具包括：中藥系統藥理分析平臺（TCMSP，https：//old.tcmsp-e.com/）、TCMID 數 據 庫（http：//www.megabionet.org/ tcmid/）、Gene Cards 數據庫（https：//www.Genecards.org/）、在線韋恩分析工具（http：//bioinformatics.psb.ugent. be/webtools/Venn/）、Uniprot 網站（https：//www.uniprot.org）、Pubchem 數據庫（https：// pubchem. ncbi. nlm.nih.gov/）、Gene Cards 數據庫（https：//www.genecards.org/）、String 數據庫（https：//cn.string-db.org/）、DAVID 網站（https：//david.ncifcrf.gov/）、Auto Dock Tools 1.5.7軟件。

1.2 參七解郁方中化學成分以及其可能靶點預測利用TCMSP 平臺為主查找參七解郁方的藥物化學成分，篩選條件設定為：（1）類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18，（2）口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%， TCMSP 平臺檢索不到的成分通過TCMID 平臺為補充進行查找。Uniprot 網站確定各靶點的Uniprot ID。每個化合物利用 Pubchem 獲取 SMILES 和3D 文件，以便進行化合物的靶點預測和分子對接的應用操作。

1.3 雙心疾病靶點收集利用Gene Cards 數據庫，以“ coronary heart disease”“ anxiety- depression”為關鍵詞檢索得到雙心疾病的相關靶點及基因。

1.4 參七解郁方治療雙心疾病靶點篩選在韋恩分析工具在線網站輸入參七解郁方的藥物組成化合物以及雙心疾病可能的有關基因，獲取其交集以得到共同作用靶點。

1.5 蛋白質相互作用（protein-protein interaction，PPI）網絡構建以及核心靶點篩選將藥物成分化合物與疾病的交靶點輸入到String 數據庫，構建PPI網絡。將PPI網絡數據導入EXCEL 表格，通過Cytoscape 3.9.0 軟件對構建的PPI網絡進行可視化處理。

1.6 基因富集分析基因本體（gene ontology，GO）功能主要分為三大類，即細胞組成（cellular component，CC）、生物學過程（biological process，BP），以及分子功能（molecular function，MF）。京都基因和基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）數據庫是系統分析基因產物在細胞中的代謝途徑以及這些基因產物功能的數據庫。KEGG 通路富集分析常常應用于差異表達基因的功能注釋，了解差異表達基因的相關功能與作用通路［7］。

在DAVID 網站輸入參七解郁方中活性成分與雙心疾病的共同潛在靶點，在KEGG富集信號通路，并且將基因本體GO 功能進行富集分析。GO 富集分析時設定篩選閾值P＜0.05，分析細胞組成、生物學過程，以及分子功能，將每組的前10 位排名繪制成柱狀圖，進行可視化操作。通過制作氣泡圖對排名位于前30的信號通路進行可視化分析。

1.7 運用分子對接技術驗證參七解郁方活性成分與雙心疾病的潛在靶點選擇PPI網絡圖中的主要活性化合物與作用靶點進行分子對接驗證。從Pub Chem 分別獲得靶點蛋白以及化合物的三維立體結構，采用Auto Dock工具對蛋白受體和配體進行常規處理后，進行分子對接，得到結合能， 即成分與靶點的結合能是評價分子對接結果的重要依據，結合能越低結合就越穩定，靶點與分子作用的可能性就越大。

2 結果

2.1 參七解郁方化合物、潛在靶點以及疾病靶點預測結果TCMSP 檢索到參七解郁方中289 個化合物，TCMID 檢索到參七解郁方中16 個化合物，總計305 個。其中沒有預測到靶點為合歡花中有3 個化學成分與珍珠母中有9 個化學成分。Gen Cards 數據庫中檢索到冠心病靶點1 924 個，焦慮抑郁靶點1 279個。通過韋恩在線工具分析參七解郁方、冠心病、焦慮抑郁的可能靶點，獲得共有交集92個靶點，得到參七解郁方治療雙心疾病的潛在共有靶點。韋恩圖見圖1。

圖1 參七解郁方與雙心疾病靶點的韋恩圖

2.2 參七解郁方治療雙心疾病共有靶點的PPI 網絡結果由圖2 可知，將參七解郁方治療雙心疾病的交集靶點導入STRING 平臺，繪制PPI網絡圖。將置信度得分設置為0.7，除MT-ND6、DYRK1A、KCNMA1、CHRM2、CLDN4 等蛋白與其他蛋白之間沒有形成互作關系被排除，該網絡包含80 個節點及240條邊，平均度值（degree）為6，平均局部聚類系數為0.453，P＜1.0×10-16，提示與隨機相似靶點對比，此組相互作用靶點的差異有統計學意義。評價參數設定為節點度值，在PPI網絡內，隨著其靶點度值的增加，發揮的生物學作用可能更大。該網絡節點的大小與度值成正比，而且度值由小到大亦決定網絡節點顏色由淺到深。

圖2 參七解郁方治療雙心疾病靶點的PPI網絡圖

如圖3 所示，靶點度值排名前10 位的依次為信號轉導和轉錄活化因子（STAT3）、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1（AKT1）、白細胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子（TNF）、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK1）、白細胞介素-10（IL-10）、腫瘤蛋白p53 基因（TP53）、c-fos 原癌基因蛋白（FOS）、雌激素受體α（ESR1）、白細胞介素-4（IL-4），提示這些靶點是參七解郁方發揮治療作用的潛在關鍵靶點。

圖3 參七解郁方治療雙心疾病關鍵靶點信息

2.3 GO 生物功能注釋及 KEGG 通路富集將80個靶點輸入DAVID 網站進行富集，進行GO 功能富集分析，每組篩選條件設定為P＜0.05，得到細胞組成相關條目34 條，生物過程相關條目335 條，分子功能相關條目48 條，每組選取排名前10 位的條目進行可視化。

將參七解郁方干預雙心疾病的靶點導入David在線工具富集KEGG通路，獲得條目106條，其中P＜0.05 的條目100 條，去除與雙心疾病明顯無關通路，如瘧疾、肺結核、阿米巴病、弓形蟲病、類風濕性關節炎、利什曼病、百日咳等，選取P＜0.05 且與雙心疾病相關的前30條繪制成氣泡圖，見圖4。

圖4 參七解郁方治療雙心疾病靶點KEGG信號通路分析

80 個基因中有67 個基因參與了前30 條通路的富集，涉及的信號通路包括低氧誘導因子-1 信號通路（HIF-1 signaling pathway）、腫瘤壞死因子信號通路（TNF signaling pathway）、磷脂酰肌醇3 激酶/絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶信號通路（PI3K-AKT signaling pathway）、T 細胞受體信號通路（T cell receptor signaling pathway、叉頭框轉錄因子O 亞族信號通路（FoxO signaling pathway）、絲裂原活化蛋白激酶信號通路（MAPK signaling pathway）等通路，提示參七解郁方對于雙心疾病的治療可能通過多條信號通路以及作用多個作用靶點起作用。

2.4 藥物化合物-潛在靶點-信號通路網絡構建選擇KEGG 富集中的與雙心疾病相關的前30 條通路所包含的靶點以及靶點所對應的化合物構建化合物-靶點-通路網絡，見圖5。此網絡包含了節點175個，邊線535 條，以度值為標準，參七解郁方活性化合物節點度值的中位數為4，涉及的活性成分有89個，如表1 所示，主要在前30 條信號通路中發揮作用，可能通過作用于56個靶點。

圖5 參七解郁方治療雙心疾病的成分-靶點-通路網絡

表1 參七解郁方的活性成分信息

參七解郁方中度值大于5 的化合物共12 個，分別為槲皮素、木樨草素、山柰酚、柑橘素、二氫丹參內酯、丹參酮ⅡA、丹參新醌D、異丹參酮Ⅱ、異鼠李素、3'，5'-二甲氧基聯苯-4-醇、隱丹參酮、β 谷甾醇，表明參七解郁方可能通過多成分、多靶點、多通路治療雙心疾病。

2.5 分子對接結果將度值大于5的前7 個活性成分的分子配體與前5個靶點STAT3、AKT1、IL-6、TNF、MAPK1 進行對接，表2為對接靶點與活性成分的結合能數據，活性成分與靶點的分子對接顯示對接能力均較好。參七解郁方活性成分與靶點的分子對接模式圖見圖6。

圖6 參七解郁方活性成分與靶點的分子對接模式圖:A為STAT3與木犀草素結合；B為AKT1與丹參酮ⅡA結合；C為IL6與異丹參酮Ⅱ結合；D為TNF與山柰酚結合；E為TNF與柑橘素結合；F為MAPK1與異丹參酮Ⅱ結合

表2 活性成分與靶點的分子對接結果

3 討論

胡大一教授在我國最早提出“雙心醫學”理論，指心血管疾病可導致精神情緒障礙，相反精神情緒障礙又會加重原發疾病，疾病之間相互作用，導致疾病加重，病人痛苦不堪，有循證醫學研究表明也證實了這個結果［8］。冠心病中醫學歸為“胸痹”“心痛”“真心痛”等，“焦慮抑郁”歸為“郁證”，兩者雖然分屬不同疾病，但病位均為心，并與肝、脾、腎三臟均有密切聯系。如《靈樞》所云：“悲哀愁憂則心動，心動則五臟六腑皆搖”［9］。王鳳榮教授以《千金方》的“開心散”“定志小丸”化裁［10］，獨創參七解郁方，益氣化痰、安神定志。其中遠志、石菖蒲具有開竅化痰之功，與補氣安神之人參共用，合為君藥。正如《本草經》中所說此三藥共用有益氣養陰，定志解郁之功效。

網絡藥理學研究主要包括三個部分，一為篩選藥物活動化學成分，二為獲取潛在的作用靶點，三為建構作用網絡，比較適合于中藥復方多靶點、多途徑作用特點的機制研究。分子對接技術從剛性對接、半柔性對接到柔性對接，逐步闡明配體與受體的結合是一個動態過程，即配體與受體誘導契合過程中發生構象改變，最終形成形狀和能量最優匹配的結合模式［11］。

本研究運用網絡藥理學研究方法得到參七解郁方核心藥物組合發揮作用的主要有效成分，可分為黃酮類化合物和丹參類化合物，其中黃酮類化合物包括黃酮（柑橘素和木樨草素）、黃酮醇（槲皮素、山柰酚）、類黃酮（異鼠李素），丹參類化合物包括丹參酮類（異丹參酮Ⅱ、丹參酮ⅡA、丹參新醌D、二氫丹參內酯、隱丹參酮）和丹參酚類（β 谷甾醇）。黃酮對心腦血管有很好的保護作用，其可使體內的膽固醇降低，使機體的血液循環得到改善，而且黃酮還有很強用抗氧化作用，通過清除氧自由基而起作用，從而阻止了細胞老化，可使心腦血管疾病的發病率有效降低［12］。有研究發現，一些具有抗焦慮抑郁的中藥中有很多含有黃酮類化合物成分［13］。槲皮素可通過多種途徑治療焦慮抑郁等神經系統疾病，主要途徑包括降低炎癥因子、調節神經突觸可塑性等［14］。有研究表明中樞神經系統炎癥因子水平升高是抑郁癥的重要表現之一，而槲皮素可以通過降低大腦內的炎癥因子以預防小鼠的抑郁樣行為［15］。山柰酚亦有抗抑郁的治療效果，主要通過提升海馬神經營養因子的水平、抑制神經細胞過度自噬等途徑發揮作用［16］。木犀草素能夠使細胞凋亡水平降低并使細胞活力得到增強，其主要通過抑制MMP9及使PI3K/AKT 信號通路激活而實現的［17］，從而達到抑制凋亡、抗炎、改善動脈粥樣硬化等作用。丹參作為經典的傳統中草藥，具有祛瘀止痛、活血通經的作用，而且還具有清心除煩的療效，在雙心疾病的治療方面效果可靠［18-19］。丹參類化合物包括多種有效成分，其中丹參酮類成分含量較高，其有擴張血管、降脂、抗氧化等作用。學者研究表明動脈硬化大鼠血清中水平較高的ox-LDL、MDA、ROS可以通過丹參酮類化合物干預降低，SOD 水平得到提高。臨床研究表明氧化應激會導致機體的氧自由基水平升高，而這也是引發焦慮抑郁狀態的精神類疾病的重要病因之一。有研究表明應用隱丹參酮干預抑郁模型小鼠，其可使小鼠前額葉皮質與海馬的BDNF 的表達水平得到提升，提示隱丹參酮發揮抗抑郁作用可能通過改善BDNF得到體現［20］。

PPI 網絡以及核心靶點顯示參七解郁方的有效成分靶點主要為 STAT3、AKT1、IL6、TNF、MAPK1等，且分子對接證實有效成分靶點與各主要成分之間具有良好的結合能力。STAT3作為調節細胞因子誘導的促炎和抗炎反應的重要轉錄因子之一，可促進與炎癥相關的基因表達，其激活可增加神經炎癥相關的細胞因子分泌［21］。MAPK 信號傳導涉及多種生物過程，如組織發育、細胞增殖、細胞凋亡等等。在動脈粥樣硬化形成過程中，ox-LDL 和酶促修飾LDL 在巨噬細胞中誘導MAPK 活化，這反過來通過PPAR 介導的LDL 攝取受體如CD36 的上調來增強LDL 攝?。?2-23］。此外，MAPK1 可通過調節轉錄、翻譯、細胞骨架重排來介導多種生物學功能，可參與神經發育、神經可塑性和重度抑郁癥的基因。KEGG 通路富集結果發現，參七解郁方可能通過調節PI3K-AKT 信號通路、FoxO 信號通路、MAPK 信號通路、TNF 信號通路、HIF-1 信號通路等改善雙心疾病。PI3K/AKT 信號通路為重要的細胞信號通路之一，其廣泛存在于細胞中，是介導多種生長因子促存活的重要通路，在抑郁癥及抗抑郁藥物作用機制的研究中逐漸受到關注。AKT 是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，為 PI3K下游的一個重要靶標。AKT有AKT1、AKT2、AKT3。AKT1 是3 種亞型中為最重要的亞型，也是唯一在心臟和大腦中都富集的AKT 亞型，在冠心病及焦慮抑郁中均發揮重要的作用［24］。Fox O 家族是Fox基因家族中的一個亞族，能與DNA上的反應元件結合，激活靶基因，參與細胞增殖、分化、代謝、凋亡等過程。PI3K/AKT 信號通路在Fox O調節過程中發揮著重要的作用。

從網絡藥理學分析結果可見，參七解郁方治療雙心疾病為多成分、多靶點、多通路的模式。參七解郁方可能通過活性成分槲皮素、木樨草素、山柰酚、柑橘素、丹參酮ⅡA、丹參新醌D、異丹參酮Ⅱ、異鼠李素、3'，5'-二甲氧基聯苯-4-醇、隱丹參酮、二氫丹參內酯、β 谷甾醇等與 STAT3、AKT1、IL-6、TNF、MAPK1 等蛋白結合，進而調節TNF signaling pathway、PI3K-AKT signaling pathway、T cell receptor signaling pathway、MAPK signaling pathway 等信號通路，發揮降低炎癥反應、凋亡，提高神經營養、可塑性等的作用。

本研究通過網絡藥理學方法和分子對接技術對參七解郁方治療雙心疾病的作用靶點和途徑進行預測和驗證，研究的局限性也很明確，即未采用體內、外實驗來驗證預測的結果，僅僅使用分子對接驗證方式仍是不夠深入的，還需進行具體實驗進一步論證與探索，這為我們今后的研究提供了新思路和新方向。