CUL4B、TRPM2在胰腺癌組織中的表達和臨床意義

馬竹芳,龐林元,陳保銀,徐菁

胰腺癌是極具侵襲性的惡性腫瘤,全球每年新發44.1萬例[1]。胰腺癌早期階段臨床表現不典型,診斷和治療往往延誤,預后較差[2]。E3泛素連接酶Cullin 4B (CUL4B)作為支架蛋白構成Cullin-Ring復合物,參與細胞周期、信號傳導及DNA損傷修復等過程[3]。研究表明,膀胱癌、乳腺癌中CUL4B表達上調,能激活磷脂酰肌醇3激酶,促進腫瘤增殖、侵襲和干細胞特性形成[4-5]。人瞬時受體電位M2(transient receptor potential cation channel subfamily M member 2,TRPM2)是一種瞬時受體電位通道,參與調控鈣離子的跨膜轉運、多聚ADP核糖的降解過程,與炎性反應、自身免疫疾病、動脈粥樣硬化等疾病關系密切[6]。研究表明,TRPM2在乳腺癌、前列腺癌中表達上調,磷酸化富脯氨酸蛋白酪氨酸激酶,促進癌細胞的增殖[7]。目前胰腺癌中CUL4B、TRPM2表達及臨床意義尚不清楚。本研究通過檢測胰腺癌中CUL4B、TRPM2的表達,分析兩者與臨床病理特征及預后的關系,報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2019年3月—2020年3月西安交通大學醫學院附屬3201醫院接受手術治療胰腺癌患者86例的癌組織和癌旁組織。其中男46例,女40例;年齡37～68(55.29±6.26)歲;腫瘤最大徑:<4 cm 52例,≥4 cm 34例;腫瘤TNM分期:Ⅰ～ⅡA 期45例,ⅡB～Ⅲ 期41例;腫瘤分化程度:高中分化50例,低分化36例;腫瘤位置:胰頭部56例,胰體尾部30例;有淋巴結轉移53例。本研究已經獲得醫院倫理委員會批準(倫審〔2019〕022號),患者或家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2 病例選擇標準 (1)納入標準:①經組織病理檢查明確為胰腺導管腺癌,符合《胰腺癌綜合診治指南(2018版)》胰腺癌診斷標準[8];②入院前無放化療治療;③臨床資料齊全。(2)排除標準:①合并嚴重心肺功能障礙;②合并胰腺外原發惡性腫瘤或術后證實腫瘤非胰腺來源,如十二指腸、膽管下段及壺腹下段;③圍手術期死亡或術后30 d內死亡;④不能配合隨訪者。

1.3 觀測指標與方法

1.3.1 組織CUL4B、TRPM2蛋白檢測:將術中獲取的胰腺癌組織和癌旁組織浸泡于10%組織固定液中12 h,石蠟包埋切片。免疫組化染色的具體實驗步驟按照免疫組化試劑盒(購自北京中杉金橋生物科技公司,貨號PV6000)說明進行操作。簡要步驟:烘箱中60℃ 1 h,二甲苯脫蠟后一次放入100%至75%的梯度乙醇中水化,3%過氧化氫浸泡10 min,枸櫞酸鹽抗原修復液中煮沸,冷卻后10%羊血清37℃封閉30 min,滴加一抗4℃ 16 h,兔抗人CUL4B、TRPM2單克隆抗體購自英國abcam公司,貨號ab247477,ab11168。二抗37℃ 30 min,DAB顯色5 min,蘇木素染色2 min,分化液分化后清水清洗,返藍液中靜置5 min,依次脫水、透明和封片。利用日本Olympus公司的DX31顯微鏡觀察染色情況,染色深度評分(無染色0分,淺黃色1分,棕黃色2分,棕褐色3分)與面積評分(<25% 1分,25%～<50% 2分,50%～<75% 3分,≥75% 4分)的乘積≥2分為陽性,<2分為陰性。

1.3.2 組織CUL4B、TRPM2 mRNA基因表達檢測:取胰腺癌和癌旁組織約50 mg,剪碎后加入Trizol后研磨,離心留取上清采用RNA提取試劑盒(RNA提取試劑盒購自北京索萊寶公司,貨號R1200)提取組織總RNA,將RNA反轉錄為cDNA,進行熒光定量PCR反應(SYBR Green試劑盒購自北京索萊寶公司,貨號SY1020)。引物由上海生工公司設計合成。CUL4B上游:5’-TTCGTGGATTCCTGAAAACATCA-3’,下游:5’-CCAGCATCAGACAGTTTGGAAC-3’;TRPM2上游:5’-GAGATGCCAACCGATGCCTTT-3’,下游:5’-GGAGACTCGGACGTACTTTTTCA-3’;內參GAPDH上游:5’-TCCCCGCCGAGTACATACTG-3’,下游:5’-GTCTGCTCCGATATGAACTTCTC-3’。反應條件:94℃ 5 min、94℃ 30 s、60℃ 30 s、72℃ 40 s,共35個循環。體系:SYBR Green 5 μl,正反向引物各0.5 μl,cDNA 1 μl和雙蒸水3 μl。結果采用2-△△Ct法表示CUL4B、TRPM2 mRNA基因的相對表達量。

1.3.3 隨訪及預后:胰腺癌患者自出院后開始隨訪,隨訪間隔為3～6個月1次,隨訪時限為3年,隨訪以門診方式進行;隨訪內容為常規體格檢查、腹盆腔CT或MR等,了解隨訪中腫瘤復發進展及患者生存情況。隨訪終止時間為2023年4月。隨訪終點為患者發生腫瘤相關死亡或到達隨訪終止時間。

2 結 果

2.1 組織中CUL4B、TRPM2蛋白表達比較 癌組織中CUL4B、TRPM2蛋白陽性染色均位于細胞膜和細胞漿,其陽性率分別為72.09%(62/86)、69.77%(60/86),高于癌旁組織的9.30%(8/86)、11.63%(10/86),差異均有統計學意義(χ2=70.245、60.224,P均<0.001),見圖1。

圖1 胰腺癌及癌旁組織中CUL4B、TRPM2蛋白表達比較(免疫組化染色,×200)Fig.1 Comparison of CUL4B and TRPM2 protein expression in pancreatic cancer and paracancer tissues (immunohistochemical staining, ×200)

2.2 胰腺癌組織CUL4B與TRPM2蛋白表達的相關性 Spearman秩相關分析結果顯示,胰腺癌組織中CUL4B與TRPM2蛋白表達呈顯著正相關(r=0.720,P<0.001)。

2.3 組織CUL4B、TRPM2 mRNA基因表達比較 癌組織CUL4B、TRPM2 mRNA基因表達為(4.82±0.66)、(3.65±0.69),高于癌旁組織(3.51±0.40)、(2.56±0.61),差異均有統計學意義(t=15.741、10.976,P均<0.001)。

2.4 不同臨床病理特征胰腺癌組織CUL4B、TRPM2蛋白表達比較 TNM分期ⅡB～Ⅲ期、伴有淋巴結轉移胰腺癌中CUL4B、TRPM2蛋白陽性率高于Ⅰ～ⅡA期、無淋巴結轉移癌組織,差異具有統計學意義(P均<0.01),見表1。

表1 不同臨床病理特征胰腺癌組織中CUL4B、TRPM2蛋白表達比較 [例(%)]

2.5 CUL4B、TRPM2表達與胰腺癌患者生存預后的關系 胰腺癌患者隨訪結束時,共死亡70例(81.40%),無失訪病例;3年總生存率18.60%(16/86)。CUL4B陽性組和陰性組3年總生存率分別為9.68%(6/62)、41.67%(10/24),TRPM2陽性組和陰性組3年總生存率分別為8.33%(5/60)、42.31%(11/26)。

CUL4B陽性組、TRPM2陽性組患者3年累積生存率低于CUL4B陰性組、TRPM2陰性組患者,差異均有統計學意義(Log-Rankχ2/P=9.933/0.002、11.102/0.001),見圖2。

圖2 CUL4B、TRPM2表達對胰腺癌患者生存預后的影響

2.6 影響胰腺癌患者預后的多因素Cox回歸分析 以胰腺癌患者生存預后為因變量(1=死亡,0=存活),以上述結果中P<0.05項目為自變量進行多因素Cox回歸分析,結果顯示:TNM分期ⅡB～Ⅲ期、淋巴結轉移、CUL4B陽性、TRPM2陽性是影響胰腺癌不良預后的獨立危險因素(P均<0.01),見表2。

表2 影響胰腺癌患者預后的多因素Cox回歸分析

3 討 論

胰腺癌是嚴重的消化道惡性腫瘤,起病隱匿,預后極差。我國居民胰腺癌標化發病率為5.78/10萬,病死率為5.99/10萬[9]。雖然手術、化療等綜合治療是胰腺癌的主要臨床治療方案,但胰腺癌預后整體較差,5年總體生存率僅9%[9]。目前主要根據腫瘤TNM分期、病理分級等臨床病理特征評估胰腺癌患者的預后,但不同患者存在較大的腫瘤異質性,相同分期及相同治療方案的胰腺癌患者疾病復發轉移的風險存在較大差異。因此,有必要對影響胰腺癌預后的因素進行深入研究,并尋找有效評估患者臨床預后的標志物。

CUL4B是Cullin 4B-Ring E3泛素連接酶復合物的支架蛋白,通過多泛素化或單泛素化作用催化底物蛋白,參與肥胖、胰島素抵抗及病毒感染等病理生理學過程[10]。研究發現,CUL4B在肺癌、膠質瘤等多種類型癌癥中過表達,其通過表觀遺傳學修飾在轉錄水平調控靶基因表達,促進腫瘤細胞的增殖及侵襲行為[11-12]。本研究中,胰腺癌組織中CUL4B mRNA和蛋白表達明顯升高,這與既往在胰腺癌細胞及組織中研究結果一致[13],但該研究僅對人類癌癥基因組數據庫中CUL4B在mRNA基因表達的水平進行驗證,而不同mRNA的轉錄本的基因表達存在一定差異,本研究在蛋白水平對CUL4B進行驗證,結果更為準確。胰腺癌中CUL4B表達受微小RNA-300表達的調節。研究表明,胰腺癌中微小RNA-300表達下調,導致CUL4B mRNA穩定性增加,CUL4B激活Wnt/β-連環蛋白通路,β-連環蛋白入核后上調波形蛋白及N鈣黏素的表達,腫瘤細胞的侵襲能力增強[14]。本研究中,CUL4B表達與患者不良臨床病理特征有關,提示CUL4B促進胰腺癌的惡性進展。研究表明,CUL4B與組蛋白去乙?；?結合形成CRL4B復合物,該復合物促進組蛋白H2AK119位點的單泛素化,上調果蠅頭狀因子3和叉頭轉錄因子O亞型3的表達,促進腫瘤細胞的增殖、自噬、侵襲及干細胞樣特性形成[13]。另外,CUL4B能夠與DNA損傷結合蛋白1及組成型光形態發生蛋白1結合形成復合物,介導H3K27me2/3組蛋白去甲基化酶UTX的泛素化降解,促進了結直腸癌的惡性進展[15]。本研究中,CUL4B陽性胰腺癌患者預后較差,表明CUL4B有助于評估胰腺癌患者預后。研究發現,胰腺內分泌瘤中CUL4B與CUL4相關因子7結合,催化腫瘤抑制基因MEN1的泛素化降解,促進腫瘤細胞惡性增殖及對依維莫司治療耐藥性的形成,導致患者不良預后[16]。

TRPM2屬于瞬時受體電位超家族成員,是可通過鈣離子的非選擇性陽離子通道,能夠感受活性氧簇,參與機體氧化應激、炎性反應及細胞死亡等多種病理生理過程[17]。研究表明,TRPM2可通過促進內質網應激,促進腫瘤微環境中免疫抑制細胞浸潤,并通過促進腫瘤上皮間質轉化,促進腎透明細胞癌的腫瘤進展,是潛在的腫瘤治療靶點[18]。本研究中,胰腺癌組織中TRPM2 mRNA和蛋白表達升高,提示TRPM2參與促進胰腺癌的發生。這與既往Lin等[19]學者研究結果相似,但該研究僅納入64例胰腺癌患者,以中晚期患者為主(Ⅰ期患者僅6例),在反映不同分期胰腺癌患者TRPM2表達中代表性較差。胰腺癌中TRPM2表達升高的機制與缺氧微環境調控有關。研究表明,胰腺癌腫瘤微環境處于缺氧狀態,缺氧通過促進鈣離子內流誘導腫瘤細胞中線粒體游離活性氧的產生,上調并激活TRPM2的表達,促進胰腺癌細胞系PANC-1細胞的增殖、侵襲和轉移能力[20-21]。本研究中,TRPM2與胰腺癌不良臨床病理特征有關,提示TRPM2促進胰腺癌的腫瘤進展。有學者發現,胰腺癌患者中TRPM2的過表達可增加腫瘤細胞內鈣離子濃度,直接激活蛋白激酶Cα,活化下游絲裂原活化蛋白激酶/絲裂原細胞外激酶通路,促進腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲能力,導致腫瘤分期升高[21]。本研究中,TRPM2陽性胰腺癌患者預后較差,表明TRPM2可能是新的評估胰腺癌預后的腫瘤標志物。分析其原因,TRPM2的表達通過增加缺氧誘導因子1A和核因子E2相關因子2蛋白的穩定性,上調多藥耐藥基因等的表達,導致腫瘤對化療藥的敏感性降低及患者不良生存預后[22]。另有研究發現,應用TRPM2的特異性抑制劑如鄰氨基苯甲酸等能夠抑制腫瘤內鈣離子依賴的線粒體來源的活性氧產生,增強腫瘤細胞對化療藥治療的敏感性,是潛在的腫瘤治療靶點[23]。

本研究中,胰腺癌組織中CUL4B與TRPM2表達呈正相關,提示兩者在胰腺癌中可能存在相互作用關系。筆者分析,可能與兩者受缺氧調控有關。研究表明,缺氧條件下腫瘤細胞中TRPM2表達上調能夠增加缺氧誘導因子1A蛋白穩定性,而缺氧誘導因子1A能夠在轉錄水平直接激活CUL4B的轉錄,促進腫瘤上皮間質轉化,導致遷移、侵襲等惡性生物學行為的發生[24]。但胰腺癌中兩者具體作用仍有待進一步研究。

綜上所述, 胰腺癌組織中CUL4B、TRPM2在轉錄水平及蛋白水平均顯著升高,與患者不良臨床病理特征有關,均參與促進胰腺癌的腫瘤進展。CUL4B、TRPM2是影響胰腺癌不良生存預后的獨立因素,可能協助臨床醫生評估胰腺癌患者的臨床預后,進而指導臨床治療。但本研究在數據收集和樣本量等方面尚存在局限,即隨訪時間相對較短、樣本量較小,有待今后擴大樣本量,延長隨訪時間,進一步研究CUL4B、TRPM2的臨床應用價值。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

馬竹芳:設計研究方案,實施研究過程,論文撰寫;龐林元:提出研究方向,分析試驗數據,論文審核;陳保銀:實施研究過程,數據收集,分析整理,論文修改;徐菁:進行統計學分析