乳腺癌組織lncRNA CASC2、miR-532-3p表達水平與患者術后5年內生存的相關性

卜德永,趙連,周應強,劉亮,王帥

乳腺癌(breast cancer,BC)是女性常見腫瘤,其特點是在分子和臨床水平上的異質性[1]。近年來,BC的治療已取得許多進展,但其仍是女性癌癥死亡的重要原因[2]。長鏈非編碼RNA癌易感性候選基因2(long non-coding RNA cancer susceptibility candidate 2,lncRNA CASC2)是一種腫瘤抑制基因,能參與調節血管生成及癌細胞增殖和侵襲,其在BC等多種癌癥中下調,與癌細胞增殖和誘導細胞凋亡具有密切關聯[3-4]。微小RNA(microRNA,miRNA)能參與癌癥在內的多種人類疾病。其中,BC組織中miR-532-3p呈高表達,具有致癌作用[5]。報道顯示,lncRNA-miRNA軸在上皮間充質轉化和癌癥干細胞中發揮關鍵作用,參與癌癥進展[6]。研究表明,lncRNA CASC2能通過靶向調節miR-532-3p抑制氧化型低密度脂蛋白誘導的血管平滑肌細胞增殖,促進細胞凋亡[7]。但目前lncRNA CASC2、miR-532-3p與BC患者預后的關系尚未見研究報道。因此,現分析lncRNA CASC2、miR-532-3p在BC組織中的表達及其與患者預后的相關性,報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2015年1月—2018年6月大同市第五人民醫院普通外科收治女性BC患者127例,年齡34～67(52.15±6.22)歲,其中≥52歲63例,<52歲64例;絕經69例,未絕經58例;腫瘤直徑:≥2 cm 62例,<2 cm 65例;TNM分期:Ⅰ～Ⅱ期84例,Ⅲ期43例;腫瘤分化程度:中、高分化88例,低分化39例;有淋巴結轉移59例,無淋巴結轉移68例;分子分型:Luminal A型37例,Luminal B型35例,HER2過表達型25例,基底樣型30例。手術過程中收集患者BC組織及癌旁正常組織。本研究已經獲得醫院倫理委員會批準(臨床2014-10-2),患者及家屬均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 病例選擇標準 (1)納入標準:①符合《乳腺癌診療規范(2018年版)》[8]中的診斷標準,且經病理學確診;②臨床資料完整,且接受隨訪者;③均是初次確診患者,入組前未進行相關治療。(2)排除標準:①存在其他部位惡性腫瘤;②自身免疫性疾病或全身感染性疾病;③臟器功能嚴重損傷。

1.3 觀測指標與方法

1.3.1 BC組織和癌旁正常組織中lncRNA CASC2、miR-532-3p表達檢測:將BC組織及癌旁正常組織制成勻漿,采用RNA抽提試劑盒(廣州瑞博公司,批號RB7915)提取BC組織及癌旁正常組織總RNA,反轉錄合成cDNA(試劑盒購自太原市川至生物公司,批號16724L)。采用PCR擴增儀(美國賽默飛世爾公司,型號SimpliAmp)進行擴增。總反應體系30 μl根據PCR試劑盒(廣州瑞博公司,批號RB8139)配制。PCR反應條件:86℃ 4 min、95℃ 17 s、72℃ 15 s、81℃ 22 s,共35個循環。2-△△Ct法計算lncRNA CASC2(內參為GAPDH)、miR-532-3p(內參為U6)相對表達量。所有引物均由深圳子科生物公司合成,引物序列見表1。

表1 lncRNA CASC2、miR-532-3p引物序列

1.3.2 隨訪:BC患者術后隨訪5年(以電話和門診復查為隨訪方式),隨訪開始時間為術后第1日,截止時間為2023年6月30日或患者死亡。隨訪頻率:前2年每3個月進行1次隨訪,后3年每6個月進行1次隨訪。記錄患者5年內生存和死亡情況。

2 結 果

2.1 癌旁正常組織和BC組織lncRNA CASC2、miR-532-3p表達比較 BC組織中lncRNA CASC2表達水平低于癌旁正常組織,miR-532-3p表達水平高于癌旁正常組織(P<0.01),見表2。

表2 癌旁正常組織和BC組織lncRNA CASC2、miR-532-3p表達比較

2.2 BC組織中lncRNA CASC2和miR-532-3p表達在不同臨床病理特征中的差異比較 分別以BC組織中lncRNA CASC2、miR-532-3p表達水平的平均值(0.59、3.17)作為臨界值,將患者分為lncRNA CASC2高表達組(≥0.59)65例和低表達組(<0.59)62例、miR-532-3p高表達組(≥3.17)61例和低表達組(<3.17)66例。結果發現,BC組織中lncRNA CASC2、miR-532-3p表達水平與年齡、是否絕經、分子分型無關(P>0.05);腫瘤直徑≥2 cm、TNM分期Ⅲ期、腫瘤分化程度低分化、淋巴結轉移者比例lncRNA CASC2低表達組高于高表達組,而miR-532-3p低表達組低于高表達組(P均<0.01),見表3。

表3 BC組織中lncRNA CASC2和miR-532-3p表達水平在不同臨床病理特征患者中差異比較 [例(%)]

2.3 生存組和死亡組患者臨床病理特征及BC組織lncRNA CASC2、miR-532-3p表達差異比較 127例BC患者術后隨訪5年,生存99例(生存組),死亡28例(死亡組)。2組BC患者年齡、是否絕經、分子分型比較差異均無統計學意義(P>0.05),腫瘤直徑≥2 cm、TNM分期Ⅲ期、腫瘤分化程度低分化、淋巴結轉移者比例及miR-532-3p表達水平死亡組高于生存組,而lncRNA CASC2表達水平死亡組低于生存組(P<0.01),見表4。

表4 生存組和死亡組臨床病理特征及BC組織中lncRNA CASC2、miR-532-3p表達比較

2.4 BC組織lncRNA CASC2、miR-532-3p表達的相關性分析 由TargetScanHuman網站預測結果可知,lncRNA CASC2與miR-532-3p之間有12個互補結合位點,lncRNA CASC2可能靶向作用于miR-532-3p表達,見圖1。BC組織中lncRNA CASC2與miR-532-3p表達呈負相關(r=-0.561,P<0.001)。

圖1 lncRNA CASC2靶向miR-532-3p的生物信息學分析

2.5 BC組織中lncRNA CASC2、miR-532-3p表達與患者術后5年內生存的關系 lncRNA CASC2高表達組BC患者術后5年內總生存率為89.23%(58/65),顯著高于lncRNA CASC2低表達組66.13%(41/62)(χ2=9.854,P=0.002);miR-532-3p高表達組BC患者術后5年內總生存率為65.57%(40/61),顯著低于miR-532-3p低表達組的89.39%(59/66)(χ2=10.466,P=0.001)。

2.6 影響BC患者術后5年內生存的多因素Cox回歸分析 以BC患者術后5年內生存為因變量(賦值:是為“0”;否為“1”),以上述結果中P<0.05項目為自變量進行多因素Cox回歸分析,結果顯示:腫瘤直徑≥2 cm、TNM分期Ⅲ期、腫瘤低分化、有淋巴結轉移、lncRNA CASC2低表達、miR-532-3p高表達均是影響BC患者術后5年內生存的獨立危險因素(P<0.05),見表5。

表5 影響BC患者術后5年內生存的多因素Cox回歸分析

2.7 lncRNA CASC2、miR-532-3p預測BC患者術后5年內的生存價值 繪制lncRNA CASC2、miR-532-3p預測BC患者術后5年內的生存價值ROC曲線,并計算AUC,結果顯示:lncRNA CASC2、miR-532-3p及二者聯合預測BC患者術后5年內生存的AUC分別為0.840、0.852、0.908,二者聯合預測的AUC大于各自單獨預測(Z/P=2.246/0.025、2.033/0.042),見表6、圖2。

圖2 lncRNA CASC2、miR-532-3p預測BC患者術后5年內生存的ROC曲線Fig.2 ROC curves of lncRNA CASC2 and miR-532-3p predicting survival within 5 years after surgery in patients with BC

表6 lncRNA CASC2、miR-532-3p預測BC患者術后5年內生存的價值分析

3 討 論

BC是一種高度異質性腫瘤,其病因和病理表現因人而異。近年來,BC發病率逐年上升,但由于診斷、治療及護理的改善,病死率有所下降[9]。BC由復雜的細胞類型組成,包括腫瘤、基質和免疫細胞,每種細胞都可以呈現不同的表型,通過相互作用促進腫瘤進展和治療耐藥性,也強烈影響患者病情進展及預后[10]。因此,尋找預測BC進展及預后的指標至關重要。

許多miRNA和lncRNA能參與乳腺惡性腫瘤的發生和發育過程,可能在BC的早期診斷、治療和預后方面提供新的見解[11-12]。lncRNA是一種新型基因調節因子,不編碼蛋白質,但以RNA的形式調節不同水平的基因表達,與人類疾病尤其是癌癥的進展和預后有關。部分lncRNA的異常表達可能與癌細胞過度生長和BC預后不良有關[13-14]。已有研究表明,lncRNA CASC2在BC組織和細胞中表達顯著降低,其過表達能抑制BC細胞活力和遷移[15]。Zhang等[16]報道,lncRNA CASC2在BC組織和細胞系中顯著下調,其能誘導細胞周期停滯,通過調節轉化生長因子-β信號通路抑制BC細胞增殖和轉移,誘導BC的早期凋亡。lncRNA CASC2還能調控細胞腫瘤抗原p53基因表達,進而阻斷包括乳腺組織在內的多種組織中的癌變過程[17]。在本研究中,BC組織中lncRNA CASC2表達水平顯著低于癌旁正常組織;且lncRNA CASC2高表達組BC患者術后5年內總生存率較lncRNA CASC2低表達組高;與Orak等和Zhang等研究結果一致[15-16]。表明lncRNA CASC2可能與BC的發生及預后有關,其高表達提示患者預后生存較好。可能原因是lncRNA CASC2活性低會導致BC細胞增殖和遷移能力增強,導致BC的進展惡化。

miRNA通過抑制信使RNA翻譯負調節下游基因表達,在生物過程中起著重要作用[18-21]。有研究表明,miR-532-3p在BC中表達顯著上調,是環狀RNA(circRNA)103809的直接靶標,其水平上調能逆轉circRNA 103809誘導的抗腫瘤效果,進而在BC進展中發揮作用[22]。Peng等[23]報道,三陰性BC組織中miR-532-5p水平升高,miR-532-5p可預測三陰性BC的惡性腫瘤發生和預后不良。本研究發現,BC組織中miR-532-3p表達顯著高于癌旁正常組織,且miR-532-3p高表達組BC患者術后5年內總生存率較miR-532-3p低表達組低;與Liu等和Peng等報道的結果一致[22-23]。提示miR-532-3p可能參與BC的發生和預后,其高表達提示患者預后生存較差。可能原因是miR-532-3p高表達會促進BC細胞惡性生物學行為,進而使BC惡性生長。

本研究發現,BC組織中lncRNA CASC2與miR-532-3p表達呈負相關,二者表達與腫瘤直徑、TNM分期、腫瘤分化程度、淋巴結轉移相關,表明lncRNA CASC2和miR-532-3p可能存在靶向調控關系,影響BC患者臨床病理特征。進一步研究發現,死亡組BC組織中lncRNA CASC2表達水平較生存組低,miR-532-3p表達水平較生存組高,表明lncRNA CASC2和miR-532-3p表達與BC患者術后5年內生存關系密切,可影響BC患者預后。Cox回歸分析和ROC曲線發現,腫瘤直徑≥2 cm、TNM分期Ⅲ期、腫瘤低分化、有淋巴結轉移、lncRNA CASC2低表達、miR-532-3p高表達均是影響BC患者術后5年內生存的獨立危險因素;lncRNA CASC2和miR-532-3p二者聯合對BC患者術后5年內生存具有較高預測效能。提示臨床上要重點關注BC患者的上述危險因素,對于lncRNA CASC2和miR-532-3p表達異常的BC患者,臨床上給予及時的治療和干預,可延長患者生存期。

綜上所述,BC組織中lncRNA CASC2表達下調,miR-532-3p表達上調,且術后5年內死亡的BC患者較存活患者變化更顯著,對預測BC患者術后5年內生存情況價值較高。但本研究未探究lncRNA CASC2靶向調控miR-532-3p的具體機制,下一步將通過基礎細胞實驗來加以驗證。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

卜德永:設計研究方案,實施研究過程,論文撰寫;趙連:提出研究思路,分析試驗數據;周應強:實施研究過程,資料搜集整理,論文修改;劉亮、王帥:進行統計學分析,論文審核