一種表征可吸收膠原蛋白材料孔結構的方法研究

王常斌，王秀秀，陳洪建，艾沖沖，萬敏，盧文博

1. 山東省醫療器械和藥品包裝檢驗研究院，山東 濟南 250101；2. 國家藥品監督管理局生物材料器械安全性評價重點實驗室，山東 濟南 250101；3. 山東省醫療器械生物學評價重點實驗室，山東 濟南 250101

引言

生物可吸收膠原蛋白因其低免疫原性、修復特性和止血特性等優異性能成為了理想的生物醫學材料，被廣泛應用于醫用敷料、骨修復材料等領域[1]。研究表明，材料的孔徑和孔隙率的大小對細胞的結合、遷移和長入以及組織的長入和再生起著重要的作用[2]。目前，關于生物可吸收膠原蛋白材料的開發應用方面的報道較多[3-4]。但該類材料在進行微觀結構表征時，如何獲得高清晰度、高分辨率的掃描電子顯微鏡（Scanning Electron Microscope，SEM）圖像，并利用SEM 圖像分析該類材料的微觀結構，尤其是對其孔徑和孔隙率系統進行分析研究的報道較少。近年來，該類材料的相關產品標準陸續發布[5-6]，均要求進行孔結構（如孔徑大小、孔徑分布、孔隙率等）的表征，而標準中并未提供表征方法。目前，固體材料的孔徑和孔隙的測試主要采用壓汞法[7]和氣體吸附法[8-9]，但該方法并不適用于膠原蛋白類的材料，因此亟需一種切實可行的試驗統計方法，以準確地評價膠原蛋白材料的孔徑和孔隙率。

Image J 軟件是一款基于Java 的公共圖像處理軟件[10]。該軟件可快速處理各種圖像，且其圖像數據處理簡捷[11]，可定量計算煤矸圖像的混合度[12]，實現顯微圖像細胞計數[13]，并對煙絲纖維壓片圖像的色度比進行定量分析[14]，表征鋰離子電池隔膜表面膜孔的孔隙率[15]，統計織物孔隙率[16]。利用Image J 軟件，可對拍攝的SEM 圖像進行更全面的信息采集和分析，獲得材料孔徑大小、孔徑分布和孔隙率等信息，避免了單憑拍攝者經驗、采集信息量小、分析困難等問題[17]，提高了材料微觀結構分析的準確性，為科學評價材料提供技術支持。

本文旨在針對膠原蛋白材料微觀形貌表征，如何進行樣品制備，以及如何利用場發射SEM 選擇合適的試驗參數和加速電壓，并對獲得的SEM 圖像如何進行孔隙率和孔徑分布的分析提出了相應的檢測方法和解決方案。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

測試樣品為可吸收硬膜修補材料（Integra LifeSciences Corporation，美國），見圖1，長度約5 cm，寬度約1 cm。

圖1 可吸收硬膜修補材料實物圖

1.2 主要儀器設備

場發射SEM：SU8010（HITACHI，日本）；離子濺射儀：KAS-2000F（BRIGHT，英國）；分析軟件：Image J（版本1.8.0）。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品制備

使用鋒利的手術刀片或剪刀將樣品裁剪，裁剪過程中盡量保持樣品的形態結構，避免樣品變形以影響形貌的觀察，裁剪后的表面應光滑平整。將裁剪后的樣品橫截面用導電膠固定于樣品臺上，并用導電膠橋接樣品。

1.3.2 拍攝SEM圖像

將場發射SEM 工作距離設定為8 mm，選擇Lower探頭。因膠原蛋白材料不導電、荷電現象明顯，采用不同加速電壓、噴金等方式以獲得清晰無荷電的圖像。其中加速電壓選擇6 個，分別為0.5、1、2、5、10、15 kV。掃描速度為40 s。離子濺射條件為鉑靶，濺射電流為5 mA，濺射時間為90 s。離子濺射后選擇同樣的6 個加速電壓觀察樣品。

1.3.3 分析樣品的孔徑和孔隙率

利用Image J 軟件對獲得的SEM 圖像進行分析，具體分析步驟如下：將獲得的SEM 圖像在Image J 軟件中打開，選中原圖進行尺寸標定，在尺寸設置中輸入實測的單位和尺寸，然后在原圖上選中不包括設備信息、標尺的區域，點擊裁剪得到需要分析的圖像；在進行表面孔隙率分析時，首先點擊工具欄中的分析選項，設置測量值，然后點擊工具欄中的圖像調整閾值，最后分析測量得到的樣品孔隙率結果；在進行表面孔徑分析時，首先點擊工具欄中的分析選項，設置測量值，然后點擊工具欄中的圖像調整閾值，再點擊分析選項分析微粒設置，最后通過“費雷特”分析得到樣品的孔徑結果。

1.4 統計學分析

對Image J 軟件分析得到的孔徑和孔隙率進行統計學計算及分析，以離散系數Cv＜10%為測試數據的重復性較高，結果可信。

2 結果與分析

2.1 不同加速電壓下SEM圖像分析

加速電壓是SEM 的一個重要參數，場發射SEM 的加速電壓可連續調節。電壓越高，入射電子束的能量越大，產生的二次電子越多，圖像襯度越好，分辨率越高。然而，入射電子束會導致樣品出現荷電現象，電子束能量越高越明顯，從而造成樣品燒蝕或扭曲變形[18]。因此，不耐電子束轟擊的材料難以得到很清晰的SEM 圖像，例如本研究的可吸收硬膜修補材料，在高電壓下容易變形扭曲。此外，電荷累積會在SEM 圖像上顯示為高亮區域，軟件難以通過亮度區域進行精確統計，給精確分析帶來一定困難。

在不噴金的條件下，分別在0.5、1、2、5、10、15 kV電壓下拍攝的SEM 圖像如圖2 所示。加速電壓小于2 kV時，材料表面形貌保持較好，孔徑結構沒有明顯變化。然而，電壓達到5 kV 時，孔徑結構發生坍塌（圖2d 右上方區域），說明納米級有機化合物孔壁在電子束作用下結構遭到破壞，軟化變形。繼續升高電壓到10 kV 和15 kV，初始樣品均一的孔徑結構發生了明顯破碎（圖2e、2f標示區域），這可能是有機結構在高強度的電子束作用下發生了燒蝕所致。因此，生物樣品表面受到較高電壓的灼燒和電子束的轟擊時，樣品形貌出現扭曲變形，無法得到清晰的圖像，不利于準確地進行孔徑和孔結構分析。在低于2 kV 時，SEM 圖像形貌較完整，但是清晰度和分辨率仍需改善。需要注意的是，圖2b、2d 左上區域亮度明顯強于其他區域，這很可能是產生了荷電效應所致。

圖2 不噴金樣品在不同加速電壓下的SEM圖像

2.2 樣品噴金后結果分析

樣品噴金可以很好地解決電荷累積問題，有效提升材料耐受的電子束強度，顯著提升SEM 圖像的分辨率[16]。噴金條件下，分別在0.5、1、2、5、10、15 kV 電壓下拍攝的SEM 圖像如圖3 所示。通過噴金，樣品的荷電效應明顯減少，表現出較好的耐熱和耐受電子束轟擊的能力，即使在15 kV 電壓時依然能得到較清晰的圖像，且材料表面結構沒有被破壞，圖像亮度均一，不存在電荷集聚現象。

圖3 噴金樣品在不同加速電壓下的SEM圖像

樣品噴金后在進行SEM 拍攝時，會將表面聚集的大量電荷傳導轉移，減少了荷電現象，提高了樣品耐受電子束轟擊的能力，但是鍍金層也會掩蓋樣品表面的部分細節。在觀察此類樣品時，使用較低的加速電壓直接觀察樣品，會得到表面細節更加豐富、輪廓邊緣更加清楚的表面形貌[19]。綜合考慮樣品電子轟擊的耐受性和清晰度，本文建議使用場發射SEM 觀察此類材料時選擇1 kV 或更低的加速電壓。

2.3 采用Image J軟件結果分析

本文采用Image J 軟件分別對未噴金和噴金樣品的孔結構進行分析。對未噴金樣品，1 kV 加速電壓下的SEM 圖像（圖4a）使用Image J 軟件分析得到的孔隙率如圖4b 所示，其中黑色部分為軟件分析的孔，與SEM圖像分析結果相近。相對于人工統計計算的繁瑣，使用Image J 軟件統計結果更加快捷方便。利用Image J軟件分析樣品的孔隙率，得出該SEM 圖像的孔隙率為58.6%。值得注意的是，SEM 圖像的高亮區域（圖4a紅色方框區域）在軟件分析中并沒有作為孔存在的區域（圖4b、4d 的紅色方框區域），這說明在電荷集聚區域，現有的Image J 軟件還不能有效地進行統計分析。材料在1 kV 加速電壓下的孔徑分布圖如圖4c 所示，與SEM圖像接近。利用Image J 軟件分析樣品的孔徑，得出該SEM 樣品的孔徑最小值為2 μm，最大值為204 μm，平均值為12 μm。

圖4 1 kV未噴金樣品的SEM圖像（a）、使用Image J軟件分析得到的孔隙率圖（b）、Image J軟件分析得到的孔徑分布結果圖（c）和使用Image J軟件分析得到的孔徑圖（d）

噴金樣品在15 kV 加速電壓下的SEM 圖（圖5a）的孔徑分析如圖5b、5d 所示。15 kV 加速電壓下，圖像亮度和清晰度均有較大提升，解決了電荷集聚現象，具有更精確的統計結果。圖5c 的孔徑分布結果顯示，該樣品孔徑最小值為2 μm，最大值為207 μm，平均值為14 μm。

圖5 15 kV噴金樣品的SEM圖像（a）、使用Image J軟件分析得到的孔隙率圖（b）、Image J軟件分析得到的孔徑分布結果圖（c）、使用Image J軟件分析得到的孔徑圖（d）

通過對未噴金樣品和噴金樣品的孔徑結果進行分析可知，在孔徑分布方面，噴金樣品和未噴金樣品的統計結果差別不大。在拍攝時選擇合適的加速電壓，樣品則不必采用噴金方式，可降低測試過程檢測費用，節省時間。但是如果對尺寸要求較嚴格，則可采用適度噴金方式，提高膠原蛋白材料耐受電壓轟擊的能力，減少不導電樣品的荷電現象，提高測試結果的準確性。

為了驗證SEM 圖片和Image J 方法測試結果的有效性，對同一樣品隨機選取不同區域區域的孔結構進行測試，測試數據如表1 所示，均為1 kV 加速電壓下在未噴金樣品上采集的數據。不同區域采集的平均孔隙率為50.9%，孔隙率Cv為8.6%＜10%；平均孔徑為11.9 μm，孔徑Cv為6.7%＜10%，說明上述測試方法測試數據的重復性較高，結果可信。能夠作為相關樣品孔徑分析的檢驗方法。

表1 1 kV加速電壓下，同一樣品不同區域的孔隙率孔徑分析數據

膠原蛋白材料密度小，導電性差，較高電壓下樣品受電子束轟擊易塌陷變形，而選擇合適的加速電壓可以減少荷電現象，獲得細節豐富、輪廓清晰的微觀形貌[18]。樣品在噴金后其耐受電子束轟擊的能力得到了提高，在較低加速電壓和較高加速電壓的情況下，均可獲得更加清晰的微觀結構。使用Image J 軟件可分析所得圖像的孔隙率和孔徑分布，該方法克服了壓汞法和氣體吸附法無法對該類材料孔結構進行檢測的缺點，減少了人工理論計算的繁瑣步驟，節省了科研人員的時間和經濟成本，且方法有效可行。

但本方法仍存在一些不足之處：使用Image J 軟件分析的SEM 圖像是二維圖像，對于一些三維孔結構參數，如孔容積無法獲得[20]；另外，有些膠原蛋白材料含有水分[21]，無法直接使用SEM 進行觀察，而樣品干燥后其微觀結構可能已被改變，對于該類材料孔結構的評價仍存在一定的困難。

3 討論與總結

本研究針對可吸收膠原蛋白材料耐受電壓有限、導電性差、在不噴金條件下易發生電荷積聚和表面燒蝕的問題，提出了利用場發射SEM 結合Image J 軟件表征該類材料微觀結構的方法。選擇合適的加速電壓，可以得到較清晰的SEM 圖像；噴金后，樣品導電性和耐電子束轟擊性能顯著提升，可以在較高加速電壓下獲得更清晰的圖像，有利于對孔徑結構進行分析。利用Image J 軟件，可對可吸收膠原蛋白材料的SEM 圖像進行定量分析。實際測試中，使用場發射SEM 拍攝不噴金樣品的情況下，選用低電壓的方式即可滿足大部分孔徑結構分析需求，在個別尺寸要求嚴格的情況下可采用適當噴金。

綜上所述，SEM 圖像和Image J 軟件結合可以直觀地分析可吸收膠原蛋白材料的孔的結構特性（包括孔隙率、孔徑等信息），解決相關標準中方法缺失的問題，為研究該材料的臨床應用提供數據支持。