丙泊酚減弱CCL4誘導(dǎo)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞促炎和細(xì)胞毒作用機制研究

趙 娟,龔葛松

南通大學(xué)附屬啟東醫(yī)院:1.麻醉科;2.神經(jīng)內(nèi)科,江蘇南通 226200

腦卒中為常見急性腦血管疾病,致死率高,且近50%生存患者長期致殘,預(yù)后差[1-2]。有研究表明,大腦缺血損傷后,中樞系統(tǒng)免疫細(xì)胞如巨噬細(xì)胞等被大量活化,釋放細(xì)胞因子,而這些細(xì)胞因子及其招募活化的免疫細(xì)胞又可至損傷部位,造成二次損傷[3-5]。近年研究發(fā)現(xiàn),趨化因子配體4(CCL4)在大腦缺血損傷后上調(diào)[6-8],其功能可能與破壞血腦屏障、促進T細(xì)胞招募至損傷部位有關(guān)[9]。有研究顯示,腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞在炎癥過程中可通過自分泌形式產(chǎn)生大量CCL4[10],但其作用機制尚不清楚。丙泊酚為臨床手術(shù)常用麻醉劑,近年研究發(fā)現(xiàn),丙泊酚除了具有麻醉效果外,還具備抗焦慮、神經(jīng)保護、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)活性[11-13],在大腦缺血損傷后的抗炎作用也有廣泛報道[14],但丙泊酚對腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞保護作用報導(dǎo)較少。

本研究擬將CCL4與永生化人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞hCMEC/D3體外孵育,觀察CCL4對hCMEC/D3細(xì)胞增殖及凋亡的影響,同時分析炎癥及促血栓形成相關(guān)基因表達(dá)情況。本研究將丙泊酚與CCL4聯(lián)合處理,分析丙泊酚是否拮抗CCL4對腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞作用,以期為丙泊酚作為減少腦卒中患者二次損傷保護劑提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料來源 hCMEC/D3 人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞購自中國科學(xué)院昆明細(xì)胞庫。丙泊酚、人重組CCL4細(xì)胞因子購自北京科昕生物科技有限公司,凋亡試劑盒購自BD公司,環(huán)氧化酶-2(COX-2)活性測定試劑盒和凝血酶活性測定試劑盒購自英國Abcam公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及分組 采用hCMEC/D3細(xì)胞專用培養(yǎng)基(XY-h070-0016,上海信裕公司)置于37 ℃、5% CO2且濕度飽和的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞分組如下:(1)對照組,采用生理鹽水處理;(2)CCL4組,CCL4處理,質(zhì)量濃度為500 pg/mL;(3)CCL4+丙泊酚組,CCL4及丙泊酚處理,質(zhì)量濃度分別為500 pg/mL和10 μg/mL。

1.2.2CCK-8試驗檢測細(xì)胞增殖能力 將hCMEC/D3細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液,分別接種于96孔板,每孔1 000個細(xì)胞,將接種好的 96孔板放入培養(yǎng)箱中。待24 h細(xì)胞貼壁后,對照組、CCL4組和CCL4+丙泊酚組各孔內(nèi)分別更換為生理鹽水(對照)、含CCL4及含CCL4和丙泊酚的培養(yǎng)液,并于加藥時,以及加藥24、48和72 h將10%的 CCK-8試劑加入待檢測孔中,37 ℃孵育 4 h,每個時間點設(shè)置 6個復(fù)孔。采用酶標(biāo)儀檢測各時間點各孔的吸光度(A450)。

1.2.3Annexin V/PI雙染檢測細(xì)胞凋亡情況 將對數(shù)期生長的hCMEC/D3細(xì)胞,按3×105個/孔接種于6孔板中,分3組,每組設(shè)置3個復(fù)孔,各組分別加入等體積含0、500 pg/mL CCL4、10 μg/mL丙泊酚+500 pg/mL CCL4的培養(yǎng)液。置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h,收集各孔培養(yǎng)液,磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗,收集所有細(xì)胞。各加入5 μL Annexin V和PI避光染色15 min。上機,采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況,實驗重復(fù)3次。

1.2.4實時熒光定量PCR(qPCR) 總RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄及qPCR均按說明書操作。PCR反應(yīng)條件:95 ℃ 10 min,95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min,共40 循環(huán)。qPCR使用ABI 7500儀器進行。根據(jù)待測標(biāo)本的Ct值,以β-actin作為內(nèi)參,采用2-ΔΔCt法計算相對表達(dá)水平。引物序列見表1。

表1 PCR引物序列

1.2.5酶活性檢測 將對數(shù)期生長的hCMEC/D3細(xì)胞,按3×105個/孔接種于6孔板中,分3組,每組設(shè)置3個復(fù)孔,各組分別加入等體積生理鹽水或含500 pg/mL CCL4、10 μg/mL丙泊酚+500 pg/mL CCL4的培養(yǎng)液。按照說明書分別使用COX-2活性測定試劑盒和凝血酶活性測定試劑盒檢測各組細(xì)胞COX-2活性和凝血酶活性。

2 結(jié) 果

2.1丙泊酚對CCL4誘導(dǎo)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞毒作用的影響 CCK-8試驗結(jié)果顯示:CCL4組與對照組比較,細(xì)胞增殖活力明顯減弱(P<0.01);CCL4+丙泊酚組與CCL4組比較,CCL4+丙泊酚組細(xì)胞增殖活力顯著增強(P<0.01);結(jié)果提示,丙泊酚對血管內(nèi)皮細(xì)胞有保護作用。與此相符,細(xì)胞克隆試驗結(jié)果表明,CCL4組細(xì)胞克隆形成數(shù)量顯著低于對照組(P<0.01),丙泊酚+CCL4組可減弱CCL4對血管內(nèi)皮細(xì)胞克隆形成的抑制作用(P<0.01)。見表2和圖1。

注:A為3組細(xì)胞克隆形成試驗結(jié)果;B為3組細(xì)胞形成克隆數(shù)量比較;**P<0.01。

表2 3組細(xì)胞增殖能力及克隆形成能力比較

2.2丙泊酚對CCL4誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡作用的影響 流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示,CCL4組細(xì)胞較對照組細(xì)胞凋亡率顯著增加(P<0.01),CCL4+丙泊酚組較CCL4組細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.01)。見圖2。

注:A為3組細(xì)胞凋亡流式圖;B為3組細(xì)胞凋亡率比較;**P<0.01。

2.3丙泊酚對CCL4誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)炎癥基因表達(dá)的影響 利用qPCR檢測各處理組血管內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)炎癥基因的表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn),CCL4組細(xì)胞較對照組表達(dá)倍數(shù)顯著升高(P<0.01),提示丙泊酚可明顯抑制CCL4對血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥基因表達(dá)促進作用。COX-2活性測定結(jié)果顯示,CCL4組細(xì)胞COX-2活性較對照組明顯升高(P<0.01),提示丙泊酚可明顯抑制CCL4對血管內(nèi)皮細(xì)胞COX-2活性促進作用。見表3。

表3 3組細(xì)胞炎癥基因相對表達(dá)倍數(shù)及COX-2相對活性比較

2.4丙泊酚對CCL4誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞血栓形成相關(guān)基因的影響 qPCR檢測結(jié)果顯示,CCL4組細(xì)胞Thrombin、Factor 8、VWF、TXA較對照組基因的表達(dá)倍數(shù)顯著升高(P<0.01),提示丙泊酚可明顯抑制CCL4對血管內(nèi)皮細(xì)胞血栓形成表達(dá)促進作用。凝血酶活性測定結(jié)果發(fā)現(xiàn),CCL4組細(xì)胞凝血酶活性較對照組明顯升高(P<0.01),而丙泊酚可明顯抑制CCL4對血管內(nèi)皮細(xì)胞凝血酶活性促進作用。見表4。

表4 3組細(xì)胞血栓形成相關(guān)基因相對表達(dá)水平及凝血酶活性比較

3 討 論

CCL4又稱為巨噬細(xì)胞炎性蛋白1β(MIP-1β),可選擇性與穿膜受體CCR5結(jié)合,在炎癥處招募單核細(xì)胞、T細(xì)胞等免疫細(xì)胞[15-16]。體外實驗表明,CCL4可顯著促進血管內(nèi)皮細(xì)胞ROS形成,促進單核細(xì)胞THP-1與內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合,從而發(fā)揮炎癥效應(yīng)[17]。然而,關(guān)于CCL4對腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的直接作用的報道較少。本研究用重組CCL4因子處理腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞,培養(yǎng)24 h即出現(xiàn)增殖活力顯著下降現(xiàn)象,培養(yǎng)72 h后CCL4處理組細(xì)胞增殖活力為對照組的60%,表明CCL4對腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖有顯著抑制作用。與此相符,本研究還發(fā)現(xiàn),CCL4處理組細(xì)胞較對照組細(xì)胞的細(xì)胞克隆形成能力減弱,并且誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡率增加,表明CCL4對血管內(nèi)皮細(xì)胞有直接的毒性作用。

腦缺血可促進炎癥環(huán)境形成,除巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞外,血管內(nèi)皮細(xì)胞本身在腦部受損后可釋放細(xì)胞因子[18-20]。本研究利用qPCR檢測CCL4誘導(dǎo)后內(nèi)皮細(xì)胞釋放細(xì)胞因子表達(dá)變化,結(jié)果發(fā)現(xiàn)CCL4誘導(dǎo)后,血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)相關(guān)炎癥因子IL1-β、IL-6、IL-8及TNF-α水平顯著上調(diào),同時炎癥通路核心轉(zhuǎn)錄因子NF-κB水平上調(diào);COX-2水平及體外酶活性在CCL4刺激下顯著升高,表明CCL4不僅對腦微血管細(xì)胞有細(xì)胞毒作用,還能激活內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)炎癥因子及COX-2,促進受損環(huán)境的炎癥反應(yīng)。除炎癥外,內(nèi)皮細(xì)胞可表達(dá)血栓形成相關(guān)基因,參與凝血級聯(lián)反應(yīng),在腦卒中缺血損傷起到重要作用[21]。本研究結(jié)果顯示,CCL4可明顯誘導(dǎo)細(xì)胞凝血酶活性、Factor 8、VWF及TXA的表達(dá),表明CCCL4可通過刺激腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)影響血栓形成。

丙泊酚作為靜脈麻醉劑有諸多優(yōu)點,如鎮(zhèn)靜、催眠、遺忘效應(yīng)、作用時間短、起效快、易于控制、清醒時間快、不易引起藥物蓄積等[22-23],因此廣泛用于腫瘤切除手術(shù)中。丙泊酚除麻醉效應(yīng)外,還具有抗炎、神經(jīng)保護作用,但其藥理機制不明確。本研究發(fā)現(xiàn),丙泊酚可緩解CCL4對腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、克隆形成的抑制,減弱CCL4對內(nèi)皮細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)作用。在抗炎方面,丙泊酚可CCL4對內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)炎癥基因表達(dá)作用。此外,丙泊酚也能拮抗CCL4對內(nèi)皮細(xì)胞促血栓基因表達(dá)的作用。目前,丙泊酚調(diào)控細(xì)胞內(nèi)重要分子的研究報導(dǎo)較多,包括信號通路、非編碼RNA及表觀遺傳調(diào)控[24-26]。丙泊酚拮抗CCL4細(xì)胞毒作用、拮抗CCL4誘導(dǎo)細(xì)胞炎癥反應(yīng)和促血栓形成反映可能與丙泊酚調(diào)控分子網(wǎng)絡(luò)有關(guān),有待進一步研究。

綜上所述,CCL4可對腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞有細(xì)胞毒作用,細(xì)胞增殖活力及細(xì)胞克隆形成能力下降、細(xì)胞凋亡率增加;CCL4還能促進腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)及促血栓形成相關(guān)基因表達(dá)上調(diào),而丙泊酚可抑制CCL4上述作用,可為丙泊酚作為減少腦卒中患者二次損傷保護劑提供實驗依據(jù)。