中藥白礬與偽品銨明礬的中紅外光譜快速鑒別△

朱雨欣，董玲，宋平順，倪琳*，陳建波*

1.北京中醫藥大學 生命科學學院，北京 102488；2.甘肅省藥品檢驗研究院，甘肅 蘭州 730070

中藥白礬是由硫酸鹽類礦物明礬石提煉制成，其中十二水合硫酸鋁鉀 [KAl(SO4)2·12H2O] 質量分數不應低于99.0%[1]111-112。2016 年，中國食品藥品檢定研究院收集來自全國范圍內飲片生產企業與市場的159 批白礬樣品，發現其中125 批樣品的含氮量偏高、銨鹽檢查項不符合規定[2]。此后的全國藥品抽檢中白礬（包括其煅制品枯礬）的不合格率也超過30%[3-4]。白礬不僅自身是一味常用中藥，也是半夏、天南星、白附子等的炮制輔料。因此，白礬摻偽會導致較多品種中藥飲片與中成藥的質量隱患，必須建立準確有效的白礬真偽鑒別方法。

當前市售白礬偽品主要是銨明礬[2-3]，其成分為十二水合硫酸鋁銨 [NH4Al(SO4)2·12H2O]，因外觀性狀與白礬正品基本一致而難以分辨。《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）2020 年版將白礬質量標準中的銨鹽檢查法修訂為氮測定法（通則0704 第二法或第三法，無需消解），規定白礬藥材和飲片中含銨鹽以總氮（N）計不超過0.3%[1]111-112，從而可以準確識別銨明礬摻偽的白礬樣品。但是，《中國藥典》2020 年版規定的半微量氮測定法（通則0704第二法）和定氮儀法（通則0704第三法）的操作繁瑣，需要使用硼酸溶液、氫氧化鈉溶液、硫酸滴定液、滴定指示劑等化學試劑，檢測過程耗時長、成本高、環境污染大。在國家全力實現“雙碳”目標的戰略背景下，中藥鑒別方法也應朝向更加簡便、快速、費用低、綠色的方向發展，提高檢測效率，降低檢測成本，減少檢測過程的碳排放。

已有研究探索了使用掃描電鏡、X 射線衍射、近紅外（NIR）光譜、拉曼（Raman）光譜等分析技術對白礬、枯礬、銨明礬及其煅制品進行檢測的可行性[5-8]。掃描電鏡與X 射線衍射設備要求較高，不適用于日常檢驗。NIR 光譜與Raman光譜操作簡單，但是鄰近譜峰重疊導致白礬與銨明礬的差異特征峰不夠直觀[8]。另外，NIR光譜與Raman光譜并非《中國藥典》2020 年版使用的化學藥或中藥鑒別標準方法，采用這2 種技術新建白礬鑒別標準可能增加檢驗機構和企業的設備成本。相比之下，《中國藥典》2020 年版中稱為“紅外分光光度法”[9]的中紅外（MIR）光譜具有與NIR 光譜、Raman 光譜相同的簡便、快速、費用低、綠色等優勢。此外，MIR 光譜可以同時表征中藥樣品有機成分和無機成分的整體組成[10]，既能靶向檢測已知摻假物質，又能非靶向篩查未知摻假物質。此外，MIR 光譜作為國內外藥典普遍使用的化學藥鑒別標準方法，也是《中國藥典》2020 年版規定的中藥石膏鑒別標準方法[1]98，所需設備在相關機構與企業的普及率很高，可以顯著降低新檢測方法的開發與應用成本。

1 材料

1.1 儀器與試藥

BT25S 型電子分析天平（德國Sartorius 公司）；配有Platinum ATR 附件的Vertex 70 型傅立葉變換紅外光譜儀（德國Bruker公司）；配有UATR Two 附件的Spectrum 2 型傅立葉變換紅外光譜儀（美國PerkinElmer 公司）；內置衰減ATR 附件的IT2000 型傅立葉變換紅外光譜儀（北京鑒知技術有限公司）；Spectrum 2 與IT2000 型光譜儀主要用于樣品MIR 測試結果重現性考察，其余測試工作均使用Vertex 70型光譜儀完成，3 臺光譜儀放置于不同機構的實驗室。

十二水合硫酸鋁鉀（批號：Z16A10Y95447，純度：99.8%）、十二水合硫酸鋁銨（批號：Z26J10Y9 1549，純度：99.5%）均購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 樣品

23 批白礬樣品來源見表1，經北京中醫藥大學中藥學院王晶娟教授鑒定，其中11 批（A01～A11）為正品白礬[KAl(SO4)2·12H2O]、12 批（B01～B12）為偽品銨明礬 [NH4Al(SO4)2·12H2O]。

表1 白礬樣品來源信息

2 方法

2.1 樣品處理

每批樣品取50 g 左右粉碎，取粉末直接進行MIR光譜測試。

不同粒度白礬和銨明礬樣品制備：將白礬（A01）與銨明礬（B01）粉碎后依次通過二號篩、四號篩、六號篩、九號篩，得到不同粒度的樣品粉末。

白礬和銨明礬模擬混合物制備：6 個白礬樣品、6 個銨礬樣品分別配對（A01+B01、A02+B07、A03+B02、A04+B09、A05+B10、A06+B11）；每組配對的白礬和銨明礬樣品各自粉碎，過四號篩后按比例混勻，獲得銨明礬質量分數分別為5%、10%、20%的混合物（A01+B01 組合中增加銨明礬質量分數為1%的混合物）。

2.2 MIR光譜測試與數據處理

每個樣品測試前先后用純水、無水乙醇清潔ATR 附件的內反射晶體表面，溶劑揮干后測量背景光譜；然后取樣品粉末適量置于內反射晶體表面，用ATR 附件自帶壓桿使樣品與晶體表面緊密接觸，測量樣品光譜。MIR 光譜測量范圍4000～400 cm-1（IT2000型光譜儀為4000～500 cm-1），光譜分辨率為4 cm-1，單張光譜累計掃描32 次，以透過率為縱坐標記錄樣品原始光譜。

使用Spectrum v10.4.3 軟件對樣品原始光譜依次進行如下處理：1）通過插值功能將所有光譜橫坐標間隔調整為1 cm-1；2）將光譜縱坐標由透過率轉為吸光度（A）；3）對光譜進行ATR 校正，接觸因子設為0；4）對光譜進行自動基線校正；5）對光譜縱坐標進行歸一化，使2000～800 cm-1區域內最高A為1、最低A為0；6）以1500、1300 cm-1為基線兩端參考點，計算1500～1300 cm-1區域內整體峰面積、1450～1430 cm-1區域內最強峰高度，然后用Microsoft Excel 2016 軟件進行峰面積與峰高度統計分析。

3 結果與討論

3.1 白礬與銨明礬的MIR光譜測試方法考察

為了提高樣品均勻度與代表性，固體樣品通常粉碎后進行MIR 光譜測試，而粉末粒度是影響ATR法測量結果的潛在因素。如圖1 所示，粒度越小的白礬與銨明礬MIR 光譜中水分子O-H 伸縮振動峰（3000 cm-1附近寬強峰）、彎曲振動峰（1600 cm-1附近中等強峰）的強度越低，可能是因為樣品粒度越小時粉碎過程中水分損失越多。但是，粉末粒度沒有顯著改變各吸收峰位置，幾乎不影響1436 cm-1附近吸收峰是否存在的判斷結果。因此，為了簡化前處理過程，白礬或銨明礬樣品粉碎后無需過篩，直接使用ATR法測試MIR光譜即可。

1.3 統計分析 使用 SPSS 16.0和 Microsoft Office Excel 2007進行統計學分析，主要采用均數、標準差、全距、總數、百分比進行統計描述，采用t檢驗。

圖1 不同粒度的白礬與銨明礬的MIR光譜

白礬（A01）和銨明礬（B01）在同一臺MIR光譜儀（Vertex 70）上連續6 次測量結果見圖2。水分子O-H 伸縮振動峰（3000 cm-1附近寬強峰）強度有一定變化，可能是因為測量過程的結晶水揮發散失。如表2、表3 所示，白礬（A01）和銨明礬（B01）重復測試的峰位置RSD≤0.3%，說明本研究采用的MIR光譜測試方法重復性良好。

圖2 同一儀器重復測試的白礬與銨明礬的MIR光譜

表2 同一儀器重復測試的白礬（A01）MIR光譜吸收峰波數 cm-1

表3 同一儀器重復測試的銨明礬（B01）MIR光譜吸收峰波數 cm-1

白礬（A01）和銨明礬（B01）在不同實驗室不同MIR 光譜儀上的測量結果見圖3。水分子O-H 伸縮振動峰（3000 cm-1附近寬強峰）、彎曲振動峰（1600 cm-1附近中等強峰）強度有較為明顯的差異，可能是因為不同測試環境中測量過程的結晶水揮發散失程度不同。如表4 所示，白礬（A01）和銨明礬（B01）在不同實驗室不同MIR 光譜儀上測試的峰位置RSD≤1.0%，說明本研究采用的MIR光譜測試方法重現性良好。

圖3 不同實驗室不同儀器測試的白礬與銨明礬的MIR光譜

表4 不同實驗室不同儀器測試的白礬（A01）與銨明礬（B01）MIR光譜吸收峰波數 cm-1

3.2 白礬與銨明礬的MIR光譜解析與差異吸收峰

如圖4 所示，十二水合硫酸鋁鉀MIR 光譜中3346、2895、2469 cm-1為水分子O-H 伸縮振動峰，1615 cm-1為水分子O-H 彎曲振動峰，1190、1083、1061、974、916 cm-1為硫酸根S-O 伸縮振動峰，684、589 cm-1為硫酸根S-O 彎曲振動峰；十二水合硫酸鋁銨MIR光譜中3318、2887、2460 cm-1為水分子O-H 伸縮振動峰，1622 cm-1為水分子O-H 彎曲振動峰，1187、1067、909 cm-1為硫酸根S-O 伸縮振動峰，679、577 cm-1為硫酸根S-O 彎曲振動峰，3204、3075 cm-1為銨離子N-H 伸縮振動峰，1435 cm-1為銨離子N-H彎曲振動峰。

圖4 市售真、偽白礬樣品與對應化合物的MIR光譜

比較十二水合硫酸鋁鉀與十二水合硫酸鋁銨的MIR 光譜可知，兩者明顯的差異是銨離子相關吸收峰。但是，3204、3075 cm-1附近的銨離子N-H 伸縮振動峰與水分子O-H 伸縮振動峰重疊嚴重而不易識別，所以1435 cm-1處的銨離子N-H 彎曲振動峰是辨別十二水合硫酸鋁鉀與十二水合硫酸鋁銨的關鍵特征峰。白礬與十二水合硫酸鋁鉀的MIR 光譜基本一致，而銨明礬與十二水合硫酸鋁銨的MIR 光譜基本一致，所以銨離子N-H 彎曲振動峰也是區分白礬與銨明礬的關鍵特征峰。可能因為含有不同比例的水分和雜質，本研究所收集的銨明礬樣品的N-H 彎曲振動峰在（1436±1）cm-1區域有微小變動。

為了盡可能減少1600 cm-1附近O-H 彎曲振動峰對1436 cm-1附近N-H 彎曲振動峰強度計算的影響，本研究選擇1500、1300 cm-12 點建立局部基線。如圖5 所示，分別以峰面積（1500～1300 cm-1區域光譜在局部基線以上的積分面積）、峰高度（1450～1430 cm-1區域光譜最高點到局部基線的距離）作為N-H 彎曲振動峰強度的量化參數。白礬沒有N-H 彎曲振動峰，而O-H 彎曲振動峰在1500～1300 cm-1區域為下凹曲線，因此根據上述規則計算出的N-H 彎曲振動峰的面積和高度均為負值。無論是用峰面積還是峰高度作為量化參數，白礬與銨明礬的N-H 彎曲振動峰強度都有極顯著差異（P＜0.001）。也就是說，1436 cm-1附近的NH 彎曲振動峰可以作為鑒別白礬與銨明礬的專屬性特征峰。

圖5 市售真、偽白礬樣品的MIR光譜中銨離子特征峰強度

3.3 白礬與銨明礬混合物的MIR光譜檢測

白礬（A01）與銨明礬（B01）不同比例混合物的MIR 光譜見圖6。可以看到，隨著混合物中銨明礬含量增加，1436 cm-1附近的N-H 彎曲振動峰也逐漸增強。無論是用峰面積還是峰高度評價，白礬（A01）與銨明礬（B01）混合物MIR 光譜中N-H 彎曲振動峰強度與銨明礬含量都有良好的線性關系（圖7）。但是，不同白礬與銨明礬的混合物MIR 光譜放在一起時，N-H 彎曲振動峰強度與銨明礬含量的線性度較差（圖8）。主要原因可能是水分和雜質含量比例不同，導致不同銨明礬樣品的N-H 彎曲振動峰的強度不同（圖4）。因此，MIR 光譜中N-H 彎曲振動峰暫時不宜作為白礬樣品中摻入銨明礬的定量檢測，應當作為白礬樣品摻假的定性或限量檢測方法。

圖6 白礬（A01）與銨明礬（B01）不同比例混合物的MIR光譜中銨離子特征峰強度

圖7 白礬（A01）與銨明礬（B01）混合物MIR光譜中銨離子特征峰強度與銨明礬質量分數的線性關系

圖8 不同白礬與銨明礬混合物的MIR光譜中銨離子特征峰強度

如圖5 所示，11 批白礬樣品中N-H 彎曲振動峰的峰面積均值為-0.727 3 cm-1，標準差為0.288 8 cm-1，99%置信區間上限為0.017 7 cm-1；峰高度均值為-0.003 9，標準差為0.001 5，99%置信區間上限為-0.000 1。也就是說，以1500、1300 cm-12 點建立局部基線，如果待測白礬樣品的1500～1300 cm-1區域光譜積分面積超過0.017 7 cm-1，或者1450～1430 cm-1區域光譜最大高度超過-0.000 1，可以判斷該樣品為銨明礬或者摻入銨明礬的白礬。

11 批白礬樣品的MIR 光譜中N-H 彎曲振動峰的峰面積最高值為-0.240 0 cm-1，峰高度最高值為-0.002 3 A，按照上述規則均可判斷為未摻假樣品；12 批次銨明礬樣品的N-H 彎曲振動峰的峰面積最低值為14.220 0 cm-1，峰高度最低值為0.308 5，按照上述規則均可判斷為摻假樣品。

本研究進一步用6 個白礬樣品、6 個銨明礬樣品分別配對制成銨明礬質量分數為1%、5%、10%、20%的混合物，每個樣品測試3 次，根據上述N-H彎曲振動峰識別規則判斷混合物是否為摻假樣品。如圖8所示，銨明礬質量分數為10%的6組混合物樣品、銨明礬質量分數為20%的6組混合物樣品的各3次檢測結果均為摻假樣品，而銨明礬質量分數為1%的1組混合物樣品（A01+B01）的3次檢測結果均為假陰性。銨明礬質量分數為5%的5 組混合物樣品的各3 次檢測結果均為摻假樣品，只有1 組混合物（A05+B10）的1 次檢測結果為假陰性、2 次檢測結果為摻假樣品，可能是該樣品不均勻所致。綜上，可以認為銨明礬質量分數不低于5%的摻假白礬樣品基本都能被準確識別。十二水合硫酸鋁銨相對分子質量為453.33，氮的相對原子質量是14.01，由此推算銨明礬中氮元素質量分數約為3%。白礬中含有5%銨明礬時，氮元素質量分數約為0.15%。《中國藥典》2020 年版白礬的銨鹽檢查項規定樣品中含銨鹽以總氮計不超過0.3%。也就是說，MIR光譜對于白礬中銨鹽的檢出限完全可以滿足藥典要求。

3.4 MIR光譜不同測試方法比較

溴化鉀（KBr）壓片法與ATR 法是目前固體樣品MIR 光譜測試最常用的方法。白礬、銨明礬的主要成分是含有結晶水的離子化合物，使用壓片法時樣品可能與作為稀釋劑的KBr 產生一定程度的離子相互作用，加之實驗室濕度、樣品粒度、樣品與稀釋劑混勻程度等因素，都可能影響樣品譜圖形狀。而且壓片法需要消耗KBr，使用研磨和壓片工具，也增加了檢測過程的時間和物質成本。使用ATR 法測試MIR 光譜時，樣品直接加載于內反射晶體表面即可，操作過程更加簡便、快速，可能影響樣品譜圖形狀的干擾因素也更少。因此，本研究選擇ATR法測試白礬與銨明礬樣品的MIR 光譜。本研究過程中也比較了ATR 法與KBr 壓片法測試的白礬與銨明礬樣品的MIR 光譜，2 種方法獲得的光譜特征基本一致，主要差異在于KBr 壓片法測得的吸收峰位置波數普遍高于ATR 法（圖9）。例如，ATR 法測量的MIR光譜中銨明礬的N-H 彎曲振動峰在1436 cm-1附近，而KBr 壓片法測量的該峰位置在1441 cm-1附近。因此，將N-H 彎曲振動峰的出現位置放寬到1450～1430 cm-1區域是更加合理、耐用的規則。

圖9 同一儀器不同方法測試的白礬與銨明礬的MIR光譜

4 結論

綜上所述，MIR 光譜中1450～1430 cm-1區域的銨離子N-H 彎曲振動峰可作為專屬特征峰，用于鑒別白礬與銨明礬，或者識別摻入銨明礬（不低于5%）的白礬。該方法適合于不同實驗室、不同品牌型號的MIR 光譜儀，可選擇ATR 法或KBr 壓片法測試樣品MIR 光譜。考慮到可能存在的其他偽品或摻假物質，可以將白礬樣品與十二水合硫酸鋁鉀的MIR 整體特征一致作為基本要求，同時將N-H 彎曲振動峰作為靶向檢查銨明礬或銨離子的指標。因此，建議將白礬的MIR 光譜鑒別標準設定為“取本品粉末適量，衰減全反射法或溴化鉀壓片法制備供試品，照紅外分光光度法（藥典通則0402）試驗，供試品紅外吸收圖譜應與十二水合硫酸鋁鉀[KAl(SO4)2·12H2O] 具有相同的特征吸收峰，且在1450～1430 cm-1區域內不得出現吸收峰”。

[利益沖突]本文不存在任何利益沖突。