長鏈非編碼RNA-NRON對小鼠心肌梗死后細胞凋亡的作用機制研究

高涵，張春晶，李淑艷，師巖，郭紅艷，楊超

（齊齊哈爾醫學院醫學技術學院生物化學教研室，黑龍江 齊齊哈爾 161006）

心肌梗死（myocardial infarction，MI）是一種高發病率、高致死率的心血管疾病［1］。大量心肌細胞因缺血缺氧導致凋亡而丟失，是引起MI后心肌重構、心力衰竭及死亡的根本原因［2-3］。因此，抑制心肌細胞凋亡是治療MI的重要策略。

電壓依賴性陰離子通道蛋白（voltage dependent anion channel，VDAC）是位于線粒體外膜上的通道蛋白，可通過多種機制影響細胞凋亡進程［4］。VDAC的表達異常可導致多種疾病的發生，如癌癥、阿爾茨海默病等［5］。長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）廣泛參與細胞凋亡、信號傳導、增殖、分化等重要生物學進程，在心血管疾病的發生發展中具有重要意義［6-7］。lncRNA-NRON是活化T細胞核因子（nuclear factor of activated T cells，NFAT）的非編碼RNA抑制物［8］。研究表明，lncRNA-NRON可通過抑制由心房肌細胞激活的M1巨噬細胞減輕心房纖維化［9］，在心力衰竭患者血漿中高表達［10］，還可促進小鼠心肌肥厚的發生發展［11］，但其在MI中的作用尚不明確。本研究擬通過構建MI小鼠動物模型，檢測lncRNA-NRON對小鼠MI后細胞凋亡的影響及其與VDAC的調控關系，旨在為MI機制的研究和治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

1.1.1 實驗動物及MI模型建立：C57BL/6成年雄性小鼠40只，體質量20～25 g，由遼寧長生生物技術股份有限公司提供。小鼠適應性飼養1周，腹腔麻醉（阿弗汀0.2 g/kg）后固定，氣管插管連呼吸機。在小鼠頭部向下第2和第3肋骨間打開胸腔，暴露心臟，用7-0結扎線結扎左心耳下方1～2 mm處（冠狀動脈左前降支位置）心室肌。觀察心電圖出現ST段抬高，則表明結扎位置正確，MI模型建立成功。本研究獲得齊齊哈爾醫學院實驗動物倫理委員會批準，所有操作均按照相關指南執行。

1.1.2 分組和預處理：將40只小鼠隨機分成假手術（Sham）組、MI組、MI+注入lncRNA-NRON干擾慢病毒（MI+shNRON）組、MI+注入陰性對照慢病毒（MI+NC）組4組，每組10只。Sham組僅開胸不結扎，MI組僅制備MI模型，MI+shNRON組/MI+NC組先給予小鼠心室壁點注射敲減lncRNA-NRON慢病毒/陰性對照慢病毒后，再制備MI模型。所有小鼠標準飼養7 d后麻醉處死，取出心臟，切取左心室MI邊緣區缺血組織，置于-80℃凍存。

1.2 方法

1.2.1 HE染色：用生理鹽水沖洗心臟，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片（厚5 μm），HE染色。在光學顯微鏡下觀察心肌組織病理損傷變化。

1.2.2 TTC染色：迅速取出心臟，洗凈后于-80℃冷凍10 min，取出后自心尖向結扎線方向切成5片，浸入2%TTC溶液，37℃孵育15 min，梗死區染為白色，非梗死區染為深紅色。用Image J軟件計算梗死百分比（%）=梗死區面積/（梗死區面積+非梗死區面積）×100。1.2.3 TUNEL染色：將心肌組織冰凍切片置于4%多聚甲醛中固定，PBS漂洗3次后，用0.1%Triton X-100穿透組織，按照TUNEL試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）說明書染色，用DAPI染細胞核，置于熒光顯微鏡下觀察及拍攝。計算凋亡率（%）=凋亡細胞數/總細胞數×100。

1.2.4 實時PCR檢測lncRNA-NRON表達水平：TRIzol法提取心肌組織總RNA，按照試劑盒（日本TOYOBO公司）說明書逆轉錄cDNA，采用SYBR Green法進行實時定量PCR檢測。β-actin做內參照。引物序列見表1。

表1 實時定量PCR引物序列Tab.1 Primer sequences for real-time PCR

1.2.5 RPIseq數據庫預測lncRNA-NRON與VDAC之間的相互作用關系：RPIseq（http：//pridb.gdcb.iastate.edu/RPISeq/）數據庫［12-13］是一個根據RNA和蛋白質的序列，采用隨機森林和支持向量機2種算法對RNA和蛋白質的相互作用進行預測的軟件。計算結果為2種算法得出的互作概率，＞0.5為陽性結果，即二者可能存在相互作用關系。

1.2.6 Western blotting：取適量心肌組織，用手術剪剪碎，加入RIPA裂解液提取總蛋白，BCA法檢測蛋白濃度，SDS-PAGE電泳分離蛋白，轉膜，封閉，孵育（caspase-3、Bax、Bcl-2、VDAC、β-actin）一抗、二抗，ECL顯色，應用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.3 統計學分析

采用GraphPad Prism 7.0軟件進行統計學分析。計量資料用±s表示，2組比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MI小鼠模型建立成功

采用冠狀動脈左前降支結扎法構建小鼠MI模型，觀察心電圖，與Sham組相比，MI組ST段抬高呈弓背向上型，表明MI小鼠模型建立成功。見圖1。

圖1 MI小鼠建模后心電圖ST段抬高Fig.1 ECG showed ST segment elevation after myocardial infarction

2.2 各組lncRNA-NRON表達水平

構建lncRNA-NRON慢病毒干擾載體，采用主動脈夾閉法將病毒載體注入小鼠左心室腔內，同時結扎冠狀動脈左前降支。1周后，實時PCR檢測各組小鼠心肌組織中lncRNA-NRON表達水平。結果顯示，與Sham組（1.00±0.10）相比，MI組（2.66±1.06）lncRNA-NRON表達顯著升高；與MI組相比，MI+shNRON組（1.15±0.45）lncRNA-NRON表達下降，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。MI+NC組（2.57±0.31）與MI組比較，差異無統計學意義。

2.3 各組小鼠心肌組織病理損傷情況

HE染色檢測各組小鼠心肌組織病理學改變情況，結果顯示，Sham組心肌細胞排列整齊，結構清晰，MI組心肌炎癥細胞浸潤明顯，間質充血嚴重，MI+shNRON組心肌組織病理損傷較MI組明顯減輕，MI+NC組與MI組相比則無明顯改善。見圖2。

圖2 HE染色檢測各組心肌組織病理損傷 ×200Fig.2 HE staining was used to examine pathological changes in myocardial tissue ×200

2.4 各組小鼠MI面積比較

TTC染色檢測各組心肌的梗死百分比，結果顯示，MI組梗死百分比［（34.62±1.82）%］較Sham組［（0±0）%］顯著升高，與MI組相比，MI+shNRON組梗死百分比［（24.50±2.24）%］顯著下降，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。MI+NC組［（33.73±2.34）%］與MI組比較無顯著差異。

2.5 各組小鼠心肌細胞凋亡情況

TUNEL實驗檢測各組心肌細胞凋亡情況，結果顯示，與Sham組相比，MI組可明顯檢測到凋亡信號，與MI組相比，MI+shNRON組凋亡信號下降，MI+NC組則無明顯變化（圖3）。進一步計算凋亡率顯示，MI組凋亡率［（35.12±3.86）%］高于Sham組［（2.12±1.23）%］，MI+shNRON組凋亡率［（19.34±3.15）%］低于MI組，差異均有統計學意義（P＜0.05），而MI+NC組凋亡率［（31.92±3.44）%］與MI組相比，無統計學差異。

圖3 TUNEL染色檢測各組心肌細胞凋亡情況×200Fig.3 Apoptosis of myocardial cells in each group was detected with TUNEL ×200

2.6 各組小鼠心肌組織凋亡相關蛋白表達情況

Western blotting結果顯示，與Sham組相比，MI組促凋亡因子caspase-3（1.69±0.37）、Bax（1.92±0.41）蛋白表達水平升高，抑制凋亡因子Bcl-2（0.61±0.11）蛋白表達水平下降；與MI組相比，MI+shNRON組caspase-3（1.13±0.04）、Bax（1.28±0.12）蛋白表達水平下降，Bcl-2（1.00±0.13）蛋白表達水平升高，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。MI+NC組caspase-3（1.60±0.16）、Bax（1.95±0.21）及Bcl-2（0.61±0.15）蛋白表達水平與MI組比較無統計學差異。見圖4。

1，Sham group；2，MI group；3，MI+shNRON group；4，MI+NC group.圖4 Western blotting檢測各組凋亡相關蛋白表達情況Fig.4 The expression of apoptosis-related proteins in each group was detected with Western blotting

2.7 lncRNA-NRON調控VDAC表達水平

用RPIseq數據庫預測lncRNA-NRON與VDAC之間的相互作用，結果顯示，根據支持向量機算法獲得互作概率為0.96，表明lncRNA-NRON與VDAC之間有非常大可能性存在互作關系。進一步在MI模型中檢測敲減lncRNA-NRON對VDAC表達的影響，結果表明，與Sham組（1.00±0.00）相比，MI組VDAC蛋白表達（1.67±0.19）顯著升高，MI+shNRON組VDAC蛋白表達水平（1.10±0.05）較MI組顯著下降，差異有統計學意義（P＜0.05）。MI+NC組（1.61±0.11）與MI組比較無統計學差異。提示lncRNA-NRON可調控VDAC蛋白的表達。見圖5。

圖5 敲減lncRNA-NRON對MI小鼠心肌組織中VDAC蛋白表達的影響Fig.5 Effects of lncRNA-NRON knockdown on the expression of VDAC in myocardium of MI mice

3 討論

MI發病急，進展快，致死率高，可并發心律失常、心力衰竭等。研究表明，lncRNA可通過調控細胞凋亡、增殖、自噬等多種進程參與MI發生。如lncRNA-CAIF通過靶向抑制P53，干擾心肌蛋白轉錄，從而抑制自噬、緩解MI［14］。NFAT是細胞內重要的轉錄因子，參與癌癥、心血管疾病、糖尿病等多種疾病的發生［15］。lncRNA-NRON是NFAT的非編碼阻遏物，可作為RNA-蛋白復合物的細胞質支架，調節NFAT在T細胞中的定位和活性［16］。目前關于lncRNA-NRON的研究多集中于癌癥，如XIONG等［17］發現，lncRNA-NRON在膀胱癌組織和細胞中顯著高表達，敲低lncRNA-NRON可抑制膀胱癌細胞的增殖、遷移、侵襲和成瘤能力。GUO等［18］研究發現，lncRNA-NRON通過增強E3連接酶MDM2對腫瘤抑制底物的活性促進腫瘤發生，且與乳腺癌患者的不良預后顯著相關。lncRNA-NRON還可抑制上皮細胞向間質細胞轉化過程，從而影響肝癌細胞的生長和轉移［19］。lncRNA-NRON在心臟疾病中的研究相對較少，XUAN等［10］檢測了72例心力衰竭患者和60例非心力衰竭對照者血漿中13個與心血管相關的lncRNA的表達水平，發現lncRNA-NRON在心力衰竭患者的血漿樣本中呈顯著高表達，可能成為預測心力衰竭的新型生物標志物。HOEPFNER等［11］最新發現，心肌細胞特異性過表達lncRNA-NRON可促進主動脈縮窄誘導的心肌肥大，而心肌細胞特異性敲除lncRNA-NRON則顯示出抗心肌肥大的作用。

本研究首次探討了lncRNA-NRON在MI中的作用及其對細胞凋亡的影響。首先成功構建了MI小鼠模型，檢測發現lncRNA-NRON在MI小鼠心肌組織中表達顯著升高。然后，構建敲減lncRNA-NRON慢病毒，注入小鼠心室肌后再構建MI模型，檢測發現lncRNA-NRON的表達與MI組相比顯著下降，證實敲減lncRNA-NRON成功。HE染色結果顯示，敲減lncRNA-NRON可明顯改善心肌組織病理損傷，減少炎癥細胞浸潤。TTC染色表明，敲減lncRNA-NRON可有效減少MI小鼠梗死面積。以上均提示敲減lncRNA-NRON可改善MI小鼠心肌損傷，發揮心肌保護作用。MI后心肌細胞缺血缺氧發生細胞凋亡，可進一步加劇心肌損傷，因此抑制細胞凋亡是改善MI的重要策略，本研究中，TUNEL及Western blotting結果均證實敲減lncRNA-NRON后可顯著降低心肌細胞凋亡率，抑制凋亡相關基因caspase-3及Bax的表達，表明敲減lncRNA-NRON可有效抑制MI后細胞凋亡的發生，減輕心肌損傷。VDAC是線粒體外膜上分子或離子交換的出入通道，VDAC通道開放可促進鈣離子內流，線粒體腫脹、通透性增加，啟動細胞凋亡進程。研究［20］顯示，VDAC表達上調在缺血性心肌病中發揮重要作用，VDAC過表達可通過激活線粒體凋亡加重心肌損傷，抑制丹參酮對缺氧心肌的保護作用。敲低VDAC可增強miR-7a-5p對缺氧/復氧誘導的細胞損傷的保護作用［21］。本研究首次探討了lncRNA-NRON對VDAC的調控作用，通過RPIseq數據庫預測出lncRNA-NRON與VDAC之間的互作概率高達0.96，進一步檢測發現，VDAC在小鼠MI模型中的表達顯著升高，而敲減lncRNA-NRON后可有效逆轉這一現象，以上結果表明lncRNA-NRON可能是通過與VDAC結合并下調其表達抑制細胞凋亡的發生，從而發揮心肌保護作用。

綜上所述，本研究首次發現lncRNA-NRON在小鼠MI模型心肌中表達顯著上調，敲減lncRNA-NRON可減輕心肌組織病理損傷，減小MI面積，抑制MI后細胞凋亡，發揮心肌保護作用。其具體機制可能是lncRNA-NRON通過與VDAC結合并抑制其表達，影響細胞凋亡進程相關。本研究為預防和治療MI后心力衰竭提供了新的證據。