血清LncRNA FAF、ITIH4在慢性心力衰竭患者中的表達意義及對預后的預測價值

江洋,劉澤巖,葉麗,汪棟林,程景林,萬俊

慢性心力衰竭(chronic heart failure,CHF)是一種臨床綜合征,是多種心臟疾病的終末期表現,與急性心力衰竭相比,CHF病情較長,對機體損害較大,更容易在某種誘因的作用下突然加重,危及生命[1]。遺傳因素已被證明在心力衰竭的發病機制中起核心作用,長鏈非編碼核糖核酸(LncRNA)是一組轉錄本長度超過200個核苷酸的非編碼RNA,以RNA的形式參與生物過程,已有研究表明LncRNA在CHF中發揮著關鍵作用[2]。成纖維細胞生長因子相關因子(fibroblast growth factor-related factors,FAF)是一種與心血管疾病相關的LncRNA,研究顯示LncRNA可通過上調成纖維細胞生長因子(FGF9)表達,激活磷酸化肌肽3激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)信號通路,抑制缺血缺氧心肌細胞凋亡[3]。間α胰蛋白酶抑制因子重鏈4(inter alpha trypsin inhibitor heavy chain 4,ITIH4)是一個炎性反應生物標志物,可抑制炎性反應、脂質過氧化和動脈粥樣硬化,血清ITIH4水平降低被證實與急性缺血性腦卒中患者炎性反應升高、復發風險增加及病死率升高相關[4]。冠心病患者血清ITIH4水平顯著降低,低水平ITIH4與冠心病狹窄程度加重及主要不良心血管事件風險有關[5]。但LncRNA FAF、ITIH4與CHF的關系尚不清楚,目前缺乏相關報道。鑒于此本研究擬檢測CHF患者血清LncRNA FAF、ITIH4表達,分析其與CHF預后的關系,報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2020年1月—2022年1月安徽醫科大學第二附屬醫院急診內科收治的CHF患者187例為CHF組,男112例,女75例,年齡55～77(65.87±8.19)歲,再根據NYHA心功能分級[6]分為Ⅱ級亞組65例、Ⅲ級亞組77例、Ⅳ級亞組45例;另選擇同期于醫院體檢中心體檢的健康志愿者103例為健康對照組,男65例,女38例,年齡56～78(65.11±8.12)歲。2組受試者性別、年齡比較差異無統計學意義(P>0.05)。本研究獲得醫院倫理委員會批準(YX2019-003),受試者及其家屬均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 病例選擇標準 (1)納入標準:①符合《中國心力衰竭診斷和治療指南(2018)》中CHF診斷標準[7];②紐約心臟協會(NYHA)心功能分級Ⅱ～Ⅳ級;③年齡18歲以上。(2)排除標準:①急性心力衰竭、急性心肌梗死、不穩定型心絞痛等心臟疾病;②惡性腫瘤,包括實體瘤和血液學惡性腫瘤;③既往接受心臟手術患者;④急慢性感染、自身免疫疾病、嚴重肝腎功能障礙。

1.3 觀測指標與方法

1.3.1 臨床資料收集:收集CHF患者性別、年齡、體質量指數、吸煙史、飲酒史、基礎疾病、NYHA分級、血常規(白細胞計數、中性粒細胞計數)、血生化(三酰甘油、總膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇、空腹血糖)、N末端腦鈉肽前體(NT-proBNP)、超聲心動圖[左心室收縮末期內徑(LVESD)、左心室舒張末期內徑(LVEDD)、左心室射血分數(LVEF)]等。

1.3.2 血清LncRNA FAF及ITIH4檢測:患者于入院翌日晨/健康對照組體檢當日采集空腹靜脈血5 ml注入干燥試管,室溫靜置后取上層液離心留取上清液待測。以GenEluteTM總RNA純化試劑盒(美國Sigma-Aldrich公司)從血漿中提取總RNA,紫外分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的純度、濃度和完整性,Revert Aid RT逆轉錄試劑盒(美國賽默飛公司)將總RNA逆轉錄為cDNA。CFX96 TouchTM實時PCR檢測系統(美國Bio-Rad公司)進行qRT-PCR反應,PCR體系:cDNA 1 μl,上下游引物各0.4 μl,2×SYBR Green混合液10 μl,ROC參比染料(50×) 0.4 μl,加ddH2O至20 μl。PCR條件: 95 ℃預變性30 s,95 ℃變性5 s, 60 ℃退火延伸15 s,共40個循環。引物序列:LncRNA FAF,上游,5′-CGCTAAAGGCACAGGGTCAG-3′,下游,5′-CACCAACCTTTCCCTTCCAGTC-3′;GAPDH(內參),上游,5′-GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG-3′,下游,5′-ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA-3′。LncRNA FAF引物和內源性對照GAPDH引物由上海Gene Pharma公司設計合成。使用2-ΔΔCT法評估LncRNA FAF表達。

取血清樣本,采用酶聯免疫吸附試驗檢測血清ITIH4水平,ITIH4試劑盒購自上海欣維宇生物科技有限公司,儀器為德國BMG LABTECH酶標儀。

1.3.3 隨訪:CHF患者參考文獻[6]進行規范化治療,出院后電話或門診隨訪12個月,記錄隨訪期間主要不良心血管事件(MACE)發生率。MACE定義為心力衰竭再住院和全因死亡。根據MACE的發生情況將患者分為MACE亞組41例和非MACE亞組146例。

2 結 果

2.1 2組血清LncRNA FAF及ITIH4表達比較 CHF組血清LncRNA FAF表達、ITIH4水平低于健康對照組,差異均有統計學意義(P<0.01),見表1。

表1 健康對照組和CHF組血清LncRNA FAF及ITIH4表達比較

2.2 CHF患者不同NYHA分級亞組血清LncRNA FAF及ITIH4表達比較 血清LncRNA FAF表達、ITIH4水平Ⅳ級亞組低于Ⅲ級亞組低于Ⅱ級亞組,差異均有統計學意義(P<0.01), 見表2。

表2 不同CHF心功能分級患者血清LncRNA FAF及ITIH4表達比較

2.3 MACE亞組和非MACE亞組血清LncRNA FAF及ITIH4比較 MACE亞組血清LncRNA FAF表達、ITIH4水平低于非MACE亞組,差異均有統計學意義(P<0.01),見表3。

表3 非MACE亞組和MACE亞組血清LncRNA FAF及ITIH4表達比較

2.4 非MACE亞組和MACE亞組臨床資料比較 MACE亞組患者年齡、NYHA分級Ⅳ級比例、血清NT-proBNP水平大于/高于非MACE亞組(P<0.05), LVEF低于非MACE亞組,差異均有統計學意義(P<0.01),見表4。

表4 非MACE亞組與MACE亞組臨床資料比較

2.5 影響CHF患者發生MACE的多因素Logistic回歸方程分析 以CHF患者隨訪期間是否發生MACE為因變量(賦值:0=否,1=是),以年齡、NYHA分級(賦值:0=Ⅱ和Ⅲ級,1=Ⅳ級)、NT-proBNP、LVEF、LncRNA FAF及ITIH4為自變量,進行多因素Logistic回歸分析,結果顯示:NYHA Ⅳ級、高水平NT-proBNP是CHF患者發生MACE的危險因素(P<0.01),高表達LncRNA FAF、高水平ITIH4是其保護因素(P<0.01),見表5。

表5 影響CHF患者發生MACE的多因素Logistic回歸方程

2.6 LncRNA FAF及ITIH4預測CHF患者發生MACE的價值 繪制LncRNA FAF及ITIH4預測CHF患者發生MACE價值的預測效能ROC曲線,并計算曲線下面積(AUC),結果顯示:LncRNA FAF、 ITIH4及二者聯合預測CHF患者發生MACE的曲線下面積為0.796、0.801、0.896,二者聯合預測曲線下面積高于單獨預測(Z=2.453、2.404,均P<0.001),見表6和圖1。

圖1 LncRNA FAF及ITIH4預測CHF患者發生MACE的ROC曲線Fig.1 ROC curve of LncRNA FAF and ITIH4 for predicting MACE in CHF patients

表6 LncRNA FAF及ITIH4預測CHF患者發生MACE的ROC曲線參數

3 討 論

心臟的主要功能是維持正常的心輸出量,心內充盈壓力不足引起心力衰竭會導致周圍水腫、肺水腫和疲勞、呼吸困難等癥狀,不少CHF患者可在確診后5年內死亡[8]。LncRNA通過調節相關基因的表達在心力衰竭中發揮關鍵作用,目前已有研究證實部分LncRNA參與CHF的發病機制,如LncRNA GASL1靶向負性調控TGF-β1抑制心肌纖維化和心肌細胞凋亡,在CHF中發揮保護作用[9]。LncRNA HOTAIR靶向抑制miR-30a-5p上調KDM3A表達減輕氧化應激和CHF心臟損傷[10]。

LncRNA FAF是在心血管疾病中發現異常表達的LncRNA,和FGF9位于同一染色體上,可通過反向互補組合。FGF9屬于成纖維細胞生長因子(FGF)超級家族,與FGF受體結合觸發其磷酸化,隨后激活PI3K/AKT和絲裂原細胞外信號調節激酶/細胞外信號調節激酶(MEK/ERK)信號通路,誘導心肌細胞增殖[11],心肌梗死大鼠心肌組織中FGF9表達下調,上調FGF9表達可增加微血管密度,抑制間質纖維化,增強收縮功能,降低心肌梗死后心力衰竭病死率[12]。本研究發現CHF患者的LncRNA FAF表達下調,既往研究認為LncRNA FAF過表達可上調FGF9表達,抑制轉化生長因子β1/Smad2/3信號通路,顯著減輕血管緊張素Ⅱ誘導的心肌細胞增殖、分化和膠原積累的增加,抵抗心肌纖維化[13]。進一步分析發現LncRNA FAF低表達與CHF患者NYHA分級增加有關,提示LncRNA FAF表達下調可能加速心力衰竭進程。分析其原因為LncRNA FAF過表達通過海綿miR-185-5p促進P21活化激酶2在心肌細胞中表達,減輕心肌細胞焦亡,提高細胞存活[14],繼而發揮心肌細胞保護作用,改善心功能,而LncRNA FAF水平降低則可促進缺血缺氧心肌細胞的凋亡[3]。另外,高表達LncRNA FAF是CHF患者發生主要不良心血管事件的保護因素,LncRNA FAF過表達可能通過抑制心肌細胞纖維化和凋亡在CHF中發揮保護作用,上調LncRNA FAF表達可能有助于改善CHF患者預后。

炎性反應是CHF發病和進展的關鍵,心臟損傷后巨噬細胞活化,募集單核和中性粒細胞從脾臟大量浸潤到心肌組織中,促進炎性反應,成纖維細胞向肌成纖維細胞轉化,促使心肌細胞凋亡和心肌纖維化,誘導心力衰竭[15]。ITIH4屬于α-胰蛋白酶抑制劑家族,主要由肝臟分泌,在感染誘導的炎性反應和器官損傷中起著重要作用。研究顯示ITIH4可滅活膿毒癥小鼠核因子κB(NF-κB)和細胞外信號調節激酶(ERK)途徑,抑制炎性反應細胞因子的分泌,血清ITIH4水平降低與疾病嚴重程度和28 d病死率增加有關[16]。炎性腸病患者血清ITIH4水平降低,與疾病活動性增加以及臨床治療反應低下有關[17]。本研究發現CHF組患者血清ITIH4水平降低。分析原因為ITIH4缺失可能加劇心肌纖維化和心肌細胞凋亡,導致CHF的發生。此外,CHF患者血清ITIH4水平隨著NYHA分級的增加而降低,推測ITIH4缺失可能促進炎性反應,引起大量炎性反應介質釋放和心肌組織單核細胞及中性粒細胞浸潤,成纖維細胞增殖,發生肌成纖維細胞轉化,大量細胞外基質蛋白沉積,促使心肌纖維化和異常重塑,加劇心功能減退。Logistic回歸分析顯示高ITIH4水平是CHF預后不良的保護因素,提示增高ITIH4水平可降低CHF預后不良的風險,ITIH4可能作為CHF潛在治療靶點。

ROC曲線分析LncRNA FAF、ITIH4在CHF預后預測中具有較高價值,聯合預測效能更高,LncRNA FAF、ITIH4可能作為CHF預后的新標志物。另外,Logistic回歸分析結果顯示NYHA分級Ⅳ級、高水平NT-proBNP是CHF患者發生MACE的危險因素,這是因為NYHA分級越高心功能越差,發生不良預后風險越大[18]。高水平NT-proBNP被認為是CHF的生物學標志物[19]。

綜上,CHF患者血清LncRNA FAF表達和ITIH4水平均降低,低表達LncRNA FAF和低水平ITIH4與CHF患者心功能降低以及不良預后有關。聯合檢測LncRNA FAF、ITIH4可預測CHF患者預后不良風險。本研究首次證實LncRNA FAF和ITIH4與CHF的關系,為臨床預后分析和治療提供了新的標志物和靶點,但也存在一定局限性,本研究為單中心研究,可能導致選擇性偏倚,樣本缺乏代表性,另外LncRNA FAF和ITIH4參與CHF的具體機制尚不清楚,尚待進一步開展基礎研究證實。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

江洋:設計研究方案,實施研究過程,論文撰寫;劉澤巖:實施研究過程,分析試驗數據;葉麗:實施研究過程,資料搜集整理,論文修改;汪棟林:進行統計學分析;程景林:數據收集、分析整理,論文撰寫;萬俊:提出研究思路,論文審核