基于UPLC指紋圖譜與抗氧化譜效關系的枸杞子質量標志物研究△

喬亞玲，宋霞，劉亞蓉，韓生蘭，李永鵬，林鵬程

1.青海民族大學 藥學院，青海 西寧 810007；2.青海省藥品檢驗檢測院，青海 西寧 810016；3.天津大學 理學院，天津 300072；4.國家藥品監督管理局 中藥（藏藥）質量控制重點實驗室，青海 西寧 810016；5.青海省中藏藥現代化研究重點實驗室，青海 西寧 810016；6.青海省青藏高原植物化學重點實驗室，青海 西寧 810007

枸杞Lycium chinenseMiller.為茄科（Solanaceae）枸杞屬（LyciumL.）植物，分布于我國東北、西北、西南、華南和華東各省區[1]。其干燥成熟果實為枸杞子，具有清心熱、鎮靜的功效，主治心熱病、頭痛、失眠、健忘等[2]，是名貴大宗中藥材和功能性食品，主要含有多糖[3]、黃酮[4]、生物堿[5]等類化學成分，具有保護神經[6]、抗癌[7]、降血糖[8]、抗衰老[9]等多種藥理作用。天然抗氧化劑在保健、抗炎、抗癌、保護心血管等方面發揮著重要作用[10]。目前，有關枸杞子的抗氧化作用研究主要集中于抗氧化劑含量和抗氧化能力的測定上[11-13]，對枸杞子抗氧化活性的主要貢獻物質缺乏統一的認識。

中藥指紋圖譜技術[14]具有專屬性強、重現性好、穩定性好等優點，被廣泛應用于中藥材的產地鑒別[15]、加工[16]、質量評價[17-18]、活性研究[19]等各個環節，能夠表達中藥的整體特性，是一種合理的中藥質量控制模式。中藥成分復雜，發揮藥效作用的具體成分不明確，中藥譜效關系可將指紋圖譜中化學成分的變化與藥效相關聯，篩選出有效活性成分群[20]。劉昌孝院士提出的中藥質量標志物（Q-marker）新概念[21]對中藥質量提升具有積極作用，其研究成果及學術影響對中醫藥的發展具有重大現實意義[22-24]，本研究擬借助Q-marker的研究思路，依據液相色譜的指紋特性，建立枸杞子的超高效液相色譜法（UPLC）指紋圖譜，同時結合聚類分析、主成分分析（PCA）、正交偏最小二乘法-判別分析（OPLS-DA）進行評價，為不同批次的枸杞子建立一致性評價方法，篩選出影響分類及質量的關鍵Q-marker。利用雙變量相關性分析法與正交偏最小二乘法-回歸分析研究指紋圖譜共有峰與抗氧化活性指標的譜效關系，為闡明枸杞子抗氧化活性的Q-marker 提供參考，也為提升枸杞子的質量控制水平提供科學依據。

1 材料

1.1 樣品

31 批研究樣品經青海民族大學藥學院林鵬程教授鑒定為茄科植物枸杞Lycium chinenseMiller.的干燥成熟果實，編號1～10 產地為青海都蘭，11、13、15 產地為寧夏中寧，12、14、16 產地為寧夏銀川，17～18 產地為吉林白山，19～25 產地為青海德令哈，26產地為甘肅瓜州，27～31產地為青海大柴旦。

1.2 試藥

總抗氧化能力（T-AOC）檢測試劑盒購自北京索萊寶生物試劑有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）檢測試劑盒、多功能氧化酶（MFO）檢測試劑盒購自蘇州科銘生物科技有限公司；乙腈為色譜純；其余試劑為分析純；水為超純水。

1.3 儀器

Acquity 型超高效液相色譜儀、二極管陣列（PDA）檢測器和Empower 工作站（美國Waters 公司）；Milli-Q Advantage A10 型超純水儀（美國密理博公司）；KQ600DB 型超聲波清洗器（東莞市科橋超聲波設備有限公司）；BSA224S-CW型萬分之一電子天平（賽多利斯科學儀器有限公司）；XS105DU型十萬分之一電子天平（上海梅特勒-托利多有限公司）；HM100型刀式研磨儀（北京格瑞德曼儀器設備有限公司）；YB-IA 型真空恒溫干燥箱（天津市新天光分析儀器技術有限公司）；Lambda35型紫外分光光度計（美國Perkin Elmer公司）。

2 方法與結果

2.1 枸杞子乙醇提取物的制備

取經過減壓恒重的藥材粉末（過80 目篩）（1.000±0.001）g，精密稱定，置于100 mL 錐形瓶中，精密加入無水乙醇25 mL，稱定質量，超聲提取（功率250 W，頻率50 kHz）30 min，靜置至室溫后，再稱定質量，用無水乙醇補足減失的質量，搖勻，經0.22 μm的微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.2 枸杞乙醇提取物UPLC指紋圖譜

2.2.1 色譜條件及溶液制備 采用Waters CORTECS UPLC T3色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.6 μm）；流動相為0.05%甲酸水溶液（A）-80%乙腈水溶液（B），梯度洗脫（0～3 min，2%～10%B；3～15 min，10%～13%B；15～17 min，13%～20%B；17～20 min，20%～40%B；20～22 min，40%～80%B；22～30 min，80%～100%B）；流速為0.4 mL·min-1；柱溫為40 ℃；進樣量為1 μL；檢測波長為211 nm。

2.2.2 精密度試驗 取枸杞子（編號1），按2.1 項下方法制備供試品溶液，按2.2.1 項下色譜條件連續進樣6 針，記錄色譜圖，以峰面積占比最大、保留時間適中的峰為參照峰，計算各主要共有峰的相對保留時間和相對峰面積。各主要色譜峰相對保留時間的RSD 為0.31%～0.86%，相對峰面積的RSD為1.6%～2.7%，表明儀器精密度良好。

2.2.3 重復性試驗 枸杞子（編號1）6 份，按2.1項下方法制備供試品溶液，按2.2.1 項下色譜條件進樣分析。記錄色譜圖，以峰面積占比最大、保留時間適中的峰為參照峰，計算各主要共有峰的相對保留時間和相對峰面積。各主要色譜峰相對保留時間的RSD 為0.57%～0.83%，相對峰面積的RSD 為1.6%～2.7%，表明實驗方法重復性良好。

2.2.4 穩定性試驗 取枸杞子（編號1），按2.1 項下方法制備供試品溶液，按2.2.1 項下的色譜條件，分別在0、2、4、6、8、12、24 h進樣分析，記錄色譜圖，以峰面積占比最大、保留時間適中的峰為參照峰，計算各主要共有峰的相對保留時間和相對峰面積。各主要色譜峰相對保留時間的RSD 為0.53%～1.6%，相對峰面積的RSD 為1.4%～2.8%，表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.2.5 指紋圖譜的建立 31 批研究樣品，分別按2.1 項下方法制備供試品溶液，按2.2.1 項下色譜條件進行檢測，記錄色譜圖。根據實驗結果，采用Chempattern 2017 化學計量學軟件進行數據分析處理，生成枸杞子共有模式的對照指紋圖譜（圖1），共有峰34個，指紋圖譜疊加圖見圖2。

圖1 31批枸杞子的UPLC對照指紋圖譜

圖2 31批枸杞子的UPLC指紋圖譜疊加圖

2.2.6 指紋圖譜相似度評價 采用Chempattern 化學計量學軟件對31 批樣品的指紋圖譜進行相似度計算，結果見表1。31 批樣品的相似度為0.96～0.48，青海都蘭縣樣品的相似度為0.91～0.83，青海德令哈樣品的相似度為0.96～0.85，青海大柴旦樣品的相似度為0.85～0.78，寧夏樣品的相似度為0.87～0.68，可見不同地區枸杞有相對較好的相似度，但內在質量存在差異。這表明指紋圖譜的相似度能夠反映各樣品間的差異。

表1 31批枸杞子的樣品信息、相似度及活性指標

2.3 化學計量學分析

2.3.1 聚類分析 將31 批枸杞子指紋圖譜中的34個共有峰的峰面積導入Chempattern 化學計量學軟件，經中心化預處理后進行聚類分析，采用加權平均距離法作為聚類模型識別方法，以歐氏距離對樣品進行聚類分析，結果見圖3。31 批枸杞子樣品可分為3類：第1類為1～16、19～25、27～31，第2類為17、18，第3 類為26 號。枸杞子產地為寧夏與青海的聚為一類，產地為吉林、甘肅的各聚為一類，聚為一類的樣品之間有較好的相似性，與相似度評價結果較為一致。

圖3 31批枸杞子樣品的聚類分析圖

2.3.2 PCA 本研究采用Chempattern 化學計量學軟件對31批樣品的34個共有峰峰面積數據進行中心化處理，進行PCA。PCA 結果見圖4，結果表明PCA 與聚類分析基本一致。在載荷散點圖（圖5）中，每1個點代表1個共有峰，其在坐標系中距離原點（0，0，0）距離的遠近表明該成分對樣品分類的貢獻大小。其中，15、17、19、23 號色譜峰的化合物在色譜系中離坐標原點的距離較遠，表明這4 個成分對樣品整體分類起關鍵作用，可作為影響枸杞子分類與質量的關鍵Q-marker。

圖4 31批枸杞子樣品PCA得分圖

圖5 31批枸杞子樣品PCA載荷圖

2.3.3 OPLS-DA 為了進一步尋找上述枸杞子之間的主要差異性標志物，采用OPLS-DA 對枸杞子樣品進行分析。將31批枸杞子的34個共有峰的峰面積經中心化后導入Chempattern 化學計量學軟件，獲得相應模型，結果見圖6、圖7。由OPLS-DA 得分圖可知，結果與PCA 分析一致，根據模型中變量投影重要性投影（VIP）預測值來篩選出具有統計學意義的差異標志物，在0.95的置信區間內，選出VIP值＞1的色譜峰為差異性標志物，2、7、17、19、33 號色譜峰的化合物的VIP 值分別為1.42、1.42、1.38、3.27、1.06，均大于1，可作為鑒別和區分枸杞子的Q-marker。

圖6 31批枸杞子樣品OPLS-DA得分圖

2.4 枸杞子乙醇提取物的抗氧化作用

2.4.1 DPPH 測定 按照DPPH 試劑盒說明書進行測定，設置空白管和測定管，空白管加入無水乙醇50 μL，測定管加入樣品50 μL，均加入試劑一950 μL，渦旋混勻，室溫避光反應20 min，于1 mL 玻璃比色皿測定515 nm 處的吸光度（A）。用從標準曲線上獲得的抗氧化劑Trolox 的量來表示樣品的DPPH 自由基清除能力（μmol·g-1）。按公式（1）以樣本質量折算其DPPH自由基清除能力（μmol·g-1）。

式中，ΔA表示空白管與測定管A的差值；V樣總表示加入提取液體積，此處為25 mL；W表示樣品質量。每個實驗平行3 次，結果用（）表示，31批枸杞子樣品DPPH 值不同，最小值為（2.21±0.01）μmol·g-1，最大值為（5.10±0.01）μmol·g-1，各樣品測定結果見表1。

2.4.2 T-AOC測定 按照T-AOC試劑盒說明，先配制梯度濃度為2.00、0.10、0.05、0.025、0.012 5、0.006 25、0.003 125 μmol·mL-1的FeSO4標準品溶液，以純水作為空白，測定樣品在593 nm 下的A。根據Fe2＋終濃度為橫坐標（X），以ΔA標準（ΔA標準＝A標準-A空白）為縱坐標（Y）繪制標準曲線，得到線性回歸方程Y＝1.942 5X+0.034 8（r=0.999 9），將ΔA測定（ΔA測定＝A測定-A空白）代入方程求得X（μmol·mL-1）。樣品的T-AOC（μmol·g-1）按公式（2）以樣本質量折算。

式中，V樣總為25 mL；V反總為1.02 mL；V樣為0.03 mL。每個實驗平行3 次，結果用（）表示，31 批枸杞子樣品T-AOC 不同，最小值為（90.51±0.28）μmol·g-1，最大值為（235.51±0.22）μmol·g-1，各樣品測定結果見表1。

2.4.3 MFO 測定 按照MFO 試劑盒說明書進行測定，設置空白管和測定管，空白管加入試劑一500 μL、試劑二100 μL、無水乙醇900 μL，測定管加入試劑一500 μL、試劑二100 μL、無水乙醇400 μL與樣品500 μL，渦旋混勻，37 ℃水浴反應30 min，空白管與測定管再分別加入試劑三500 μL與三氯甲烷2.5 mL，充分混勻萃取，靜置10 min，取下層溶液1.5 mL 至新的離心管中。再分別加入試劑四1.5 mL，充分混勻萃取，取上層溶液1 mL 置于1 mL 的玻璃比色皿中，測定A400nm與A空白。每克樣品每分鐘產生1 nmol對硝基苯酚定義為1 個酶活力單位。樣品的MFO（nmol·min-1·g-1）按公式（3）以樣本質量折算.

式中，ΔA表示測定管與空白管吸光度值的差值；V總表示最終萃取液體積，1.5 mL；V樣表示反應中樣品體積，500 μL；V樣總表示加入提取液體積，25 mL；T表示反應時間，30 min；W表示樣品質量。每個實驗平行3次，結果用（）表示，31批枸杞子樣品MFO不同，最小值為（0.67±0.17）nmol·min-1·g-1，最大值為（11.59±0.63）nmol·min-1·g-1，各樣品測定結果見表1。

2.5 乙醇提取物UPLC指紋圖譜藥效相關性分析

2.5.1 雙變量相關性分析 采用SPSS 26.0 軟件，以34 個共有峰的峰面積為自變量（X），以MFO、DPPH 與T-AOC 的測定值為因變量（Y）進行雙變量相關性分析，計算共有峰峰面積與MFO、DPPH 和T-AOC 測定值的Pearson 相關系數，結果峰1、5、7、8、11、13、15、20～25、27、29、31、32、33、34 的峰面積與MFO、DPPH 和T-AOC 的測定值顯著相關（P＜0.05）或極顯著相關（P＜0.01），其中峰1、5、7、27 呈負相關，峰8、11、13、15、20～25、29、31～33、34 呈正相關，峰8、11、15、20、23、34 的峰面積與MFO、DPPH 和T-AOC 的測定值極顯著相關，此類化合物為枸杞子抗氧化活性的主要Qmarker，見表2。

表2 31批枸杞子指紋圖譜共有峰峰面積與MFO、DPPH、T-AOC測定值的雙變量相關性分析結果

2.5.2 正交偏最小二乘法-回歸分析 以34 個共有峰的峰面積為自變量，以不同批次枸杞子樣品的DPPH、T-AOC 和MFO 的測定值為因變量，導入SIMCA 11.5 作模型擬合，計算回歸系數和VIP 值，評價枸杞子樣品與抗氧化活性的譜效關系。結果顯示，31 批枸杞子乙醇提取物UPLC 指紋圖譜中的峰3、11、12、15、23～25、28、29、31、33、34 的峰面積與MFO 測定值呈正相關（圖8A），峰3、4、6、7、10、11、15、16、18、23～25、31、32、34 的峰面積與DPPH 測定值呈正相關（圖8B），峰3、10、11、15、23～25、29、31～34 的峰面積與T-AOC 測定值呈正相關（圖8C），提示相應成分是枸杞子乙醇提取物抗氧化作用的物質基礎，是發揮抗氧化能力的Q-marker。由VIP 分析結果可知，與MFO 測定值正相關的色譜峰中，峰31、34、29、33、15、25、11、16、23、7 的VIP 值均＞1，其中，31 號峰的VIP最大（圖8D）。與DPPH 測定值正相關的色譜峰中，峰15、11、23、16、32、34、18、24 的VIP 均＞1，其中，15 號峰的VIP 值最大（圖8E）。與T-AOC 測定值正相關的色譜峰中，峰15、34、23、11、31、25、33的VIP值均大于1，其中，15號峰的VIP值最大（圖8F）。因此，發揮抗氧化能力的主要Qmarker是11、15、23、29、31、34號峰的化合物。

圖8 31批枸杞子樣品的正交偏最小二乘法-回歸分析回歸系數與VIP值（,n=3）

3 討論

關于枸杞子水提取物富含糖類成分，已有深入研究與廣泛應用，其乙醇提取物可提高枸杞子的綜合利用價值，且提取溶液利于儲存，色譜圖信息豐富，便于挖掘影響質量和活性的Q-marker，故選擇乙醇提取物為研究對象。本研究建立了枸杞子的UPLC 指紋圖譜，共標定了34 個共有峰，31 批樣品的相似度為0.96～0.48，產地為吉林的樣品與其他樣品區別明顯，青海、甘肅、寧夏的樣品較為一致，表明指紋圖譜的相似度能夠反映枸杞子內在質量的差異，為評價枸杞子質量的一致性與差異性提供了參考。采用聚類分析、PCA、OPLS-DA 的化學計量學方法對枸杞子整體質量進行控制。聚類分析將研究樣品聚為三大類，可用來區分不同產地的枸杞子。PCA 得到共有峰15、17、19、23 的化合物是影響枸杞子分類的主要Q-marker。OPLS-DA 顯示共有峰2、7、17、19、33 的化合物可作為鑒別和區分枸杞子的主要Q-marker。

本研究采用雙變量相關性分析和正交偏最小二乘法-回歸分析將枸杞子乙醇提取物的指紋圖譜共有峰峰面積與DPPH、T-AOC、MFO 的測定值相關聯，雙變量相關性分析表明峰8、11、15、20、23、34的化合物與MFO、DPPH、T-AOC 的測定值極顯著相關，OPLS-DA 表明峰11、15、23、25、31、33、34 的化合物是影響活性的主要Q-marker。研究結果可為枸杞子Q-marker 的篩選及質量控制提供參考，同時為枸杞子的資源開發利用提供實驗支撐與理論依據。后續將對各共有峰的化學成分進行分離、鑒定，尤其是影響質量和具有抗氧化活性的主要Qmarker 進行結構鑒定，并對篩選出的Q-marker 進行進一步的等效性驗證。

[利益沖突]本文不存在任何利益沖突。