活細胞應激反應過程中線粒體和核仁微環境動力學的熒光壽命成像研究*

楊志剛 劉穎超 張仕青 羅瑞鑒 趙需謙 連加榮 屈軍樂

(深圳大學物理與光電工程學院,光電子器件與系統教育部/廣東省重點實驗室,深圳 518060)

核仁和線粒體在維持細胞平衡發揮重要作用,研究其生理過程有助于深入了解生物學功能.本文采用一種紅色熒光的芘羅丹明熒光探針在不同條件下靶向標記細胞線粒體和核仁.通過激光共聚焦成像和熒光壽命成像技術分析HeLa 細胞在光照和藥物刺激下細胞凋亡的形態變化,并利用相圖定量分析了線粒體與核仁的微環境變化,確定在穩態HeLa 細胞中探針標記到的線粒體的平均熒光壽命約為3.65 ns,線粒體黏度約為66×10-3 Pa·s.在激光光照后,探針標記到HeLa 細胞線粒體的熒光壽命降至3.61 ns,對應線粒體黏度增至約131×10-3 Pa·s;使用紫杉醇和秋水仙堿誘導細胞凋亡,觀察到探針標記于HeLa 細胞核仁的熒光壽命先增加后降低,反映了在HeLa 細胞凋亡過程中核仁微環境的變化,證明HeLa 細胞在非穩態情況下核仁和線粒體的功能變化,為線粒體和核仁功能障礙相關疾病研究提供了新的研究方法.

1 引言

核仁被稱為“細胞的核糖體工廠[1],主要由纖維中心、致密纖維組分和顆粒組分構成[2],是核糖體合成和RNA 組裝的場所[3],與細胞生長和增殖密切相關,核仁的異常通常導致疾病如癌癥的發生[4,5].同時,黏度作為細胞微環境的重要參數之一,為維持細胞器生理過程的正常運行提供保障,對細胞器結構和功能發揮著顯著的影響,細胞微環境黏度變化對RNA 的擴散和運動影響深遠,甚至可以改變活細胞中RNA 的功能[6-8].此外,線粒體作為細胞中重要的“能量工廠”,受到外界刺激損傷會發生黏度變化[9],線粒體異常是代謝或神經退行性疾病等發生發展的重要標志[10-17].在阿爾茲海默癥等神經退行性疾病中,腦組織中神經細胞線粒體黏度明顯增大[18],并且核仁的形態也與神經退行性疾病密切相關[19,20].此外,DNA 損傷、熱刺激、病毒入侵等各種壓力刺激下,核仁的結構會發生如崩解等形態學變化[20,21].因此,研究線粒體和核仁形態變化和量化局部黏度值將有助于深入研究核仁和線粒體的生物學功能.

近年來,不同熒光探針被用于亞細胞結構標記與成像,其中有機染料作為構建熒光探針的主要部分[22-25],相比于熒光蛋白、納米材料等在細胞器標記與成像方面具有顯著優勢.有機熒光分子探針具有體積小、成像分辨率高等優勢可用于活細胞線粒體和核仁的標記成像及外界刺激下的應激反應研究,如線粒體微環境黏度定量變化[26-28],線粒體和核仁之間可逆遷移成像,監測在紫外光照射、秋水仙堿及紫杉醇等誘導細胞凋亡過程中線粒體膜電位變化[8].Dutta 等[1]研究線粒體和核仁在非偶聯氧化磷酸化、誘導細胞凋亡和細胞周期停滯過程中微黏度變化,指出同時存在于線粒體和核仁的特定蛋白引導了這兩種細胞器之間的相互關聯.對線粒體和核仁受到上述刺激產生應激反應的定量研究有利于深入了解其相關生物學功能.因此,開展基于小分子熒光探針的線粒體與核仁成像研究,對局部環境中線粒體和核仁形態變化進行實時監測和定量分析具有重要意義.

在本工作中,為了跟蹤線粒體和核仁并量化細胞應激反應過程中線粒體和核仁的局部環境變化,采用了一種基于芘羅丹明熒光染料 (RH) 作為標記線粒體與核仁的標記探針,RH 具有紅色熒光,在不同實驗條件下可以靶向標記活細胞的線粒體和核仁,通過熒光成像和熒光壽命成像(fluorescence lifetime imaging microscopy,FLIM) 實時監測線粒體和核仁形態及微環境變化.此外,通過FLIM 定量線粒體黏度可以研究細胞應激反應過程中線粒體微環境的變化,同時在研究過程中應用相圖技術進行定量分析[29],為更好地了解細胞應激反應中線粒體和核仁微環境變化在維持細胞穩態中的作用提供研究手段.

2 實驗測試與熒光成像材料

2.1 實驗試劑

ER-Tracker Blue,Lyso-Tracker Green,Mito-Tracker Deep Red FM 和Hochest 33342 購自美國Invitrogen 公司;胎牛血清 (fetal bovine serum,FBS) 購自美國Sigma 公司,雙抗 (penicillin streptomycin,PS),DMEM 培養基、磷酸鹽緩沖鹽水(phosphate buffer saline,PBS) 和其他細胞培養試劑購自美國Gibco 公司;小牛胸腺DNA、酵母RNA、DNase I 和RNase A 購自美國Aldrich公司.

2.2 熒光探針測試儀器及制備方法

RH 探針在不同溶劑、不同極性、不同pH 值和黏度環境中的吸收、發射光譜和熒光壽命研究,分別使用紫外可見分光光度計 (GBC Cintra2020)和模塊化熒光光譜儀 (HORIBA Fluorolog-3) 記錄紫外可見吸收光譜和熒光發射光譜及熒光壽命.不同極性的溶劑由四氫呋喃和水按體積分數遞增10%的比例混合而成,不同黏度溶劑由甘油和甲醇按照體積分數遞增10%的比例混合制備而成,不同pH 值的溶劑由在去離子水中滴加鹽酸或氫氧化鈉溶液配制而成.參考Zhang 等[30]工作,吸收光譜所用探針濃度為5 μmol/L,發射光譜和熒光壽命所用探針濃度均為1 μmol/L.染料分子的熒光信號比吸收光譜信號靈敏,因此,一般吸收光譜使用的濃度比熒光光譜的高.吸收光譜使用的濃度如果過低,則吸光度小,光譜波動較大,導致的誤差也較大.

2.3 細胞培養和共定位實驗

將HeLa 細胞(人宮頸癌細胞)、COS-7 細胞(非洲綠猴腎成纖維細胞)和ID-8 細胞(小鼠卵巢上皮癌細胞)以約1.5×105的密度接種在玻璃底培養皿上,添加10% FBS 和1% PS 的DMEM 混合培養基,將細胞皿置于5% CO2,37 ℃的細胞培養箱中培養24 h,待細胞密度達到60%后,將細胞生長狀態良好的細胞皿取出進行下一步實驗.將HeLa 細胞分別與RH 探針、商品化的內質網探針、溶酶體探針、線粒體探針和細胞核探針共孵育,置于細胞培養箱中培養30 min.其中,RH 探針(0.5 μmol/L) 分別與商品化內質網探針ERTracker Blue (0.5 μmol/L),溶酶體探針Lyso-Tracker Green (0.05 μmol/L) 和線粒體探針(Mito-Tracker Deep Red FM) (0.5 μmol/L) 共孵育,RH 探針 (2 μmol/L) 和商用細胞核探針Hoechst 33342 (0.2 μmol/L) 共孵育.細胞成像前,用PBS洗滌兩次后,用于共聚焦激光掃描顯微 (confocal laser scanning microscope,CLSM) 成像 (Nikon A1,60×油鏡,數值孔徑1.49).然后分別采集以下通道的圖像: 425—475 nm (ER-Tracker Blue 和Hoechst 33342),500—550 nm (Lyso-Tracker Green),570—620 nm (RH),667.5—732.5 nm (Mito-Tracker Deep Red),共定位分析結果的Pearson 系數由Image J 軟件計算獲得.

2.4 核酸消化實驗

加入1 mL 的4%多聚甲醛溶液用來固定HeLa細胞,置于培養箱培養20 min,之后取出用PBS清洗兩次.固定后的細胞分別加入1 mL 的無DNase I 的RNase A (100 μg/mL) 和無RNase A 的DNase I (100 U/mL),空白對照組僅加入1 mL 的PBS,置于培養箱2 h 之后用PBS 沖洗兩次,再與RH 探針(2 μmol/L) 和Hoechst 33342 (0.2 μmol/L)共孵育30 min.細胞成像前用PBS 洗滌兩次,之后加入新的PBS,留待使用.

2.5 CLSM 成像和FLIM 成像

為了研究RH 在標記不同細胞線粒體和核仁的情況,分別將HeLa 細胞、COS-7 細胞和ID-8 細胞分別與RH (0.5,2 μmol/L) 共孵育,置于細胞培養箱中培養30 min,之后用PBS 洗滌兩次,并加入新鮮培養基,進行相應培養待用.為了研究線粒體和核仁在細胞凋亡過程中的動態變化,使用紫杉醇和秋水仙堿誘導HeLa 細胞凋亡.細胞中分別加入含100 nmol/L 紫杉醇、10 nmol/L 和100 nmol/L 秋水仙堿的培養基,然后置于培養箱中培養,其中加入秋水仙堿的置于培養箱培養30 min,加入紫杉醇的則培養0.5,1,2,4 h,之后用PBS 清洗兩次,然后用2 μmol/L 的RH 探針孵育30 min.細胞成像前用PBS 洗滌兩次,加入新鮮培養基.為了研究光照對細胞線粒體和核仁的影響,CLSM 成像過程使用“時間序列”功能采集熒光圖像.同時,使用FLIM 系統(DCS120,100倍油鏡,數值孔徑1.49) 研究線粒體在光照刺激下發生的斷裂、融合等形態變化以及核仁在紫杉醇和秋水仙堿誘導細胞凋亡情況下發生的微環境變化,使用SPCImage (8.4 版本,Becker&Hickl GmbH) 進行熒光壽命擬合和相圖分析,采用雙指數擬合.

3 結果與討論

首先,為了研究熒光探針的光物理特性,分別測試了RH 在不同溶劑極性、pH 值及不同黏度環境中的紫外吸收、熒光發射光譜和熒光衰減壽命,如圖1 所示.RH 在二氯甲烷、丙酮、甲醇等溶劑中的吸收、發射光譜變化較小,隨著溶劑極性增大,最大吸收波長 ((576±3) nm) 或發射峰值(590 nm),位移較小(圖1(a),(b)和表1);另外,進一步測試RH 在四氫呋喃與水混合溶劑中的熒光變化,隨著四氫呋喃的比例逐漸增大,溶劑的極性(介電常數)連續減小,探針的熒光發射強度變化較小,最大變化幅度不超過10%.隨著水含量的增大(＞90%),RH 的熒光強度顯著降低,可能是由于RH 在水中溶解度低,發生聚集導致熒光減弱 (見圖1(c),(d)).此外,在覆蓋細胞生理pH 值3—12的范圍內RH 的熒光壽命變化僅為0.06 ns (圖1(e),(f)),環境pH 值對RH 的熒光壽命的影響較小.相較極性和pH 的影響,RH 在不同黏度環境中的熒光強度和熒光壽命變化較大,如圖1(g)—(h)所示,隨著甘油含量的增大(甲醇與甘油混合溶劑),環境黏度從甲醇(0.6×10-3Pa·s)增至甘油(0.945 Pa·s),探針的熒光強度和熒光壽命均呈現規律下降趨勢,熒光強度降低幅度超過50%,熒光壽命從3.95 ns下降到3.45 ns,降低幅度達到0.5 ns.因此,探針RH 受到環境黏度影響更大,而可以忽略環境極性和pH 變化對探針的影響.溶劑極性對熒光壽命的影響主要包括溶劑分子介電常數、氫鍵等因素對熒光染料分子的作用.首先,RH 分子帶一個正電荷,能量比較低,溶劑的極性(介電常數)對RH 分子的影響較小;另外,RH 分子中沒有氫鍵活性結構,溶劑分子也不能與染料發生氫鍵作用,因此RH 分子對溶劑極性不敏感,環境極性對RH 探針熒光壽命的影響可以忽略.在分子設計上,我們采用芘與間氨基酚合成羅丹明衍生物,旨在構造對黏度響應的熒光探針,芘的相對振動或轉動,可以影響羅丹明衍生物的熒光效應,參照課題組以前的黏度分子轉子研究工作[27,31,32].本文采用芘作為振動部分(不能完全轉動)來調控熒光分子的熒光信號,通過分子模擬(高斯計算),在低黏度環境中,分子中芘與羅丹明衍生結構處于垂直狀態,二者之間沒有電子轉移淬滅效應,熒光壽命長,在黏度環境中,芘與羅丹明結構發生一定轉動,增強電子轉移淬滅的效應,導致熒光壽命縮短.因此,可以將探針分子的熒光壽命與環境黏度關聯用于研究微環境的黏度效應.對探針的熒光強度或熒光壽命構建與黏度的函數關系,可以通過測量熒光壽命定量分析所處環境的黏度.

圖1 熒光探針RH 光物理性能研究 (a) RH 在不同溶劑中的紫外吸收光譜;(b) RH 在不同溶劑中的熒光光譜;(c) RH 在不同比例的四氫呋喃和水混合溶劑中的發射光譜,激發波長495 nm;(d) 熒光強度與不同比例的四氫呋喃和水混合溶劑之間的關系;(e) RH 在不同pH 值溶劑環境中熒光壽命衰減曲線;(f) RH 的熒光壽命與pH 值的關系;(g) RH 在甲醇和甘油混合的黏度溶劑中的發射光譜(室溫20 ℃),激發波長495 nm;(h) 熒光強度與黏度同時取對數后的線性關系;(i) RH 在甲醇和甘油混合的黏度溶劑中的熒光衰減曲線(室溫20 ℃),熒光壽命的激發波長為456 nm;(j) RH 熒光壽命與黏度同時取對數后的線性關系Fig.1.Fluorescence spectra of RH in different solvents: (a) UV absorption spectrum of RH in different solvents;(b) fluorescence spectra of RH in different solvents;(c) the emission spectrum of RH in the mixture of tetrahydrofuran and water with an excitation wavelength of 495 nm;(d) the relationship between fluorescence intensity and different proportions of the mixture of tetrahydrofuran and water;(e) RH fluorescence lifetime decay curves of RH in solvents with different PH values;(f) relationship between the fluorescence lifetime of RH and PH value;(g) emission spectrum of RH in the viscous solvent mixed with methanol and glycerol (room temperature 20 ℃),excitation wavelength is 495 nm;(h) linear relationship between fluorescence intensity and viscosity after taking logarithm simultaneously;(i) the fluorescence attenuation curve of RH in a viscous solvent mixed with methanol and glycerol (room temperature 20 ℃),the excitation wavelength of the fluorescence lifetime is 456 nm;(j) linear relationship between fluorescence lifetime and viscosity after taking logarithm simultaneously.

表1 探針RH 在不同溶劑中的吸收發射波長及熒光壽命Table 1.Absorption,emission wavelength and fluorescence lifetime of probe RH in different solvents.

此外,還研究了探針RH 分別對DNA 與RNA的熒光滴定分析,分別獲得了RH 的熒光光譜和熒光壽命響應曲線,如圖2 所示.向RH 的水溶液中剛加入DNA 或RNA 時,RH 的發射強度均顯著下降,之后隨著DNA 或RNA 的繼續滴加,產生不同幅度的增強.可能是剛加入DNA 或RNA 時,RH 探針因正負電荷吸引被吸附到DNA 或RNA表面發生熒光淬滅(圖2(a)—(d)),隨著DNA 或RNA 的繼續增加,探針又逐漸分散并嵌入DNA或RNA 中,使得熒光強度產生增強.同樣,RH 的熒光壽命也隨著DNA 或RNA 的增加而發生相應的變化,如圖2(e)—(h)所示,RH 熒光壽命隨DNA含量增大而延長,從3.72 ns 增至5.02 ns;而RH探針與RNA 結合后壽命先由3.72 ns 降至2.97 ns,之后隨RNA 含量增大緩慢增至3.65 ns.可能因DNA/RNA 的單雙鏈結構不同,發生作用的方式也不一樣.為了進一步解釋探針的熒光變化,利用Autodocking 生物對接計算軟件分別模擬了探針RH 與DNA (CGCGATATCGCG 序 列),RNA(任選了有一個位置沒有配位的雙鏈RNA) 進行了模擬計算.結果如圖2(i),(j)所示,探針只是附著在DNA 序列表面,沒有嵌入到DNA 的大溝、小溝或堿基序列中,這種作用的結合能較高(-5.25 eV)且只有一種結合方式,可能因為探針分子位阻較大,導致探針與DNA 作用力較弱;而對配位有缺失的雙鏈RNA 序列,通過對接計算可以明顯發現,探針RH 與RNA 的作用構型有兩種,都嵌入到缺失的配位點,并且是探針帶正電荷的羅丹明部分插入RNA 中,疏水的芘基團分別伸向小溝和大溝中,結合能分別是-11.2 eV 和-11.62 eV,結合能較低,說明探針與RNA 具有較強的結合力,具有穩定的結合模式,這也相應解釋探針與DNA 和RNA 作用后的熒光與熒光壽命的變化.

圖2 探針RH (1 μmol/L) 的DNA/RNA 熒光滴定光譜及熒光壽命衰減曲線以及生物計算對接模擬探針與DNA/RNA 的結合模式 (a) RH 的RNA 熒光滴定光譜;(b) RH 的熒光強度隨RNA 濃度變化曲線;(c) RH 的DNA 熒光滴定光譜;(d) RH 的熒光強度隨DNA 濃度的變化曲線;(e) RH 的RNA 熒光滴定的熒光壽命衰減曲線;(f) RH 的熒光壽命隨RNA 濃度的變化曲線;(g) RH的分子結構模型以及RH 的DNA 熒光滴定的熒光壽命衰減曲線;(h) RH 的熒光壽命隨DNA 濃度的變化曲線,激發光波長456 nm;(i) RH 與DNA 的生物對接模擬計算;(j) RH 與RNA 的生物對接模擬計算,橫坐標為分子結合能,縱坐標為分子結構,使用開源的Windows 版Autodocking 軟件Fig.2.The DNA/RNA fluorescence titration spectrum and fluorescence lifetime decay curve of probe RH (1 μmol/L) and the binding mode of probe with DNA/RNA were simulated by biocomputation: (a) RNA fluorescence titration spectroscopy of RH;(b) the fluorescence intensity of RH varies with the concentration of RNA;(c) DNA fluorescence titration spectroscopy of RH;(d) the fluorescence intensity of RH varies with the concentration of DNA;(e) fluorescence lifetime decay curve for RNA fluorescence titration of RH;(f) the fluorescence lifetime of RH varies with RNA concentration;(g) molecular structure model of RH and fluorescence lifetime decay curve for DNA fluorescence titration of RH;(h) the fluorescence lifetime of RH varies with DNA concentration;excitation light wavelength 456 nm;(i) biological docking simulation of RH and DNA;(j) biological docking simulation of RH and RNA;where the horizontal coordinate is the molecular binding energy,and the vertical coordinate is the molecular structure,using the open source Windows version of Autodocking software.

為了研究探針在細胞內的定位情況,分別采用兩種不同濃度的RH (0.5,2 μmol/L)與HeLa 細胞進行孵育,經過30 min 的培養后,通過復染與共定位成像發現RH 探針在較低濃度 (0.5 μmol/L)時主要定位到線粒體上;在高濃度(2 μmol/L) 時,除了定位線粒體也明顯定位在細胞核仁.

圖3(a)—(l)分別是商用溶酶體、內質網、線粒體探針和RH 探針標記HeLa 細胞的熒光成像及迭加圖和Pearson 相關系數分析;RH 探針在低濃度 (0.5 μmol/L) 情況下與線粒體探針的Pearson共定位系數最高(達到0.89) (圖3(i)—(l)),高于與溶酶體探針的共定位系數(0.23) (圖3(a)—(d))和與內質網探針的共定位系數(0.50) (圖3(e)—(h)).由此說明RH 探針在低濃度(0.5 μmol/L) 情況下優先標記到活細胞內的線粒體.當使用高濃度(2 μmol/L) 時,先和Hoechst 探針一起與HeLa 細胞共孵育,RH 探針標記的細胞核區域與Hoechst探針標記的區域重合(圖3(m)—(p)),說明RH 探針在高濃度時除了標記線粒體外,還能標記細胞核內的結構.

圖3 共定位實驗 (a)—(c) RH 探針 (0.5 μmol/L) 和溶酶體熒光探針 (0.05 μmol/L) 共定位結果;(e)—(g) RH 探針 (0.5 μmol/L和內質網熒光探針 (0.5 μmol/L) 共定位結果;(i)—(k) RH 探針 (0.5 μmol/L) 和線粒體熒光探針 (0.5 μmol/L) 共定位結果;(m)—(p) RH 探針 (2 μmol/L) 分別與細胞核探針Hoechst (0.2 μmol/L)和線粒體熒光探針 (0.5 μmol/L) 共定位結果;標尺20 μm;(d),(h),(l) 由Image J 軟件計算得到的相應通道圖像的Pearson 共定位系數Fig.3.Cell colocalization imaging: (a)-(c) The colocalization images of RH probe (0.5 μmol/L) and lysosomal fluorescence probe(0.05 μmol/L);(e)-(g) the colocalization images of RH probe (0.5 μmol/L) and ER fluorescence probe (0.5 μmol/L);(i)-(k) the colocalization images of RH probe (0.5 μmol/L) and mitochondrial fluorescence probe (0.5 μmol/L);(m)-(p) the co-localization images of the probe (RH) (2 μmol/L) with the commercial nuclear probe of Hoechst (0.2 μmol/L) and mitochondrial fluorescent probe of Mito-Tracker (0.5 μmol/L);scale bar is 20 μm;(d),(h),(l) the Pearson co-location coefficient of the corresponding channel image calculated by Image J software set,respectively.

為進一步證明RH 探針在較高濃度 (2 μmol/L)時標記細胞核內核仁,分別使用DNA 和RNA 水解酶進行了細胞內的DNA 和RNA 水解實驗與熒光成像,如圖4 所示.圖4(a)—(c)是探針與商用Hoechst 探針的對細胞進行共定位成像的對照實驗圖,可見RH 探針標記到細胞核區域的圓形目標;經過RNase A 酶消化后,核仁內的RNA 被分解,RH 探針標記細胞核內的熒光區域也隨之消失,如圖4(d)—(f)所示;經過DNase I 酶消化后,細胞內的DNA 被分解,如圖4(g)—(i)所示,Hoechst 標記的細胞核區域熒光明顯減弱,而RH 探針在細胞核區域標記的圓形目標熒光還在,由此說明RH 探針標記的細胞核內目標為核仁.

圖4 DNA 與RNA 水解酶水解實驗 (a)—(c) 空白對照組;(d)—(f) 固定的HeLa 細胞經過RNase A 消化后的結果;(g)—(i) 固定的HeLa 經過DNase I 消化后的結果,細胞先用4%多聚甲醛處理20 min 固定,之后分別用DNase I 和RNase A 消化2 h,最后與RH 探針(2 μmol/L)和Hoechst 探針(0.2 μmol/L)共孵育30 min,細胞成像前用PBS 清洗兩次,標尺20 μmFig.4.Hydrolytic experiment on DNA and RNA using hydrolase: (a)-(c) Control group;(d)-(f) result of digestion of fixed HeLa cells by RNase A;(g)-(i) the result of digestion of fixed HeLa by DNase I;the cells were treated with 4% paraformaldehyde for 20 min,then digested with DNase I and RNase A for 2 h,respectively,and incubated with RH probe (2 μmol/L) and Hoechst probe(0.2 μmol/L) for 30 min;cells were washed twice with PBS before imaging.Scale bar is 20 μm.

在上述實驗基礎上,RH 探針在低濃度情況下標記到HeLa 細胞的線粒體并研究了活HeLa 細胞線粒體的黏度變化.圖5 為通過FLIM 研究活HeLa細胞線粒體在長時間光照下微環境的變化.圖5(a)所示的活HeLa 細胞線粒體內探針的平均壽命為3.65 ns,計算可知活HeLa 細胞線粒體的黏度為66×10-3Pa·s,與文獻[33]報道相接近.此外,我們研究了HeLa 細胞在長時間激光照射刺激下,線粒體發生的融合和斷裂等形態變化,結果如圖5(b)—(h)紅色邊框標記處所示.其中,圖5(b)所示的線粒體熒光壽命平均值為3.64 ns,圖5(h)中的線粒體熒光壽命平均值為3.61 ns,可得到線粒體的黏度由78×10-3Pa·s 增至131×10-3Pa·s,均與已有報道結果一致[27],證明探針RH 通過FLIM 定量成像線粒體微環境黏度結果的可靠性.

圖5 活HeLa 細胞線粒體FLIM (a) RH 探針(0.5 μmol/L)染色30 min 后標記的HeLa 細胞;(b)—(h) 圖(a)中紅色邊框選中的區域放大的圖像,記錄了線粒體在光照刺激下30 min 時間內發生的融合和斷裂變化.標尺5 μmFig.5.Fluorescence lifetime imaging of mitochondria in living cells: (a) HeLa cells labeled after 30 min staining with RH probe(0.5 μmol/L);(b)-(h) the enlarged images of the region selected by the red border in panel (a),which record the fusion and fracture changes of mitochondria within 30 min under the stimulation of light.Scale bar is 5 μm.

由前面的共定位實驗結果 (圖3(o)—(p)) 可知,RH 探針在高濃度 (2 μmol/L) 情況下標記到活HeLa 細胞的核仁和線粒體.為了研究長時間光照對核仁和線粒體的影響,我們使用CLSM 和FLIM 對活HeLa 細胞的核仁和線粒體同時進行長時間的成像研究,如圖6 所示.隨著激光光照時間的增加 (圖6(a)—(d)),定位到線粒體上的紅色熒光信號逐漸減弱,定位到核仁上的紅色熒光信號幾乎保持不變.可能是激光誘導線粒體膜電位發生變化,導致探針分子從線粒體脫離.接著,使用FLIM研究活HeLa 細胞的核仁和線粒體在長時間光照下發生的熒光強度和熒光壽命變化,如圖6(e)—(h)所示,藍色區域為線粒體,淺綠色或紅色區域為核仁.隨著激光光照時間的增加,線粒體和核仁分別發生不同的變化: 一方面,RH 探針標記的線粒體所在的藍色區域逐漸減少,定位到的線粒體熒光信號逐漸減弱,這與前面共聚焦成像結果相一致;另一方面,RH 探針標記的核仁以及周圍的細胞核區域強度逐漸增加,淺藍色 (短壽命區域) 逐漸減少,綠色和橙紅色區域 (長壽命區域) 逐漸增多.對應地,探針定位于核仁平均壽命也從4.23 ns 增至4.32 ns.此外,對活HeLa 細胞的FLIM 成像進行相圖分析(圖6(i)—(l))[34],發現長壽命區域處在相圖邊界上,對應探針定位在細胞核仁區域,短壽命處于相圖內部,對應的探針定位于線粒體上,探針的熒光壽命符合雙指數衰減模式,二者所示的變化與熒光壽命圖像變化一致.

圖6 熒光壽命隨光照時間變化 (a)—(d) RH 探針(2 μmol/L)標記的HeLa 細胞在長時間光照的共聚焦成像結果;(e)—(h) RH 探針(2 μmol/L)標記HeLa 細胞在長時間光照的熒光壽命變化情況;(i)—(l)分別為圖(e)—(h)相應的熒光壽命的相位圖,熒光信號數據落在一個以坐標(0.5,0)為中心,0.5 為半徑的半圓軌跡上,其中 G 和S 分別為相位圖的橫縱坐標(G=1/(ω2+τ2),S=ωτ/(ω2+τ2),ω 為激發光調制角頻率,τ 為熒光壽命)[34],坐標(0,0)代表壽命為無窮大,坐標(1,0)代表壽命為0;標尺為10 μmFig.6.Fluorescence lifetime changes with illumination time: (a)-(d) Confocal imags of HeLa cells labeled with RH probe(2 μmol/L) under prolonged illumination;(e)-(h) the change in fluorescence lifetime of RH probe (2 μmol/L) labeled HeLa cells under prolonged illumination;(i)-(l) the phase diagram of the corresponding fluorescence lifetime of panels (e)-(h),respectively,and the fluorescence signal data falls on a semicircular trajectory with coordinates (0.5,0) as the center and 0.5 as the radius,where G and S are the horizontal and vertical coordinates of the phase diagram (G=1/(ω2+τ2),S=ωτ/(ω2+τ2),ω is the excitation light modulation angular frequency and τ is the fluorescence lifetime)[34],the coordinate (0,0) represents infinite lifetime,and the coordinate (1,0) represents 0 in lifetime;scale bar is 10 μm.

另外,還補充了RH 探針標記活COS-7 細胞和ID-8 細胞線粒體和核仁的FLIM 成像,結果見圖7,再次驗證RH 探針分別靶向線粒體和核仁跟與其濃度有關.如圖7(a),(b) 所示,RH 在低濃度(0.5 μmol/L)標記到COS-7 細胞和ID8 細胞的線粒體,同時RH 標記到COS-7 細胞和ID-8 細胞線粒體的平均熒光壽命分別為3.29 ns 和3.28 ns(圖7(i),(j)),跟標記HeLa 線粒體時的熒光壽命有所差異,這可能為不同種類細胞的線粒體微環境差異導致.HeLa 細胞來源人的宮頸,對比COS-7細胞和ID-8 細胞,三種細胞之間存在種屬和器官來源差異,細胞內環境存在一定的差異,從而導致了RH 在標記HeLa 細胞與COS-7 細胞和ID-8 細胞線粒體時熒光壽命的差異.另外,如圖7(c),(d)所示,RH 在高濃度(2 μmol/L)標記COS-7 細胞和ID-8 細胞的核仁和線粒體,圖中細胞內橙紅色區域為RH 標記到的核仁結構,藍綠色區域為RH標記到的線粒體結構.圖7(k),(l)的相位圖也顯示RH 在高濃度的熒光壽命有兩個組分,藍色區域為低熒光壽命組分,對應RH 標記到線粒體上,橙紅色區域為高熒光壽命組分,對應RH 標記到核仁上,其中RH 標記到COS-7 細胞和ID-8 細胞核仁的熒光壽命分別為4.27 ns 和4.28 ns.由此可見RH 在不同細胞標記線粒體和核仁的方式是一樣的.一方面,RH 因結構上含有羅丹明基團帶正電荷,因而能夠較為容易地標記到線粒體上;另一方面,RH 結構上含有疏水的芘基團,而核仁內有一定的疏水空間,同時還含有帶負電荷RNA 結構,因而RH 能夠標記到核仁上.RH 分別靶向線粒體和核仁由RH 的濃度介導,在低濃度(0.5 μmol/L)時主要靶向線粒體,在高濃度 (2 μmol/L) 時同時標記核仁和線粒體,標記線粒體和核仁時探針的壽命存在較大差異,因而能夠很好地區分二者,為進一步研究細胞在非穩態過程中生理功能變化提供基礎.

圖7 RH 探針標記COS-7 細胞和ID-8 細胞的FLIM 成像 (a),(b) 分別為低濃度RH (0.5 μmol/L)標記COS-7 細胞和ID-8 細胞線粒體的熒光壽命圖像;(c),(d) 分別為高濃度RH (2 μmol/L) 標記COS-7 細胞和ID-8 細胞核仁的熒光壽命圖像;(e)—(h) 分別為圖(a)—(d)的熒光強度圖像;(i)—(l) 分別為對應的熒光壽命圖像的相位圖Fig.7.Fluorescence lifetime imaging of COS-7 cells and ID-8 cells labeled by RH probe: (a),(b) With low concentration RH(0.5 μmol/L),fluorescence lifetime images of mitochondria of COS-7 cells and ID-8 cells labeled,respectively;(c),(d) with high concentration RH (2 μmol/L),fluorescence lifetime images of nucleolus of COS-7 cells and ID-8 cells labeled,respectively;(e)-(h) the fluorescence intensity image of panels (a)-(d);(i)-(l) the phase diagram of the corresponding fluorescence lifetime image.

為進一步研究細胞應激反應中核仁的動力學變化,使用100 nmol/L 的紫杉醇誘導HeLa 細胞凋亡[35],CLSM 成像結果和FLIM 成像結果如圖8所示.相較于空白處理的HeLa 細胞(圖8(a)),紫杉醇處理過的HeLa 細胞(圖8(b))能夠更加明顯地觀察到核仁染色熒光.另外,隨著紫杉醇處理時間的增加,觀察到活HeLa 細胞的形態由梭形展開狀態(圖8(b))過渡到橢圓形或圓形的收縮狀態(圖8(d)),說明了紫杉醇誘導HeLa 細胞凋亡過程的發生.在紫杉醇誘導HeLa 細胞凋亡過程中,我們觀察到細胞內的核仁位置的變化,如圖8(b)—(d)和圖8(j)—(l)白色箭頭所示.在正常HeLa 細胞內(圖8(a)),核仁居于細胞核較為居中的位置;而紫杉醇處理過的HeLa 細胞,核仁向細胞核外移動甚至進入到細胞質中,如圖8(b)白色箭頭所示,另外還觀察到細胞表面的洞穿凹痕,如圖8(c)白色箭頭所示.Lieu 等[36]報道,紫杉醇的誘導細胞凋亡效果與其濃度和處理時間相關,10—100 nmol/L 濃度范圍的紫杉醇可以抑制微管的組裝動力學,導致細胞停滯在細胞周期中的G2/M 期;用60 nmol/L的紫杉醇處理1 h 或20 nmol/L 的紫杉醇處理12 h可誘導細胞凋亡.另外,FLIM 觀察到的HeLa細胞形態變化跟CLSM 成像系統的結果一致,如圖8(m)—(p)所示.同時,在紫杉醇誘導細胞凋亡過程中,我們發現RH 探針標記HeLa 細胞核仁的平均壽命由4.19 ns (處理0.5 h,圖8(q)) 先增至4.38 ns (處理1 h,圖8(r))和4.47 ns (處理2 h,圖8(s)),最后降至4.42 ns (處理4 h,圖8(t)),反映了紫杉醇的作用效果與處理時間的相關.在處理時間較短時 (0.5 h),紫杉醇(100 nmol/L)積累在細胞微管上的量不足以抑制細胞分裂誘導細胞凋亡;隨著處理時間的增加(1 h),紫杉醇結合到微管的量可以抑制細胞分裂誘導細胞凋亡,而且隨著處理時間的增加,更加容易誘導細胞凋亡.

圖8 紫杉醇誘導細胞凋亡的CLSM 成像圖像與FLIM 成像圖像 (a)空白對照;(b)—(d) 紫杉醇 (0.1 μmol/L) 分別預先處理0.5,1,2 h 后RH 探針 (2 μmol/L) 標記的HeLa 細胞的共聚焦成像結果;(e)—(h) 對應的明場圖像;(i)—(l) 紅色通道和明場通道的疊加結果;(m)—(p) 分別為紫杉醇 (0.1 μmol/L) 預先處理0.5,1,2,4 h 后,RH 探針 (2 μmol/L) 標記的HeLa 細胞的熒光壽命圖像;(q)—(t) 相應圖像的相位圖,標尺10 μm.Fig.8.Laser confocal imaging images and fluorescence lifetime imaging images of paclitaxel-induced apoptosis: (a) As a blank control;(b)-(d) the confocal image of HeLa cells labeled with RH probe (2 μmol/L) after 0.5 and 1,2 hours of paclitaxel (0.1 μmol/L)pretreatment,respectively;(e)-(h) the corresponding bright field image,respectively;(i)—(l) the superposition result of red channel and bright field channel,respectively;(m)-(p) the fluorescence lifetime image of RH probe (2 μmol/L) labeled HeLa cells after pretreatment with paclitaxel (0.1 μmol/L) for 0.5,1,2,4 h,respectively;(q)-(t) phase diagram of the corresponding image,respectively,scale bar is 10 μm.

此外,我們還研究了秋水仙堿在誘導細胞凋亡過程中細胞微環境的變化[37],結果如圖9 所示.相較于空白處理的HeLa 細胞(圖8(a)),較低濃度(10 nmol/L)秋水仙堿處理的HeLa 細胞核仁染色熒光更加明顯(圖9(a)—(c)).RH 探針標記于空白處理的HeLa 細胞核仁的平均熒光壽命為4.10 ns (圖9(j)),標記于較低濃度秋水仙堿處理的HeLa 細胞核仁平均壽命為 4.34 ns (圖9(k)),這與100 nmol/L 的紫杉醇處理1 h 的結果相近;而較高濃度(100 nmol/L)處理的細胞則更容易發生凋亡(圖9(d)—(f)),探針標記于HeLa 細胞核仁的平均壽命為4.47 ns (圖9(l)),這與100 nmol/L的紫杉醇處理2 h 結果相近.Paschke 等[38]報道,秋水仙堿在較低濃度(10 nmol/L)時會降低細胞的變形能力,限制細胞的運動;而在較高濃度(100 nmol/L)時,作用機制跟紫杉醇的類似,與微管蛋白結合抑制細胞分裂,從而誘導細胞凋亡.

圖9 秋水仙堿誘導細胞凋亡CLSM 成像圖像與FLIM 成像結果 (a)—(c) 10 nmol/L 和(d)—(f) 100 nmol/L 的秋水仙堿預先處理1 h 后,RH 探針(2 μmol/L)標記的HeLa 細胞的共聚焦成像結果.(a),(d) RH 探針紅色通道圖像;(b),(e) 相應的明場通道圖像;(c),(f) 相應的紅色通道和明場通道疊加的結果;(g) 空白對照;(h),(i) 分別為10 nmol/L 和100 nmol/L 的秋水仙堿預先處理1 h 后,RH 探針 (2 μmol/L) 標記HeLa 細胞的熒光壽命圖像;(j)—(l) 相應熒光壽命圖像的相位圖,標尺10 μmFig.9.Confocal laser imaging images and fluorescence lifetime imaging results of colchicine-induced apoptosis: (a)-(c) 10 nmol/L and (d)-(f) 100 nmol/L is respectively the confocal image of HeLa cells labeled with RH probe (2 μmol/L) after 1 h pre-treatment with colchicine.(a),(d) Red channel images of RH probe;(b),(e) the corresponding bright field channel images;(c),(f) the superposition result of the corresponding red channel and bright field channel;(g) a blank control;(h),(i) fluorescent lifetime image of HeLa cells labeled with RH probe (2 μmol/L) after pre-treatment with 10 nm and 100 nm colchicine for 1 h,respectively;(j)-(l) the phase diagram of the corresponding fluorescence lifetime image,respectively,scale bar is 10 μm.

4 結論

活細胞在受到激光光照、紫杉醇及秋水仙堿等不同刺激下發生應激反應,細胞形態及微環境發生相應的變化,通過熒光壽命可獲得定量的成像與測量研究.本文選用具有紅色熒光的芘羅丹明探針RH 在不同條件下能夠分別靶向標記活細胞的線粒體和核仁.我們使用Autodocking 軟件進行生物計算模擬探針與DNA/RNA 的結合模式,得到RH 探針與DNA 只有一種結合方式,且結合能較高 (-5.25 eV),從而導致探針只是附著在DNA序列表面,與DNA 的結合力較弱;而RH 探針與RNA 有兩種結合構型,結合能分別是-11.2 eV 和-11.62 eV,對應探針的疏水基團分別嵌入RNA 序列中的小溝和大溝中,與RNA 的結合力較強.使用FLIM 技術監測到活HeLa 細胞在光照刺激過程中發生的線粒體斷裂、融合形態變化,以及探針標記線粒體的平均熒光壽命由3.65 ns 降低到3.61 ns,對應線粒體的黏度由66×10-3Pa·s 增至131×10-3Pa·s.同時,我們還補充了RH 探針標記COS-7 細胞和ID-8 細胞線粒體和核仁的FLIM 成像,結果顯示RH 靶向標記線粒體和核仁的情況與HeLa 細胞的類似,在低濃度(0.5 μmol/L)時主要靶向線粒體,在高濃度 (2 μmol/L)時同時標記核仁和線粒體,標記到COS-7 細胞和ID-8 細胞中的線粒體的平均壽命約為3.29 ns 和3.28 ns,比標記到HeLa 細胞中線粒體的壽命略低,這可能為不同種類細胞的線粒體內環境差異導致.另外,我們使用RH 探針在CLSM 成像和FLIM 成像可視化了活HeLa 細胞在激光光照、紫杉醇和秋水仙堿誘導細胞凋亡過程中的核仁動力學變化,觀察到活HeLa 細胞核仁在細胞凋亡過程中的移動,RH 的平均熒光壽命發生變化: 光照時間從0 min 增至30 min,RH 標記到HeLa 細胞核仁的平均壽命也從4.23 ns 增至4.32 ns,反映了長時間激光照射引起HeLa 細胞核仁微環境的變化;100 nmol/L 的紫杉醇處理時間從0.5 h 增至4 h,探針標記于HeLa 細胞核仁的平均壽命由4.19 ns,增至4.47 ns,最后降至4.42 ns,反映了紫杉醇處理不同時間誘導HeLa 細胞凋亡所引起的細胞核仁微環境差異;對比空白處理的HeLa 細胞,低濃度(10 nmol/L)秋水仙堿處理1 h 后,探針的平均壽命由4.10 ns增至4.34 ns,高濃度(100 nmol/L)秋水仙堿處理1 h 后,探針標記于核仁的平均壽命增至4.47 ns,反映了不同濃度秋水仙堿誘導細胞凋亡所引起的細胞核仁微環境變化的差異.

以上激光光照、紫杉醇和秋水仙堿三種方式誘導HeLa 細胞損傷或凋亡,證明了在HeLa 細胞非穩態情況下核仁和線粒體微環境的變化以及功能變化,為研究不同途徑誘導細胞凋亡的動態過程以及核仁和線粒體功能障礙相關疾病研究提供了新的研究方法.