肺寧湯對急性放射性肺炎大鼠炎癥因子的影響*

劉廣梅

胸部腫瘤在放射治療中肺組織接受較高劑量或較大容積照射,易發生放射性肺炎,直接或間接導致病理性改變,表現為炎癥介質釋放,細胞因子活化,放射性肺炎為胸部放療常見的并發癥,發病率約為10%[1,2]。輔助性T細胞17(Th17細胞)通過分泌細胞因子促進炎癥性疾病發生,調節性T 細胞(Treg 細胞)可抑制炎癥反應的發生,Th17/Treg 細胞在機體內存在動態平衡[3,4]。Th17/Treg失衡參與了重癥肺炎的發生發展,檢測外周血Th17和Treg的百分率及其相應細胞因子水平對評估重癥肺炎的病情和預后有重要的臨床意義[5]。核因子-κB(NF-κB )為具有多種功能的核轉錄因子,能夠參與多種基因啟動子,在肺部疾病、感染、炎癥反應時NF-κB 被激活,而NF-κB 通路中p65和 IκBα 在肺炎中發揮關鍵作用[6,7]。有研究發現,NF-κB和PI3K-Akt通路參與調控肺炎鏈球菌HSP40誘導BMDM免疫應答的過程[8]。肺寧湯為新鄉醫學院第三附屬醫院治療肺炎的院內協定方,具有清熱解毒、養陰清肺功效,具有較好的臨床療效,但其作用機制尚不明確。本研究探討肺寧湯對急性放射性肺炎模型大鼠細胞炎癥因子、外周血 Th17/Treg 平衡及NF-κB 通路的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料于北京維通利華實驗動物技術有限公司采購SD大鼠,雄性,體質量(220±20)g,鼠齡8～10周,生產許可證(SCXK-[京]2012-0001),動物合格證號:110011191100175。12 h晝夜節律飼養,自由飲水進食,符合《實驗動物管理條件》要求。

肺寧湯藥物組成:牛蒡子10 g,白花蛇舌草10 g,黃芩10 g,麻黃10 g,杏仁15 g,麥冬15 g,熟地黃10 g,連翹15 g,苦參10 g,川貝母10 g,黃精10 g,魚腥草10 g,甘草10 g。各味藥材均有院內中藥房提供,藥材加水煎煮2次,濃縮至1 ml含1 g原藥材的藥液。地塞米松片(廣東華南藥業集團有限公司,生產批號:20220412),加生理鹽水配置成0.125 mg/ml的溶液。HE染色液(上海研域化學試劑有限公司),IFN-γ、TNF-α和IL-6檢測試劑盒(北京中同生物技術有限公司),CD4、CD25、Foxp3、IL-17A抗體試劑盒(美國BD公司),抗體 p65和IκBα蛋白一抗(南京建成生物科技公司),二抗(河北博海生物工程開發有限公司),顯色液(北京中杉金橋生物技術有限公司)。

Precise型醫用直線加速器(瑞典醫科達公司),RM2235型病理切片機(德國萊卡公司),NIKON CI-S型倒置顯微鏡(日本尼康公司),TD5A-WS/TD5AWS型低速離心機(湖南湘儀離心機有限公司),ELx800酶標儀(美國伯騰儀器有限公司),FACSCalibur 型流式細胞儀(美國BD公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組與給藥40只SD大鼠除空白組的30只,水合氯醛腹腔麻醉,平躺仰臥于照射臺上,充分暴露胸部,固定,Precise型醫用直線加速器調整照射野,上至大鼠前肢兩腋窩中點連線,下至胸骨劍突水平,直線加速器進行全胸單次照射,源靶距為100 cm,劑量率為250 cGy/min,總劑量為16 Gy[9]。照射完畢大鼠自然蘇醒后,常規飼養。空白組近麻醉固定,同等條件下肺部假照射。與照射后第2天開始干預,空白組和模型組給予生理鹽水灌胃,試驗組給予肺寧湯灌胃,陽性組給予地塞米松灌胃,劑量分別為5 ml/kg,每日1 次,連續給藥14 d。

1.2.2 標本采集給藥2周后,取各組大鼠,麻醉,固定于木板上,腹主動脈取血,肝素鈉抗凝管留取2 ml,然后摘取右肺中葉,10%福爾馬林溶液固定,摘取余肺,液氮冷卻后-86 ℃保存。

1.2.3 HE染色取10%福爾馬林溶液固定的右肺中葉,不同濃度的乙醇脫水,二甲苯固定,石蠟包埋,切片,厚度為5 μm,烤片,二甲苯脫蠟,乙醇水化,蘇木精染色,鹽酸乙醇溶液中分化,自來水沖洗返藍,伊紅染色,中性樹膠進行封片,顯微鏡下觀察。

1.2.4 炎癥因子檢測取肝素鈉抗凝管留取2 ml,離心,取上清,采用酶聯免疫吸附法(ELISA)測定各組大鼠血清干擾素-γ(IFN-γ)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白細胞介素-6(IL-6)水平,按照說明書操作。

1.2.5 流式細胞檢測取肝素鈉抗凝管留取2 ml,離心,取中間部分,分為2份,一份行外周血 Th17細胞含量檢測,加入溶血素,離心,加入磷酸鹽緩沖液洗滌2次,重懸細胞,避光孵育,先染表面抗體CD4及同型,破膜后再染IL-17,上機檢測分析。一份行Treg細胞含量檢測,10%溶血素裂解紅細胞,先染表面抗體CD4、CD25,破膜后再染Foxp3,上機檢測分析。

1.2.6 Western Blot檢測取新鮮冷凍肺組織,適量,加入含有蛋白酶抑制劑的細胞裂解液,肺組織勻漿,離心,取上清,BCA測定蛋白濃度,勻漿上清液與上樣緩沖液等量混合,電泳,轉膜,封閉,一抗4 ℃過夜,二抗室溫孵育1 h,漂洗,ECL曝光液曝光,凝膠成像系統檢測,測定各組條帶灰度值,按照說明書操作。

2 結果

2.1 各組大鼠肺組織病理學形態比較空白組大鼠肺組織結構正常,未見炎性細胞浸潤。模型組肺泡壁增寬,肺泡壁結構不完整,炎性滲出水腫明顯,肺泡內大量炎性細胞,可見大量巨噬細胞、淋巴細胞等炎性細胞浸潤,肺泡壁結構不完整,纖維素樣滲出物,局灶性壞死。試驗組和陽性組充血、水腫、滲出等顯著改善,炎細胞浸潤減輕,可見少量炎性細胞,間質輕度水腫,肺泡壁結構相對完整。見圖1。

圖1 大鼠肺組織病理改變比較(HE染色,x400倍)

2.2 各組大鼠炎癥因子水平比較與空白組比較,模型組IFN-γ、TNF-α和IL-6水平顯著升高(P<0.05),提示急性放射性肺炎模型大鼠炎癥因子水平顯著升高。治療后,與模型組比較,試驗組和陽性組IFN-γ、TNF-α和IL-6水平顯著降低(P<0.05),但試驗組和陽性組大鼠炎癥因子水平差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組大鼠炎癥因子水平比較 (只,

2.3 各組大鼠外周血Th17和Treg細胞含量比較與空白組比較,模型組外周血 Th17細胞含量顯著升高,Treg細胞含量顯著降低(P<0.05),提示急性放射性肺炎模型大鼠 Th17/Treg 細胞失衡。治療后,與模型組比較,試驗組和陽性組Th17細胞含量顯著降低,Treg細胞含量顯著升高,且試驗組優于陽性組(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠外周血 Th17和Treg細胞含量比較 (只,

2.4 各組大鼠p65和IκBα蛋白表達水平比較與空白組比較,模型組肺組織p65蛋白表達水平顯著升高,IκBα蛋白表達水平顯著降低(P<0.05),提示急性放射性肺炎模型大鼠 肺組織p65顯著升高,IκBα顯著降低。給予肺寧湯和地塞米松灌胃2周后,與模型組比較,試驗組和陽性組肺組織p65蛋白表達水平顯著降低,IκBα蛋白表達水平顯著升高,且試驗組優于陽性組(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠組織p65和IκBα蛋白表達水平比較

3 討論

放射性肺炎為放療過程中常見的并發癥,西醫治療以糖皮質激素及免疫抑制劑為主,雖有療效,但不良反應較多,中醫藥治療放射性肺炎優勢明顯,療效顯著,為放射性肺炎的防治提供了新思路。放射性肺炎屬中醫“肺痿、肺痹”等范疇,外來火熱邪毒,熱邪犯肺可耗傷氣血陰津,導致肺失濡養,造成干咳、氣喘、出血等典型癥狀,治宜清熱解毒,養陰潤肺[10,11]。研究發現,清肺養陰活血方聯合潑尼松龍能提高放射性肺炎患者臨床療效,明顯緩解患者癥狀,改善氧化應激狀態,增強機體免疫功能,安全可靠[12]。研究發現,麻杏石甘湯聯合葦莖湯治療放射性肺炎急性期比單純激素抗感染治療效果顯著[13]。前期臨床也發現具有清熱解毒、養陰清肺功效肺寧湯對放射性肺炎具有較好的臨床療效,但其作用機制尚不明確。

Th17和Treg 是近年發現的CD4+T細胞的亞群,參與調節機體的免疫功能并維持其動態平衡,促炎性Th17細胞與抑制炎癥性Treg細胞的平衡在自身免疫性疾病和腫瘤免疫中發揮重要作用[14]。研究發現,放射性肺炎形成過程中出現Th17/Treg失衡,這為進一步揭示放射性肺炎的發病機制及臨床尋找放射性肺炎的預測因子提供了重要信息。NF-κB 為能特異性結合基因啟動子或增強子的調節因子,以p65及p50二聚體形式存在,受到刺激時IκBα 被降解,釋放NF-κBp65,調節炎癥相關基因的表達。早期放射性肺損傷NF-κB p65、IL-1β的mRNA表達明顯上調,IκBα表達下調,抑制NF-κB p65、減輕炎癥反應可能減緩放射性肺損傷[15]。

本研究發現,試驗組和陽性組少量炎性細胞,間質輕度水腫,肺泡壁結構相對完整,IFN-γ、TNF-α和IL-6水平顯著降低,Th17細胞含量顯著降低,Treg細胞含量顯著升高,肺組織p65蛋白表達水平顯著降低,IκBα蛋白表達水平顯著升高。肺寧湯由牛蒡子、白花蛇舌草等13味中藥材組成,方中牛蒡子疏散風熱、宣肺透疹、消腫解毒,有抗腫瘤、抗炎、抗糖尿病、抗菌及抗病毒作用;白花蛇舌草清熱、利濕、解毒,具有增強免疫功能和抑瘤等作用;黃芩清熱燥濕、瀉火解毒,麻黃發汗解表、宣肺平喘、利水消腫;杏仁降氣止咳平喘,具有鎮咳、平喘、增強人體免疫力、抑制和殺死癌細胞作用;麥冬養陰潤肺、益胃生津,具有抗疲勞、清除自由基、提高細胞免疫功能作用;熟地黃補血滋陰,益精填髓;連翹清熱解毒、散結消腫;川貝潤肺止咳、化痰平喘,用于肺虛、久咳、肺癰、瘰疬、癰腫等,黃精補脾、潤肺生津,具有抗病原微生物、抗疲勞、抗氧化作用;魚腥草清熱解毒、消腫療瘡,具有增強免疫力、抗腫瘤、抗病原微生物等藥理作用,甘草調和諸藥藥性。全方共奏清熱解毒、養陰清肺功效。

綜上所述,肺寧湯可保護急性放射性肺炎模型大鼠肺組織,其機制可能與降低細胞炎癥因子,調整 Th17/Treg 細胞平衡,抑制NF-κB 通路蛋白表達有關。