基于生信分析探索FOSL1對肝癌索拉非尼治療抵抗的影響

范綺雨 趙文靜 劉繼斌 刁迅 馬娜 吳江熙 朱衛(wèi)華

[摘 ? 要] ? 目的：探究FOS樣抗原1（FOS-like antigen 1，F(xiàn)OSL1）在肝癌組織中的表達及其對索拉非尼治療抵抗的影響。方法：從公共數(shù)據(jù)庫中獲取數(shù)據(jù)進行WGCNA分析，對獲取的差異表達基因（differentially expressed genes，DEGs）進行GO功能富集和KEGG通路富集分析。選取血管生成通路差異表達基因，采用STRING數(shù)據(jù)庫建立PPI網(wǎng)絡(luò)，使用MCODE插件提取排名前7位的關(guān)鍵基因。在人類蛋白質(zhì)圖譜網(wǎng)站對這7個關(guān)鍵基因在肝癌血管內(nèi)皮細胞表達情況進行篩選。采用Western blot法檢測人微血管內(nèi)皮細胞-1（human microvascular endothelial cells-1，HMEC-1）及肝癌血管內(nèi)皮細胞（tumor-derived endothelial cells，TEC）中FOSL1的表達，CCK-8法檢測HMEC-1及TEC細胞對索拉非尼敏感性，免疫組化檢測腫瘤組織及正常肝組織中FOSL1表達。結(jié)果：GO功能富集分析圖和KEGG通路富集分析圖顯示“索拉非尼抵抗”和“索拉非尼不抵抗”患者DEGs主要富集在管腔形成和血管生成等通路，KEGG通路主要富集在Wnt信號通路和VEGF信號通路。WGCNA分析得到關(guān)鍵模塊，通過對關(guān)鍵模塊基因篩選，最終得到JUND、JUNB、IL17RC、IL17RA、IL17F、IL1B、FOSL1 7個關(guān)鍵基因，其中FOSL1在血管生成中發(fā)揮重要作用。通過人類蛋白質(zhì)圖譜網(wǎng)站，發(fā)現(xiàn)FOSL1在肝臟各類細胞中表達，但在內(nèi)皮細胞中表達較高。Western blot檢測顯示，F(xiàn)OSL1在TEC細胞中的表達水平明顯高于HMEC-1細胞。免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織中FOSL1高表達，正常肝組織中FOSL1表達水平較低。CCK-8法檢測顯示，HMEC-1細胞對索拉非尼較敏感，而TEC細胞對索拉非尼不敏感。結(jié)論：FOSL1在肝癌血管內(nèi)皮細胞中高表達，可能與促進血管內(nèi)皮細胞增殖及索拉非尼治療抵抗相關(guān)。

[關(guān)鍵詞] ? FOS樣抗原1；肝癌；索拉非尼；生信分析；藥物抵抗

[中圖分類號] ? R735.7 [文獻標志碼] ? A [DOI] ? 10.19767/j.cnki.32-1412.2024.01.004

Exploring the effect of FOSL1 on sorafenib resistance

in liver cancer based on bioinformatics analysis

FAN Qiyu， ZHAO Wenjing， LIU Jibin， DIAO Xun， MA Na， WU Jiangxi， ZHU Weihua

（Affiliated Tumor Hospital of Nantong University/Nantong Tumor Hospital， Jiangsu 226361）

[Abstract] ? Objective：To investigate the expression of FOS-like antigen 1（FOSL1） in liver cancer and the effect of FOSL1 on sorafenib resistance. Methods： Obtain data from public databases for WGCNA analysis， and perform GO functional enrichment and KEGG pathway enrichment analysis on the differentially expressed genes （DEGs） obtained. Select differentially expressed genes in the angiogenesis pathway， establish a PPI network using the STRING database， and extract the top 7 key genes using the MCODE plugin. Screen the expression of these 7 key genes in liver cancer endothelial cells on the Human Protein Atlas website. Western blot was used to detect the expression of FOSL1 in human microvascular endothelial cell-1 （HMEC-1） and tumor-derived endothelial cells （TEC）， CCK-8 method was used to detect the sensitivity of HMEC-1 and TEC cells to sorafenib， and immunohistochemistry was used to detect the expression of FOSL1 in tumor tissue and normal liver tissue. Results： GO functional enrichment analysis and KEGG pathway enrichment analysis showed that DEGs in patients with “sorafenib resistance” and “sorafenib non resistance” were mainly enriched in luminal formation and angiogenesis pathways， while KEGG pathway was mainly enriched in Wnt and VEGF signaling pathways. WGCNA analysis identified key modules， and ultimately identified JUND， JUNB， IL17RC， IL17RA， IL17F， IL1B， and FOSL1 7 key genes through screening of key module genes， among which FOSL1 played an important role in angiogenesis. It was found that FOSL1 was expressed in various liver cells through the Human Protein Atlas website， but more higher in endothelial cells. Western blot analysis showed that the expression level of FOSL1 in TEC cells was significantly higher than that in HMEC-1 cells. Immunohistochemical staining revealed high expression of FOSL1 in tumor tissue and low expression in normal liver tissue. CCK-8 assay showed that HMEC-1 cells were sensitive to sorafenib， while TEC cells were not sensitive to sorafenib. Conclusion： FOSL1 is highly expressed in liver cancer endothelial cells， which may be associated with promoting endothelial cell proliferation and sorafenib resistance.

[Key words] ? FOS like antigen 1; liver cancer; sorafenib; bioinformatics analysis; drug resistance

肝細胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是世界范圍內(nèi)高發(fā)的惡性腫瘤，據(jù)2020年流行病學(xué)統(tǒng)計，我國肝癌新發(fā)病例約占全球45.3%，位居全球第一，是嚴重影響國民健康的重大公共問題[1]。肝細胞肝癌多見于慢性肝病合并肝硬化患者，是一種以血供動脈化和血管異常為特征的高度血管化的實體瘤。肝癌中血管生成狀態(tài)與疾病進展、預(yù)后密切相關(guān)，抗血管生成已成為有前景的新療法。雖然抗血管內(nèi)皮生長因子受體（vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR）藥物已在肝癌治療中廣泛運用，但對患者預(yù)后的改善仍有限，部分患者因產(chǎn)生治療抵抗出現(xiàn)疾病反復(fù)復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和病情惡化。索拉非尼（sorafenib）是一種靶向生長信號和血管生成的合成化合物，越來越多的學(xué)者認為腫瘤干細胞表型、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）或?qū)θ毖醐h(huán)境的適應(yīng)等均可導(dǎo)致對索拉非尼的耐藥，但具體機制不甚明確。因此，探索對索拉非尼耐藥的機制對提高晚期肝癌患者的生存率具有重要意義。

FOS樣抗原1（FOS-like antigen 1，F(xiàn)OSL1）是體內(nèi)編碼FOSL1蛋白的基因，又稱為FOS相關(guān)抗原1（Fos-related antigen1，F(xiàn)ra-1），是位于染色體11q13原癌基因Fra-1的表達產(chǎn)物，與Jun家族表達產(chǎn)物構(gòu)成異源二聚體AP-1，參與各種生長因子激活的信號級聯(lián)，其中包括血管內(nèi)皮生長因子[2]。本研究通過公共數(shù)據(jù)庫獲取肝細胞肝癌和索拉非尼相關(guān)數(shù)據(jù)，獲取血管生成通路差異基因，提取出7個關(guān)鍵基因。采用Western blot檢測人微血管內(nèi)皮細胞-1（human microvascular endothelial cells-1，HMEC-1）及肝癌血管內(nèi)皮細胞（tumor-derived endothelial cells，TEC）中FOSL1表達，免疫組化染色檢測肝癌組織中FOSL1表達，CCK-8法檢測HMEC-1細胞及TEC細胞對索拉非尼的敏感性，探究肝癌患者中FOSL1表達水平與抗血管生成治療抵抗的關(guān)系。

1 ? 資料與方法

1.1 ? 公共數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)分析

1.1.1 ? 數(shù)據(jù)獲取：使用NCBI GEO（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）數(shù)據(jù)庫，對關(guān)鍵詞“HCC”和“sorafenib”進行檢索。選取GSE109211數(shù)據(jù)集用于分析，GSE146409數(shù)據(jù)集用于驗證。

1.1.2 ? 數(shù)據(jù)處理及差異表達基因提取：GEO數(shù)據(jù)庫為國際公共存儲庫，收錄全球范圍的微陣列芯片和高通量基因組數(shù)據(jù)。本研究從GEO數(shù)據(jù)庫中下載基因表達譜數(shù)據(jù)集，采用R統(tǒng)計軟件進行差異表達基因（differentially expressed genes，DEGs）分析，隨后以|差異倍數(shù)（Fold Change）|≥2.0（P<0.01），錯誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）<0.01為標準進一步篩選差異基因。使用R軟件ggplot2包和ComplexHeatmap分別繪制火山圖和熱圖，顯示顯著調(diào)控的差異基因。

1.1.3 ? WGCNA構(gòu)建共表達網(wǎng)絡(luò)：加權(quán)基因共表達網(wǎng)絡(luò)分析（weighted gene co-expression network analysis，WGCNA）將基因聚類到不同模塊，揭示模塊與疾病特征之間的關(guān)系。本研究使用R軟件中的“WGCNA”程序包，以GSE109211為研究對象，以抵抗組和不抵抗組為臨床特征，建立WGCNA共表達系統(tǒng)。為了將具有相似表達的基因歸類為相同模塊，本研究進行分級聚類，基因樹圖的最小數(shù)值（基因組）為50。為了進一步分析模塊，對模塊特征基因的差異性進行計算，為模塊樹圖選擇了一條切割線，并合并了一些模塊。最終獲得9個共表達模塊，其中灰色模塊是無法分配給任何模塊的基因模塊。

1.1.4 ? 關(guān)鍵功能通路富集分析及HUB基因提取：對相關(guān)度較高的青色模塊基因進行GO功能富集和KEGG通路富集分析，選取血管生成通路差異基因，采用STRING（https：//string-db.org）數(shù)據(jù)庫建立PPI網(wǎng)絡(luò)。將得到的基因?qū)隒ytoscape軟件中，使用MCODE插件提取排名前7位的關(guān)鍵基因進行分析。

1.1.5 ? 關(guān)鍵基因進一步篩選及相關(guān)驗證分析：在人類蛋白質(zhì)圖譜網(wǎng)站（https：//www.proteinatlas.org/）對這7個關(guān)鍵基因在肝癌血管內(nèi)皮細胞表達情況進行篩選，并在TISCH數(shù)據(jù)庫中選取肝癌數(shù)據(jù)集GSE146409進行單細胞分析驗證關(guān)鍵基因。

1.2 ? 實驗方法

1.2.1 ? 試劑：ECM培養(yǎng)基（美國Scien Cell公司），索拉非尼（美國Med Chem Express公司），F(xiàn)OSL1及Tubulin（美國Abcam公司），CCK-8細胞增殖分析試劑盒（中國碧云天公司），堿性修復(fù)液（中國Biosharp公司），免疫組化試劑盒（美國Sigma公司）。

1.2.2 ? 細胞培養(yǎng)：HMEC-1細胞購自優(yōu)寧維公司，TEC細胞提取自肝細胞癌微環(huán)境中的腫瘤微血管內(nèi)皮細胞（專利號：ZL 201510684793.8），培養(yǎng)于含5%胎牛血清和雙抗的ECM培養(yǎng)基中，置于37 ℃，5%CO2恒溫細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.2.3 ? Western blot檢測：采用RIPA裂解提取HMEC-1及FACS TEC細胞總蛋白，BCA測定蛋白濃度。制備上樣緩沖液，電泳85 min后轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉120 min。1 ∶ 800稀釋的兔源一抗（FOSL1、tubulin）孵育，4 ℃過夜。次日TBST洗膜3次后，二抗室溫孵育1 h，TBST再洗膜3次，最后使用化學(xué)發(fā)光檢測試劑顯影。

1.2.4 ? CCK-8法檢測細胞活力：HMEC-1和TEC細胞消化后，以3×103/mL密度接種至96孔板，待細胞貼壁后，棄去完全培養(yǎng)基，每孔加入200 μL基礎(chǔ)培養(yǎng)基。次日加入不同濃度索拉非尼（0、0.1、0.5、2.5、12.5 μg/mL）繼續(xù)培養(yǎng)48 h，每孔加入10 μL CCK-8試劑孵育2 h。經(jīng)酶標儀測定各孔450 nm處光密度，計算細胞活力。

1.2.5 ? 免疫組化：將脫蠟組織切片水化清洗后，置于修復(fù)液中加熱，冷卻至室溫，再用阻斷劑封閉20 min。清洗后每張片子滴加200 μL稀釋的一抗（1 ∶ 400），置于4 ℃冰箱孵育過夜。第二天孵育二抗，進行DAB染色及蘇木素染色，脫水，中性樹脂封片。本研究所使用的肝癌組織及正常肝組織石蠟標本由南通大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院提供。

2 結(jié) ?果

2.1 ? 差異表達基因的鑒定與通路富集分析 ? 原始數(shù)據(jù)歸一化處理后，分為藥物抵抗組和藥物不抵抗組，進行l(wèi)imma分析，以|Fold Change|≥2.0（P<0.01）、FDR<0.01為標準鑒定出10 626個DEGs，共包括6 047個明顯上調(diào)基因和4 579個明顯下調(diào)基因（圖1A）。圖1B和圖1C分別為差異基因的KEGG通路富集分析圖和GO功能富集分析圖，可見“索拉非尼抵抗”和“索拉非尼不抵抗”患者的DEGs主要富集在管腔形成和血管生成等通路上，KEGG通路主要富集在Wnt信號通路和VEGF信號通路上。

2.2 ? 加權(quán)基因共表達網(wǎng)絡(luò)分析 ? 使用“WGCNA”包的“Pick Soft Threshold”功能過濾，將功率參數(shù)范圍調(diào)整為1～30，使用功率b=12作為建立無標度網(wǎng)絡(luò)的軟閾值。我們將閾值設(shè)置為0.25和模塊最小數(shù)量設(shè)置為50，再對集群中的類似模塊進行合并，得到模塊特征向量圖，合并類似模塊后共得到9個模塊，這些模塊各自包括表達特征相似的所有基因。隨后進行樣本及基因聚類。

為了進一步分析這些模塊基因的特性，本研究對這些模塊基因是否與藥物抵抗的臨床特征相關(guān)進行分析。如圖2A所示，青色模塊相關(guān)性較高，該模塊包括1453個基因，此外，我們對該模塊中的每個節(jié)點進行了基因與模塊相關(guān)性（module membership，MM）及基因與性狀相關(guān)性（gene significance，GS）分析，繪制相關(guān)性散點圖，其相關(guān)系數(shù)為0.71。

2.3 ? 關(guān)鍵基因篩選 ? 將青色模塊的DEGs分別進行KEGG和GO富集分析，如圖2B所示，GO功能富集分析中排名靠前的包括脈管系統(tǒng)發(fā)育、血管發(fā)育及血管生成通路，隨后提取這些通路的31個基因進行下一步篩選。為了明確這些差異基因之間的相互關(guān)系，將這些基因在STRING數(shù)據(jù)庫中構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，導(dǎo)出構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)后的基因，并導(dǎo)入Cytoscape軟件（v3.9.1）中繪制PPI同心圓，然后通過MCODE插件進行subnetwork分析后得到結(jié)果。如圖3A所示，中心7個紅色三角形代表hub gene，包括JUND、JUNB、IL17RC、IL17RA、IL17F、IL1B、FOSL1。通過人類蛋白質(zhì)圖譜網(wǎng)站對這7個hub gene在肝癌內(nèi)皮細胞中的表達進行比較，發(fā)現(xiàn)IL17RA、FOSL1、IL1B基因在肝癌內(nèi)皮細胞中表達較高。圖3B顯示FOSL1在肝臟各類細胞中均有表達，但在內(nèi)皮細胞中表達較高。

2.4 ? 單細胞分析驗證關(guān)鍵基因 ? 在TISCH數(shù)據(jù)庫中選取肝癌數(shù)據(jù)集GSE146409進行單細胞分析，并鑒定細胞類型。如圖4A所示，將細胞分為10個集群，不同集群大致分為內(nèi)皮細胞、上皮細胞、纖維母細胞、肝細胞等6種細胞。其中集群1為內(nèi)皮細胞，集群2和5為上皮細胞，集群6為纖維母細胞。最后分析IL17RA、FOSL1、IL1B 3個hub gene在該數(shù)據(jù)集不同細胞中的表達水平，驗證了轉(zhuǎn)錄因子FOSL1在肝癌內(nèi)皮細胞中表達水平最高（圖4B），表明FOSL1在肝細胞肝癌血管生成中具有重要作用。

2.5 ? FOSL1在TEC細胞中高表達且TEC細胞對藥物不敏感 ? Western blot檢測結(jié)果顯示，TEC細胞中FOSL1表達水平明顯高于HMEC-1細胞（圖5A）。免疫組化染色顯示，肝癌組織中FOSL1高表達，細胞核FOSL1抗體強染色，細胞質(zhì)染色較淺，而正常肝組織中FOSL1表達水平較低（圖5B）。CCK-8法檢測結(jié)果顯示，HMEC-1細胞對索拉非尼較敏感，而TEC細胞對索拉非尼不敏感（圖5C）。

3 ? 討 ? ? ?論

肝癌是高度血管化的實體瘤，血管生成是肝細胞肝癌發(fā)生發(fā)展中的關(guān)鍵過程，新生血管可為腫瘤增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移提供必要物質(zhì)條件。目前，抑制肝癌血管生成已成為治療靶點，然而仍有部分患者因藥物耐藥導(dǎo)致治療效果較差，因此，探究肝癌抗血管生成治療耐藥具有重要意義。

本研究選取索拉非尼耐藥數(shù)據(jù)集進行分析，差異基因GO通路主要富集在血管生成及血管發(fā)育通路。為了進一步篩選關(guān)鍵基因，對DEGs進行WGCNA分析，得到關(guān)鍵模塊，通過對關(guān)鍵模塊基因的篩選，最終得到JUND、JUNB、IL17RC、IL17RA、IL17F、IL1B、FOSL1 7個關(guān)鍵基因，其中JUNB、JUND及FOSL1屬于AP-1家族分子。有研究表明，AP-1轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長因子的表達和血管內(nèi)皮細胞對血管內(nèi)皮生長因子的反應(yīng)[3-4]。通過控制JUNB在tip細胞中的時空誘導(dǎo)，可控制血管的伸長，表明JUNB是血管方向性的決定因素[5]。JUND可通過促進MAPRE2轉(zhuǎn)錄而導(dǎo)致食管鱗癌細胞增殖和血管生成[6]。EVELLIN等[7]發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細胞中FOSL1可調(diào)控細胞表面關(guān)鍵分子的表達，從而調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞的黏附及運動，在血管生成中發(fā)揮重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)，小鼠FOSL1同源基因Fosl1是胚胎外組織血管形成所必需的，但FOSL1在血管生成中的作用機制尚不明確[8]。有研究表明，F(xiàn)OSL1在頭頸部鱗狀細胞癌中高表達，通過FOSL1-SE驅(qū)動的轉(zhuǎn)錄程序促進腫瘤轉(zhuǎn)移，并促進上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化維持其干性[9]。缺乏核心調(diào)控回路關(guān)鍵成分FOSL1會減少骨肉瘤腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，并且藥物抑制CRC相分離導(dǎo)致轉(zhuǎn)移抑制和對化療藥物的重新敏感[10]。

綜上所述，F(xiàn)OSL1在肝癌血管內(nèi)皮細胞中表達較高，可能與索拉非尼治療抵抗相關(guān)，進而導(dǎo)致患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移等預(yù)后不良。

[參考文獻]

[1] 陳建國，張永輝，陸建華，等. 中國肝癌預(yù)防與篩檢工作實踐及防控挑戰(zhàn)［J］. 中國腫瘤，2023，32（11）：836-847.

[2] TALOTTA F，CASALINO L，VERDE P. The nuclear oncoprotein Fra-1：a transcription factor knocking on therapeutic applications door［J］. Oncogene，2020，39：4491-4506.

[3] SHIH S C，CLAFFEY K P. Role of AP-1 and HIF-1 transcription factors in TGF-beta activation of VEGF expression［J］. Growth Factors，2001，19（1）：19-34.

[4] WANG S，LU J W，YOU Q S，et al. The mTOR/AP-1/VEGF signaling pathway regulates vascular endothelial cell growth［J］. Oncotarget，2016，7（33）：53269-53276.

[5] YOSHITOMI Y，IKEDA T，SAITO-TAKATSUJI H，et al. Emerging role of AP-1 transcription factor JunB in angiogenesis and vascular development［J］. Int J Mol Sci，2021，22（6）：2804.

[6] ZHANG D，PAN G，CHENG N，et al. JUND facilitates proliferation and angiogenesis of esophageal squamous cell carcinoma cell via MAPRE2 up-regulation［J］. Tissue cell，2023，

81：102010.

[7] EVELLIN S，GALVAGNI F，ZIPPO A，et al. FOSL1 controls the assembly of endothelial cells into capillary tubes by direct repression of αv and β3 integrin transcription［J］. Mol cell biol，2013，33（6）：1198-1209.

[8] GALVAGNI F，ORLANDINI M，OLIVIERO S. Role of the AP-1 transcription factor FOSL1 in endothelial cells adhesion and migration［J］. Cell Adh Migr，2013，7（5）：408-411.

[9] ZHANG M，HOYLE R G，MA Z K，et al. FOSL1 promotes metastasis of head and neck squamous cell carcinoma through super-enhancer-driven transcription program［J］. Mol Ther，2021，29（8）：2583-2600.

[10] LU B，ZOU C Y，YANG M L，et al. Pharmacological inhibition of core regulatory circuitry liquid-liquid phase separation suppresses metastasis and chemoresistance in osteosarcoma［J］. Adv Sci，2021，8（20）：e2101895.

[收稿日期] 2024-01-20

（本文編輯 ? 趙喜）