circRNA TCF25靶向miR-128b對人乳腺癌細胞MCF-7增殖和凋亡的影響

夏書官，王聲，任陽光，田艷艷，左永剛

（河南大學淮河醫院甲狀腺乳腺外科，河南 開封 475000）

全球癌癥統計報告［1］數據顯示，2020年女性乳腺癌新發病例達230萬，約占新發癌癥病例的11.7%，已超越肺癌居全球第一位；乳腺癌也是導致女性癌癥死亡的主要原因。雖然近年來手術、放化療、免疫治療、靶向治療及內分泌治療等手段在乳腺癌治療中取得重要進展，但仍有部分患者在治療后出現復發、轉移甚至死亡，對女性健康造成嚴重危害。因此，探究乳腺癌發生發展的分子機制、尋找新的分子靶點對乳腺癌的診斷治療及預后改善有重要意義。環狀RNA（circular RNA，circRNA）是一類通過外顯子或內含子序列可變剪接形成的單鏈閉合環狀RNA分子，可充當微RNA（microRNA，miR）的分子海綿競爭性結合miR，進而改變靶mRNA表達狀態［2］。最新研究［3］表明，circRNA在乳腺癌的發生發展過程中發揮重要調控作用，并可調節乳腺癌細胞增殖、凋亡和轉移等生物學過程。YIN等［4］通過體外細胞實驗發現，過表達circRNA轉錄因子25（transcription factor 25，TCF25）可作為miR-206的海綿促進膠質瘤細胞增殖、遷移和侵襲能力。陳旭輪等［5］研究顯示，circRNA TCF25可通過靶向miR-128提高膀胱癌細胞生長增殖、遷移和侵襲能力。已有研究［6］顯示，過表達miR-128可通過調節磷酸酯酶與張力蛋白同源物（phosphatase and tensin homolog，PTEN）來增強乳腺癌細胞對阿霉素的敏感性。然而關于circRNA TCF25對乳腺癌細胞增殖、凋亡影響的研究尚未見報道。本研究通過體外實驗探究circRNA TCF25靶向miR-128b對人乳腺癌細胞MCF-7增殖和凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞：人乳腺癌細胞MCF-7（美國ATCC細胞庫，貨號YBCC100943）。

1.1.2 藥物與試劑：si-NC、si-circRNA TCF25、pcDNAcircRNA TCF25、miR-NC、miR-128b模擬物、miR-128b抑制劑、雙熒光素酶報告載體均由寶生物工程（大連）有限公司設計合成。Lipofectamine 2000轉染試劑盒（美國Invitrogen公司，貨號11668019），RNase R酶（上海撫生實業有限公司，貨號A-PJ1136），細胞核/細胞質細胞組分提取試劑盒（美國Biovision公司，貨號 K266-25），噻唑藍（MTT）細胞增殖檢測試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，貨號M1020），凋亡檢測試劑盒（美國Biogems公司，貨號62700-50），TRIzol總核糖核酸（RNA）提取試劑盒（上海聯邁生物工程有限公司，貨號LM80901B），反轉錄試劑盒（日本TaKaRa公司，貨號RR036A），熒光定量PCR試劑盒（日本TaKa-Ra公司，貨號RR420A），二喹啉甲酸（BCA）蛋白濃度測定試劑盒（美國AAT Bioquest公司，貨號200619），雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，貨號D0010），兔抗人PTEN、細胞增殖核抗原-67（Ki-67）、caspase-3、活化的caspase-3、U6、β-actin單克隆抗體（美國Abcam公司，貨號ab13847、ab34710、ab69949、ab26548、ab16105、ab22140），羊抗兔PTEN、Ki-67、caspase-3、活化的caspase-3、U6、β-actin多克隆抗體（美國Abcam公司，貨號ab34106、ab22693、ab51102、ab20247、ab16419、ab10188）。

1.1.3 實驗器材：S1000?384 Well型PCR儀（美國BIO-RAD公司），SuPerMax 3000AL型型多功能酶標儀（上海閃譜生物科技公司），Attune CytPix型流式細胞儀（美國Invitrogen公司），BPN-CRH型細胞培養箱（上海一恒科學儀器有限公司），DT-MINIE-135型電泳儀［德諾杰億（北京）生物科技有限公司］，JP-2880型凝膠成像系統（上海金鵬分析儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養、轉染和分組：將人乳腺癌細胞MCF-7于37℃、5%CO2的細胞培養箱中常規培養，每2 d換液1次。待細胞生長至對數生長期，消化并離心收集細胞，按照1.0×104/孔接種至96孔板。根據Lipofectamine 2000轉染試劑盒說明書分別將si-NC、si-circRNA TCF25、pcDNA-circRNA TCF25、miR-NC、miR-128b 模擬物、miR-128b 抑制劑、pcDNA-circ-RNA TCF25和miR-128b 模擬物轉染至上述細胞，分別記作si-NC組、si-circRNA TCF25組、pcDNA-circ-RNA TCF25組、miR-NC組、miR-128b mimic組、miR-128b inhibitor組和pcDNA-circRNA TCF25+miR-128b mimic組，另取未轉染人乳腺癌細胞MCF-7設為空白組，每組6個復孔。

1.2.2 細胞中circRNA TCF25、miR-128b表達：轉染48 h后，通過TRIzol總RNA提取試劑盒提取細胞總RNA，合成互補脫氧核糖核酸（cDNA），根據PCR試劑盒說明操作步驟檢測circRNA TCF25、miR-128b相對表達量。反應體系：正向、反向引物各1 μL，Real-Time Master Mix 10 μL，cDNA 2 μL，無酶雙蒸水（RNase ddH2O）補足體系至20 μL。反應條件：95℃預變性2 min，95℃變性15 s，60℃退火1 min，72℃延伸30 s（循環40次）。circRNA TCF25，正向5’-TGAACCGATACGACAGTCC-3’，反向5’-ACGGG CATATATTACGTC-3’，產物長度146 bp；miR-128b，正向5’-AGCCACATATCAGCACTT-3’，反向5’-CTT AGCATTGAGTATATCTG-3’，產物長度206 bp；U6，正向5’-ACCGATCAGATACGAG-3’，反向5’-TGCAA ACGAGTTGACGTAGT-3’，產物長度177 bp；β-actin，正向5’-GCACTAGCAGAGATCC-3’，反向5’-CATTG CACTGTCAGTA-3’，產物長度306 bp。引物均由寶生物工程（大連）有限公司設計合成。circRNA TCF25以β-actin為內參，miR-128b以U6為內參，通過2-△△Ct公式計算相對表達量。

1.2.3 RNase R酶消化實驗進行circRNA鑒定：提取細胞總RNA后，將pcDNA-circRNA TCF25組分為RNase R組（加RNase R）和對照組（不加RNase R），逆轉錄后進行熒光定量PCR（real-time quantitative PCR，RT-qPCR）反應，分別檢測circRNA TCF25及其線性親本基因TCF25在人乳腺癌細胞MCF-7中的表達水平，明確circRNA TCF25在人乳腺癌MCF-7細胞中的結構穩定性。其中，MCF-7正向5’-TGGCAGATCA CACGTAC-3’，反向5’-AATGCCCGATATTGAGAGT CGTA-3’，產物長度187 bp。circRNA TCF25和β-actin引物及反應條件同1.2.2。

1.2.4 核漿分離法檢測circRNA TCF25的亞細胞定位：根據細胞核/細胞質細胞組分提取試劑盒的說明書進行操作，對pcDNA-circRNA TCF25組人乳腺癌MCF-7細胞進行核質分離。分別提取細胞質及細胞核RNA，將其逆轉錄成cDNA，以β-actin為內參，采用RT-qPCR檢測circRNA TCF25分別在細胞質及細胞核中相對表達量，circRNA TCF25和β-actin引物及反應條件同1.2.2。

1.2.5 細胞增殖活力檢測：將各組細胞按照1.0×104/孔接種至96 孔板上，分別在0、24、48、72 h時每孔加入20 μL MTT溶液（5 g/L）繼續孵育4 h，吸棄孔內上清液，每孔加入150 μL 二甲基亞砜（DMSO）充分震蕩溶解結晶物，通過多功能酶標儀檢測490 nm處各孔的光密度（optical density，OD）值，以OD490nm值代表細胞增殖活力。

1.2.6 細胞凋亡檢測：收集各組細胞，加入0.01%的胰酶消化制成1.0×104/mL的單細胞懸液。加入磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗細胞，離心收集細胞，加入500 μL結合緩沖液制成單細胞懸液，分別加入5 μL的Annexin V-FITC和PI溶液室溫下孵育10 min。于1 h內應用流式細胞儀檢測，通過CELL Quest軟件分析細胞凋亡率。

1.2.7PTEN、Ki-67、caspase-3mRNA表達檢測：收集各組MCF-7細胞，采用RT-qPCR檢測PTEN、Ki-67、caspase-3mRNA表達，方法同1.2.2。其中，PTEN正向5’-AGACGGAGAGGATGAATGTGC-3’，反向5’-AAC CGCGATTCCTCAATGCT-3’，產物長度344 bp；Ki-67正向5’-ACCGTAGGTACAGTT-3’，反向5’-GTCAAG CAGAGCATT-3’，產物長度139 bp；caspase-3正向5’-TGCAATATGCAGATAC-3’，反向5’-CCGATAAGTAC GATTAG-3’，產物長度266 bp；β-actin正向5’-TGAC CACGATACGAGC-3’，反向5’-CGACGAGGATACGA TCG-3’，產物長度145 bp。引物均由寶生物工程（大連）有限公司設計合成。

1.2.8 PTEN、Ki-67、caspase-3、活化的caspase-3蛋白表達檢測

收集各組細胞，加入RIPA細胞裂解液裂解提取細胞總蛋白，通過BCA法進行蛋白定量。100℃沸水浴10 min。將蛋白樣品按照30 μg/孔上樣，電泳分離并轉膜到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，加入PTEN、Ki-67、caspase-3、活化的caspase-3、β-actin一抗（1∶1 000）4℃培養過夜。次日加入相應二抗（1∶5 000）室溫孵育2 h。滴加化學發光試劑（ECL），顯影曝光，JP-2880凝膠成像系統成像，以β-actin為內參，應用Image J軟件對蛋白條帶進行定量分析。

1.2.9 circRNA TCF25與miR-128b的靶向關系分析

通過TargetScan數據庫（https：//www.targetscan.org/vert_80/）預測circRNA TCF25的靶基因。采用脂質體轉染法將WT circRNA TCF25、MUT circRNA TCF25熒光素酶報告載體分別與miR-128b模擬物、miR-NC共轉染至人乳腺癌MCF-7細胞。常規培養48 h后，按照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書檢測miR-128b mimics組和miR-NC組細胞中circRNA TCF25熒光素酶相對活性。

1.3 統計學分析

采用SPSS 22.0軟件進行統計學分析，符合正態分布的計量資料采用±s表示，2組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組細胞circRNA TCF25、miR-128b表達比較

與空白組和si-NC組比，si-circRNA TCF25組細胞circRNA TCF25表達降低，miR-128b表達升高；pcDNA-circRNA TCF25組細胞circRNA TCF25表達升高，miR-128b表達降低，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。與空白組和miR-NC組比，miR-128b mimic組細胞circRNA TCF25表達降低，miR-128b表達升高；miR-128b inhibitor組細胞circRNA TCF25表達升高，miR-128b表達降低，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。與pcDNA-circRNA TCF25組比較，pcDNA-circRNA TCF25+miR-128b mimic組細胞circRNA TCF25表達降低，miR-128b表達升高，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見表1。

表1 各組細胞circRNA TCF25、miR-128b表達比較（±s）Tab.1 Comparison of circRNA TCF25 and miR-128b expression in each group（±s）

表1 各組細胞circRNA TCF25、miR-128b表達比較（±s）Tab.1 Comparison of circRNA TCF25 and miR-128b expression in each group（±s）

1）P＜0.05 vs.blank group；2）P＜0.05 vs.si-NC group；3）P＜0.05 vs.miR-NC group；4）P＜0.05 vs.pcDNA-circRNA TCF25 group.

GroupncircRNA TCF25miR-128b Blank group61.02±0.201.00±0.19 si-NC group60.99±0.191.01±0.18 si-circRNA TCF25 group60.52±0.091），2）1.35±0.241），2）pcDNA-circRNA TCF25 group61.74±0.311），2）0.71±0.121），2）miR-NC group61.00±0.180.98±0.17 miR-128b mimic group60.66±0.121），3）1.93±0.371），3）miR-128b inhibitor group61.42±0.261），3）0.45±0.081），3）pcDNA-circRNA TCF25+miR-128b mimic group61.22±0.204）1.17±0.184）

2.2 circRNA TCF25的鑒定及其亞細胞定位

與對照組比較，Rnase R組circRNA TCF25相對表達量無統計學差異（P＞0.05），而TCF25mRNA相對表達量下降（P＜0.05），見表2。核質分離實驗顯示，人乳腺癌MCF-7細胞中circRNA TCF25在胞質中的相對表達量（1.65±0.28）高于其在細胞核中的相對表達量（0.61±0.10，P＜0.05）。

表2 circRNA TCF25與TCF25 mRNA表達比較（±s）Tab.2 Comparison of circRNA TCF25 and TCF25 mRNA expression（±s）

表2 circRNA TCF25與TCF25 mRNA表達比較（±s）Tab.2 Comparison of circRNA TCF25 and TCF25 mRNA expression（±s）

1）P＜0.05 vs.control group.

GroupncircRNA TCF25TCF25 mRNA Control61.04±0.200.98±0.19 RNase R60.96±0.18 0.22±0.031）

2.3 各組細胞增殖活力比較

在24 h、48 h、72 h 3個時間點，與空白組和si-NC組比較，si-circRNA TCF25組細胞增殖活力降低，pcDNA-circRNA TCF25組細胞增殖活力升高，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；與空白組和miR-NC組比較，miR-128b mimic組細胞增殖活力降低，miR-128b inhibitor組細胞增殖活力升高，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；與pcDNA-circRNA TCF25組比較，pcDNA-circRNA TCF25+miR-128b mimic組細胞增殖活力降低，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見圖1。

*P＜0.05 vs.blank group；#P＜0.05 vs.si-NC group；＆P＜0.05 vs.miR-NC group；△P＜0.05 vs.pcDNA-circRNA TCF25 group.圖1 各組細胞增殖活力比較Fig.1 Comparison of cell proliferation activity in each group

2.4 各組細胞凋亡情況比較

空白組、si-NC組、si-circRNA TCF25組、pcDNAcircRNA TCF25組、miR-NC組、miR-128b mimic組、miR-128b inhibitor組、pcDNA-circRNA TCF25+miR-128b mimic組細胞凋亡率分別為（17.38±2.16）%、（15.22±2.67）%、（43.75±7.98）%、（8.64±1.19）%、（16.16±2.51）%、（38.84±7.43）%、（9.19±1.46）%和（14.45±2.19）%。與空白組和si-NC組比較，sicircRNA TCF25組細胞凋亡率升高，pcDNA-circRNA TCF25組細胞凋亡率降低，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；與空白組和miR-NC組比較，miR-128b mimic組細胞凋亡率升高，miR-128b inhibitor組細胞凋亡率降低，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；與pcDNA-circRNA TCF25組比較，pcDNA-circRNA TCF25+miR-128b mimic組細胞凋亡率升高，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見圖2。

圖2 流式細胞術檢測各組細胞凋亡率Fig.2 Cell apoptosis rates in each group determined using flow cytometry

2.5 各組細胞PTEN、Ki-67、caspase-3 mRNA表達比較

與空白組和si-NC組比較，si-circRNA TCF25組細胞Ki-67mRNA表達降低，PTEN、caspase-3mRNA表達升高，pcDNA-circRNA TCF25組細胞Ki-67mRNA表達升高，PTEN、caspase-3mRNA表達降低，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；與空白組和miR-NC組比較，miR-128b mimic組細胞Ki-67mRNA表達降低，PTEN、caspase-3mRNA表達升高，miR-128b inhibitor組細胞Ki-67mRNA表達升高，PTEN、caspase-3mRNA表達降低，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；與pcDNA-circRNA TCF25組比較，pcDNA-circRNA TCF25+miR-128b mimic組細胞Ki-67mRNA表達降低，PTEN、caspase-3mRNA表達升高，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見表3。

表3 各組細胞PTEN、Ki-67、caspase-3 mRNA表達比較（±s）Tab.3 Comparison of PTEN，Ki-67，and caspase-3 mRNA expression in each group（±s）

表3 各組細胞PTEN、Ki-67、caspase-3 mRNA表達比較（±s）Tab.3 Comparison of PTEN，Ki-67，and caspase-3 mRNA expression in each group（±s）

1）P＜0.05 vs.blank group；2）P＜0.05 vs.si-NC group；3）P＜0.05 vs.miR-NC group；4）P＜0.05 vs.pcDNA-circRNA TCF25 group.

GroupnPTEN mRNAKi-67 mRNA Caspase-3 mRNA Blank group60.99±0.181.02±0.200.97±0.17 si-NC group61.00±0.190.98±0.190.98±0.18 si-circRNA TCF25 group61.37±0.221），2）0.59±0.101），2）1.52±0.281），2）pcDNA-circRNA TCF25 group60.62±0.111），2）1.45±0.241），2）0.73±0.131），2）miR-NC group60.97±0.161.00±0.191.03±0.20 miR-128b mimic group61.41±0.261），3）0.67±0.111），3）1.49±0.271），3）miR-128b inhibitor group60.75±0.131），3）1.64±0.301），3）0.54±0.091），3）pcDNA-circRNA TCF25+miR-128b mimic group60.89±0.154）1.14±0.224）0.95±0.174）

2.6 各組細胞PTEN、Ki-67、caspase-3、活化的caspase-3蛋白表達比較

與空白組和si-NC組比較，si-circRNA TCF25組細胞Ki-67蛋白表達降低，PTEN、caspase-3、活化的caspase-3蛋白表達升高；pcDNA-circRNA TCF25組細胞Ki-67蛋白表達升高，PTEN、caspase-3、活化的caspase-3蛋白表達降低，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。與空白組和miR-NC組比較，miR-128b mimic組細胞Ki-67蛋白表達降低，PTEN、caspase-3、活化的caspase-3蛋白表達升高；miR-128b inhibitor組細胞Ki-67蛋白表達升高，PTEN、caspase-3、活化的caspase-3蛋白表達降低，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。與pcDNA-circRNA TCF25組比較，pcDNAcircRNA TCF25+miR-128b mimic組細胞Ki-67蛋白表達降低，PTEN、caspase-3、活化的caspase-3蛋白表達升高，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見表4、圖3。

1，blank group；2，si-NC group；3，si-circRNA TCF25 group；4，pcDNAcircRNA TCF25 group；5，miR-NC group；6，miR-128b mimic group；7，miR-128b inhibitor group；8，pcDNA-circRNA TCF25+miR-128b mimic group.圖3 各組細胞PTEN、Ki-67、caspase-3、活化的caspase-3蛋白表達Fig.3 PTEN，Ki-67，caspase-3，and cleaved caspase-3 protein expression in each group

表4 各組細胞PTEN、Ki-67、caspase-3、活化的caspase-3蛋白表達比較（±s）Tab.4 Comparison of PTEN，Ki-67，caspase-3，and cleaved caspase-3 protein expression in each group（±s）

表4 各組細胞PTEN、Ki-67、caspase-3、活化的caspase-3蛋白表達比較（±s）Tab.4 Comparison of PTEN，Ki-67，caspase-3，and cleaved caspase-3 protein expression in each group（±s）

1）P＜0.05 vs.blank group；2）P＜0.05 vs.si-NC group；3）P＜0.05 vs.miR-NC group；4）P＜0.05 vs.pcDNA-circRNA TCF25 group.

GroupnPTENKi-67Caspase-3Cleaved caspase-3 Blank group60.55±0.100.83±0.150.62±0.110.20±0.03 si-NC group60.52±0.090.80±0.140.58±0.100.21±0.04 si-circRNA TCF25 group60.78±0.131），2） 0.62±0.111），2）0.83±0.151），2）0.54±0.091），2）pcDNA-circRNA TCF25 group60.42±0.071），2）1.09±0.191），2）0.45±0.081），2） 0.11±0.021），2）miR-NC group60.49±0.080.85±0.160.63±0.120.23±0.04 miR-128b mimic group60.66±0.121），3）0.57±0.101），3） 0.94±0.161），3）0.60±0.111），3）miR-128b inhibitor group60.37±0.061），3）1.14±0.211），3）0.40±0.071），3）0.09±0.011），3）pcDNA-circRNA TCF25+miR-128b mimic group60.59±0.104）0.77±0.134）0.68±0.124）0.24±0.044）

2.7 circRNA TCF25與miR-128b的靶向關系分析

TargetScan數據庫分析發現，miR-128b與circRNA TCF25存在結合位點，提示miR-128b可能是circRNA TCF25的靶基因，見圖4。在轉染WT circRNA TCF25細胞中，miR-128b mimic組細胞相對熒光強度低于miR-NC組細胞，差異有統計學意義（P＜0.05）；在轉染MUT circRNA TCF25細胞中，miR-128b mimic組和miR-NC組細胞相對熒光強度差異無統計學意義（P＞0.05），見圖4。

圖4 circRNA TCF25與miR-128b結合位點及各細胞相對熒光強度Fig.4 CircRNA TCF25 and miR-128b binding sites and relative fluorescence intensity in cells

3 討論

目前乳腺癌的發病機制尚不清楚。普遍認為乳腺癌的發生是體內外多種因素（包括遺傳、高齡、肥胖、高脂肪飲食、月經初潮早、首次妊娠晚、抽煙酗酒等）共同作用的結果［7］。臨床上治療乳腺癌以手術治療為主，輔以放化療、內分泌治療等綜合治療策略，但患者存在不良反應多、復發轉移率高等問題。近年來，分子靶向藥物的出現為乳腺癌的臨床治療提供了新思路，因此探究乳腺癌新的分子靶點對乳腺癌治療意義重大。

circRNA是近年來發現的，它廣泛存在于真核細胞內，結構較為穩定，基因序列高度保守［8］。眾多研究［9-11］發現，circRNA可通過競爭性結合miRNA來解除miRNA對靶基因表達的抑制作用，在人類多種疾病的發生發展過程中發揮作用。王敏等［12］研究顯示，circRNA TCF25可通過靶向抑制miR-103a-3p/miR-107表達，促進細胞分裂蛋白激酶6（CDK6）的表達，進而在膀胱癌的增殖和遷移中發揮促進作用。LI等［13］發現，過表達circRNA TCF25可通過降低miR-206的水平促進骨肉瘤細胞增殖、遷移和侵襲。本研究結果顯示，與未經RNase R酶處理的對照組相比，circRNA TCF25的相對表達量在RNase R酶處理后無明顯變化，而線性TCF25的相對表達量在經RNase R酶處理后降低，且circRNA TCF25在胞質中的相對表達量高于細胞核，驗證了circRNA TCF25的環狀特性，且證實了其主要定位于胞質。miR-128被認為是一種具有抑癌和促癌雙面功能的miRNA，通常情況下發揮抑癌基因的作用，同時具有調節細胞增殖、凋亡和耐藥等作用［14］。LIU等［15］指出，長鏈非編碼RNA漿細胞瘤變異易位1（PVT1）可通過靶向抑制miR-128的表達誘導乳腺癌細胞的上皮-間質轉化、增殖和轉移，參與乳腺癌的進展。本研究中，與空白組和si-NC組比較，si-circRNA TCF25組細胞增殖活力降低，凋亡率升高；pcDNA-circRNA TCF25組細胞增殖活力升高，凋亡率降低。與空白組和miR-NC組比較，miR-128b mimic組細胞增殖活力降低，凋亡率升高；miR-128b inhibitor組細胞增殖活力升高，凋亡率降低。與pcDNA-circRNA TCF25組比較，pcDNA-circRNA TCF25+miR-128b mimic組細胞增殖活力降低，凋亡率升高，提示circRNA TCF25可促進人乳腺癌細胞MCF-7增殖，抑制其凋亡；而miR-128b能夠抑制人乳腺癌細胞MCF-7增殖，促進其凋亡。而且上調miR-128b表達能夠逆轉過表達circRNA TCF25對人乳腺癌細胞MCF-7增殖、凋亡的影響，與以往研究結果一致。

本研究還發現，與空白組和si-NC組比較，si-circ-RNA TCF25組細胞Ki-67表達降低，PTEN、caspase-3、活化的caspase-3表達升高；pcDNA-circRNA TCF25組細胞Ki-67表達升高，PTEN、caspase-3、活化的caspase-3表達降低。與空白組和miR-NC組比較，miR-128b mimic組細胞Ki-67表達降低，PTEN、caspase-3、活化的caspase-3表達升高；miR-128b inhibitor組細胞Ki-67表達升高，PTEN、caspase-3、活化的caspase-3表達降低。與pcDNA-circRNA TCF25組比較，pcDNA-circRNA TCF25+miR-128b mimic組細胞Ki-67表達降低，PTEN、caspase-3、活化的caspase-3表達升高，提示circRNA TCF25有促進Ki-67的表達，抑制PTEN、caspase-3、活化的caspase-3表達的作用，而miR-128b的作用與circ-RNA TCF25相反，且上調miR-128b表達能夠逆轉過表達circRNA TCF25對人乳腺癌細胞MCF-7增殖、凋亡相關基因蛋白表達的影響。PTEN是一種具有特異性磷酸酯酶活性的抑癌基因，具有抑制腫瘤細胞生長增殖、誘導細胞周期阻滯和促進細胞凋亡等多種功能。相關研究［16］顯示，PTEN在多種腫瘤細胞中表達水平降低。caspase-3是細胞凋亡中的最后執行因子，當細胞受到凋亡信號刺激時caspase-3活化，活化的caspase-3通過酶切割特異性底物、DNA修復相關分子及細胞骨架蛋白等促進細胞凋亡［17］。Ki-67是一種核蛋白，表達于細胞生長發育的各個周期，能反映組織細胞的增殖活性［18］。馬兆霞［19］指出，miR-128可通過激活PTEN信號通路參與調控子宮內膜癌細胞增殖、凋亡、侵襲和遷移等細胞生物學行為；MA等［20］研究顯示，miR-128b可通過促進caspase-3表達促進大腦中動脈閉塞大鼠腦組織細胞凋亡。LIANG等［21］發現，miR-128可通過下調Ki-67在胃癌細胞中的表達抑制胃癌細胞的生長，提高化療敏感性。雙熒光素酶實驗結果證實了circRNA TCF25可靶向調控miR-128b，因此合理推測circRNA TCF25可能是通過靶向抑制miR-128b的表達，調控其下游的細胞增殖、凋亡相關基因表達來發揮促進人乳腺癌細胞MCF-7增殖，抑制其凋亡作用的。

綜上所述，circRNA TCF25可能是通過靶向抑制miR-128b表達，促進Ki-67表達，抑制PTEN、caspase-3、活化的caspase-3表達，發揮促進人乳腺癌細胞MCF-7增殖，抑制其凋亡作用的。本研究初步闡釋了circ-RNA TCF25對人乳腺癌細胞MCF-7增殖、凋亡的影響及可能作用機制，為乳腺癌的臨床治療提供了潛在靶點。