基于網絡藥理學和分子對接探討銀柴胡抗痛風作用機制*

李文靜 潘 旭 劉 軍△ 朱 慧

痛風是因單鈉尿酸鹽沉積于關節及周圍組織引起以反復發作炎癥為主的反應性關節病,發病主要與嘌呤代謝紊亂、腎臟尿酸排泄障礙所引發的高尿酸血癥相關,嚴重者可致關節破壞、變形[1]。目前,臨床治療痛風的藥物主要有非甾體抗炎藥、秋水仙堿、抑制尿酸生成藥、促尿酸排泄藥等[2]。長期服用會產生胃腸道反應、肝腎毒性等不良作用[3]。中草藥因具有成本低、安全性高、不良作用小的優勢,已成為治療痛風的研究熱點。

銀柴胡是寧夏道地優勢中藥材,以根入藥,歸肝經、胃經,具有清虛熱、除疳積、清熱涼血之功[4]。臨床常用于治療小兒疳積發熱、陰虛潮熱、感冒高熱、腹大肢瘦等疾病[5]。西醫疾病多體現在代謝及免疫學疾病:如痛風、強直性脊柱炎等。痛風屬于中醫“痹證”范疇,《本草求原》曰:“清肺、胃、脾、腎熱,兼能涼血。治五臟虛損,肌膚勞熱,骨蒸煩痛,濕痹拘攣”,但其發揮藥效的物質基礎和作用機制尚不明確[6]。因此,本研究通過網絡藥理學及分子對接探討銀柴胡抗痛風的作用機制,為臨床應用及后續實驗驗證提供一定基礎。

1 材料與方法

1.1 銀柴胡活性成分收集TCMSP(https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)數據庫中檢索銀柴胡中的化學成分,利用口服生物利用度(OB)≥30%、藥物相似性(DL)≥0.18作為篩選條件,篩選出高度活性的有效成分。

1.2 成分作用靶點的獲取在TCMSP數據庫中收集銀柴胡的有效成分,PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/search)[7]搜索相應主要成分的SMILE name。將其導入SwissTargetPrediction 數據庫中,預測銀柴胡有效成分對應的潛在靶點。

1.3 痛風相關靶點DisGenet(https://www.disgenet.org)、Genecards(https://www.genecards.org)[8]等數據庫檢索與“GOUT”相關的作用靶點,將所得靶點去除重復項后得到痛風相關靶點。

1.4 藥物-疾病交集基因獲取分別將銀柴胡活性成分的相關靶點與疾病相關靶點,輸入微生信(www.bioinformatics.com.cn)“2～6個數據集VENN圖”繪制交互式venn圖,篩選兩者交集基因。

1.5 構建蛋白相互作用網絡(PPI)將收“藥物-疾病”共有基因導入String平臺(Https://string-db.org/),選擇Homo spaiens,Confidences為0.7,其余參數保持默認,構建 PPI。將PPI網絡模型前20導入Cytoscape 3.9.1軟件,運用“Net work analysis”功能,篩選出關鍵靶點基因,構建網絡圖。

1.6 GO功能及KECC通路富集分析將共同靶基因導入DAVID數據庫(https://david.ncifcrf.gov/)進行Go(Gene Ontology) 富集分析和KEGG(Kyoto Encyclopedida of Genes and Ge-nomes)分析,物種選擇Homo spaiens,以Pvalue<0.01,count≥5為參考值,分別篩選收集BP(生物過程)、CC(細胞過程)、MF(分子功能)條目、KEGG通路并進導入微生信平臺(https://www.bioinformatics.com.cn/),進行相應GO富集氣泡圖制作及可視化分析。

1.7 成分-靶標-通路-疾病網絡構建將篩選的活性化合物、靶點及 Pvalue<0.01且Count≥5主要信號通路導入構建Cytoscape軟件對可視化網絡構建及分析。

1.8 分子對接依據1.4及1.6得到的主要有效成分及核心靶點進行分子對接,應用TCMSP得到有效成分的Pubmed編號,從Pubchem 數據庫(https://pubchem.ncbi.nlm.n-ih.gov/)中下載有效成分的3D結構,作為配體。從 PDB 數據庫(https://www.rcsb.-org/)中下載靶基因的 3D 結構,作為受體;當自由結合能≤5 kJ·mol-1時,表明受體和配體對接良好,數值越小表明結合能力越好[10],Pymol 軟件自由能較低的組別進行結果制圖可視化呈現。

2 結果

2.1 銀柴胡活性成分及藥物靶點的篩選結果共篩選得到11個活性化合物,以Probability*>0為篩選條件,獲得265個靶基因。見表1。

表1 銀柴胡的化學成分信息(OB≥30%,DL≥0.18)

2.2 痛風相關靶點獲取以“Gout”為關鍵詞分別從 DisGenet(Score≥0.3)、Genecards(Relevance score>0.5)檢索痛風相關靶點,去除重復值,共1128個。

2.3 藥物-疾病交集基因獲取將銀柴胡活性成分相關的265個靶點與痛風1128個靶點進行Venn分析,得到交集基因50個。見圖1。

圖1 交集基因Venn圖

2.4 PPI網絡的構建PPI圖共涉及21個蛋白,52條相互作用關系。將前20導入Cytoscape 3.9.1軟件進行網絡拓撲分析,選取 Degree、Closeness、Eigenvector和 Betweeness 都大于中位的靶點,得到8個核心靶點基因,分別為SRC、TNF、ALB、PPARA、NOS2、CASP1、PPARG。見圖2、圖3。

圖2 銀柴胡抗痛風PPI網絡圖

圖3 銀柴胡抗痛風關鍵靶點基因拓撲圖

2.5 GO功能分析及 KEGG 信號通路分析按照Pvalue<0.01[9],共得到178個信號通路。以Pvalue<0.01,count≥5為參考值,篩選收集BP(生物過程)條目18個,主要包括ERK1和 ERK2級聯的正向調節、細胞內受體信號通路、細胞對脂多糖的反應、肽基-酪氨酸磷酸化、肽基-酪氨酸磷酸化的正向調節等;CC(細胞過程)條目16個,包括受體復合物、膜筏、核質、質膜、細胞質等;MF(分子功能)條目15個,包括RNA聚合酶II轉錄因子活性,配體激活的序列特異性DNA結合等。見圖4～圖6。KEGG通路條目11個,主要涉及癌癥的通路、化學致癌-受體活化、脂質和動脈粥樣硬化、結核、PPAR信號通路等。見圖7。

圖5 GO-CC氣泡圖

圖6 GO-MF富集氣泡圖

圖7 KEGG通路富集氣泡圖

2.6 藥物-活性成分-靶點-通路網絡的構建與分析共10種活性化合物作用于上述11種信號通路,其中Degree值較高的為銀柴胡胺D、(2R)-5,7-二羥基-黃烷酮、豆甾醇、菠菜甾醇、谷甾醇等通過作用在癌癥的通路(HSA05200)、化學致癌-受體活化(HSA05207)、脂質和動脈粥樣硬化(HSA05417)等通路信號上的SRC、PPARG、TNF、PPARA、ALB、PRKCA等蛋白相互作用而發揮抗痛風作用。見圖8。

圖8 藥物活性成分-靶點-疾病-通路圖

2.7 分子對接結果結合1.4及1.6得到結果,選取通路信號最多的SRC、TNF、PPARG、PPARA、ALB、PPKCA、PPARD、NOS2等關鍵靶基因分別與銀柴胡胺D、(2R)-5,7-二羥基-黃烷酮、豆甾醇、菠菜甾醇、谷甾醇進行分子對接,結合活性良好(-14.06～-29.46 kJ·mol-1);排名前2名的可視化圖見圖9。

圖9 銀柴胡活性成分與核心靶點分子對接構象圖

3 討論

痛風屬于中醫“痹證”范疇。中醫認為寒、濕等邪氣為主要病因,病位在經脈,若走注關節,痛熱甚劇。按照中醫治法,若痹證熱邪偏勝者,清熱為主[11]。現代研究證實,炎性細胞和細胞因子之間的相互作用與該病的發病有密切關系,當發生痛風時,血液尿酸濃度升高,尿酸鹽結晶容易析出,對血管內膜造成慢性炎性損害,損傷的動脈內有大量的單核細胞黏附于內膜上,促進IL-6、TNF等釋放[12]。本研究共篩選出銀柴胡有效活性化合物11個,拓撲圖顯示其中植物甾醇類為抗痛風發揮主導作用。其中谷甾醇可通過抑制炎癥小體的核心蛋白 NLRP3 的表達,減少細胞中的促炎細胞因子生成,從而起到抗炎、抗痛風的作用。豆甾醇顯著降低炎癥因子IL-1β、IL-6、MCP-1 和環氧合酶 COX-2的mRNA表達,與炎性反應聯系密切[13]。α-菠甾醇具有抗炎和解熱的作用[14]。

本研究共預測獲得銀柴胡抗痛風8個核心靶點,包括:SRC、TNF、ALB、PPARA、PPARG、NOS2、CASP1、APP。SRC編碼的原癌基因酪氨酸蛋白激酶可調節細胞代謝、存活和增殖[15],能夠與PTK2B/PYK2一起在破骨細胞骨吸收中發揮重要作用,還可通過激活線粒體細胞色素C氧化酶促進破骨細胞的能量產生[16]。PPARG能抑制炎性細胞因子如 NF-κB、TNF-α、C反應蛋白的產生和活化[17]。ALB可在組織損傷或炎癥引起的白蛋白分解代謝增加,增強免疫作用[18]。NOS2能夠促進一氧化氮(NO)合成,過量的NO直接引起細胞毒副作用,對細胞造成損害,從而促進炎癥性疾病-痛風的發生[19]。排名前10的信號通路為癌癥通路、化學致癌-受體活化、脂質和動脈粥樣硬化、PPAR信號通路等。其中PPAR信號通路是發揮調血脂作用的一條重要途徑,PPAR 信號通路上的蛋白如PPARA、PPRRγ 等能夠影響脂肪吸收、脂肪代謝等一系列的代謝相關重要環節[20]。PPARG通過抑制NF-KB介導的促炎癥反應使部分組織細胞受細胞因子或炎性介質的刺激下,表達上調[21]。TNF-α 為體內與炎癥反應相關的細胞因子,其產生途徑與多種蛋白產生的級聯效應有關[22]。故銀柴胡抗痛風具有多成分、多靶點、多通路的特點。

分子對接驗證銀柴胡活性成分與關鍵靶點 SRC、TNF、ALB、PPARA、PPARG、PPARD、PRACA等之間結合能力,發現銀柴胡胺D、(2R)-5,7-二羥基-黃烷酮、豆甾醇、菠菜甾醇、谷甾醇與8種蛋白均具有良好的結合活性,初步驗證銀柴胡多種有效成分通過作用于關鍵靶點起到抗痛風的作用,為后續進一步實驗驗證及臨床應用奠定基礎。