電子束輻照對西藏蕁麻主要活性成分及滅菌效果的影響△

張赫林，謝和兵，4*，王弼聰，尼瑪次仁，白瑪旦增

1.安徽中醫藥大學 藥學院，安徽 合肥 230012；2.長三角藥物高等研究院，江蘇 南通 226133；3.江蘇神猴醫藥研究有限公司，江蘇 南通 226000；4.西藏神猴藥業有限責任公司，西藏 日喀則 857000；5.北京神州數碼有限公司 北京 100080

西藏蕁麻Urtica tibeticaW.T.Wang 的藏族藥（以下簡稱藏藥）名為薩真、薩珠，多分布于西藏、青海海拔3400～4800 m 的山坡草地。西藏蕁麻的藥用價值在藏族醫（以下簡稱藏醫）古籍《晶珠本草》《藏藥志》中均有記載[1-2]，并被收載于《中華人民共和國衛生部藥品標準·藏藥：第一冊》1995 年版[3]，具有祛風定驚、溫胃消食的作用，用于“龍”病引起的久熱、消化不良。現代研究表明，西藏蕁麻具有降尿酸、抑制前列腺炎、抗前列腺增生、降血糖等藥理作用[4-6]。西藏蕁麻還具有食用價值，含有豐富的蛋白質和維生素，其莖葉是天然綠色植物蛋白質來源，西藏當地百姓自古以來就有采集嫩莖葉作蔬菜食用的傳統習俗，在藏族群眾中被譽為“西藏人參”。因此，西藏蕁麻作為一種高原特有的藥食兩用藏藥，具有重要的應用價值。

西藏蕁麻藥材一般采用曬干、晾干的炮制工藝，其微生物水平無法得到有效控制，導致藥材在儲存過程中易發生霉變。輻照滅菌技術作為一種綠色、高效的冷殺菌技術[7]，與傳統滅菌方法相比，具有低溫，高效，能最大限度保持藥材性狀、活性成分及藥理活性等優點。鈷-60輻照及高能電子加速器輻照是目前主要采用的輻照滅菌方式，與鈷-60 輻照相比，電子束輻照技術具有投入成本更低、加工效率高、不產生核廢物、無環境污染等優點[8-10]。因此，本研究以藥材的性狀、主要指標成分含量、指紋圖譜相似度及微生物水平為綜合評價指標，考察不同劑量的電子束輻照對藥材的主要活性成分和滅菌效果的影響，旨在探究電子束輻照應用于西藏蕁麻藥材滅菌的適用性，為西藏蕁麻藥材及其制劑的輻照滅菌提供參考，也為含熱不穩定性成分的藏藥的輻照滅菌提供參考。

1 材料

1.1 樣品

西藏蕁麻藥材來源于西藏神猴藥業有限責任公司，經江蘇神猴醫藥研究有限公司副主任藏藥師尼瑪次仁鑒定為蕁麻科植物西藏蕁麻Urtica tibeticaW.T.Wang。

1.2 試藥

對照品蘆丁（批號：100080-202012，純度：92.2%）、綠原酸（批號：110753-202119，純度：96.3%）、紫云英苷（批號：100081-201610，純度：99.02%）、異牡荊苷（批號：112098-202201，純度：97.4%）購自中國食品藥品檢定研究院；無水氯化鋁（批號：20211020）、亞硝酸鈉（批號：20210519）、氫氧化鈉（批號：20210220）、無水乙醇（批號：20220321，分析純）、磷酸（批號：20210906，分析純）、三乙胺（批號：C13683716，分析純）、甲醇（批號：20220608，色譜純）、乙腈（批號：20220128，色譜純）均購自國藥集團化學試劑有限公司；超純水（自制）。

1.3 儀器

UV-1900 型紫外-可見分光光度計、EssentiaLC-16 型高效液相色譜儀均購于島津儀器有限公司；XSR205DU/AC 型十萬分之一分析天平（美國梅特勒托利多科技有限公司）；JA10003N 型千分之一電子天平、UC-250DE 型超聲清洗儀均購于上海精其儀器有限公司；HH-6型數顯恒溫水浴鍋（上海力辰邦儀器科技有限公司）；20B 型高效萬能粉碎機（常州市強迪干燥設備有限公司）；DX-10/20 型電子加速器[中廣核戈瑞（深圳）科技有限公司]；CR9 型分光色差儀（配粉末測試盒，深圳市三恩時科技有限公司）；Synergy UV 型純水儀（默克密理博公司）。

2 方法與結果

2.1 輻照樣品制備

取西藏蕁麻藥材適量，粉碎過六號篩，分裝于PET 樣品瓶中，每瓶12 g，共30 瓶，分成6 組，分別采用0、2、4、6、8、10 kGy 的劑量進行電子束輻照處理。

2.2 性狀比較

招募無鼻炎、無感冒鼻塞癥狀的志愿者30 名，通過雙盲鼻嗅打分的方式判斷輻照前后氣味的變化[11]，設定新打粉制備的蕁麻藥材粉末為5分，每位志愿者對每組不同劑量輻照樣本進行1～9 分打分，主要依據氣味的濃淡和雜味打分，氣味無變化打分5分，氣味變淡打分1～4分，氣味變濃及有雜味打分5～9 分。運用SPSS 26.0 分析軟件進行數據計算處理，兩組間比較采用成對樣本t檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。然后采用分光色差儀，對儀器黑白板校正后進行測定，并記錄樣品粉末的亮度（L*）、紅綠度（a*）、黃藍度（b*）值為指標。根據公式（1）計算總色差（ΔE），比較輻照前后樣品的色澤的變化，ΔE＜0.5視為微小色差，無統計學意義。

式中，ΔL*、Δa*、Δb*分別為西藏蕁麻粉末輻照前后的差值。

結果表明，雙盲多人次鼻嗅2、4、6、8、10 kGy劑量輻照后西藏蕁麻粉末與未輻照樣品分值差異無統計學意義。輻照后樣品粉末的ΔE分別為0.43±0.06、0.40±0.09、0.42±0.13、0.40±0.07、0.45±0.15，色澤未有顯著變化，見圖1。

圖1 不同輻照劑量西藏蕁麻粉末樣品色澤

2.3 總黃酮的含量測定

2.3.1 溶液制備 對照品溶液的制備：精密稱取蘆丁對照品10.00 mg，加入30%乙醇定容至100 mL量瓶中，得到質量濃度為92.20 μg·mL-1的對照品儲備液。精密吸取對照品儲備液2 mL 至10 mL 棕色量瓶中，進行顯色操作（加入5%亞硝酸鈉溶液0.4 mL，搖勻，靜置6 min，加入10%三氯化鋁溶液0.4 mL，搖勻，靜置6 min，再加入4%氫氧化鈉溶液4 mL 并用30%乙醇定容至刻度，搖勻，靜置15 min），即得對照品溶液。

供試品溶液的制備：稱取西藏蕁麻細粉約2 g，置于錐形瓶中，加入30%乙醇30 mL，超聲（功率250 W，頻率40 kHz）處理60 min，放冷，再稱定質量，用30%乙醇補足減失的質量，放冷抽濾，濾液轉移至50 mL 量瓶中，用30%乙醇定容至刻度，搖勻，即得供試品儲備液。精密吸取供試品儲備液3 mL 至10 mL 棕色量瓶中，顯色操作同對照品溶液，即得供試品溶液。

空白溶液的制備：精密吸取30%的乙醇溶液3 mL 至10 mL 棕色量瓶中，顯色操作同對照品溶液，即得空白溶液。

2.3.2 檢測波長的選擇 取2.3.1 項下對照品溶液、供試品溶液和陰性樣品溶液，用紫外-可見分光光度計在400～800 nm進行全波長測定。結果顯示對照品溶液和供試品溶液在510 nm處有最大的吸收，陰性樣品溶液無吸收，因此，選擇檢測波長為510 nm。

2.3.3 線性關系考察 精密吸取2.3.1 項下的對照品儲備液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL至10 mL棕色量瓶中，按2.3.1 項下的方法制備不同濃度的對照品溶液，在波長510 nm 處測定吸光度，以蘆丁的質量濃度為橫坐標（X）、吸光度為縱坐標（Y），繪制標準曲線并進行回歸分析，線性回歸方程為Y=0.013 1X+0.004（r=0.999 9），表明蘆丁質量濃度為4.61～46.10 μg·mL-1時線性關系良好。

2.3.4 精密度試驗 取2.3.1 項下的對照品溶液，在波長510 nm 處測定吸光度，連續測定6 次，測得吸光度的RSD為0.03%，表明儀器精密度良好。

2.3.5 穩定性試驗 按2.3.1 項下方法各制備1 份對照品溶液和供試品溶液分別于0、20、40、80、100、120 min 時在波長510 nm 處測定吸光度，測得對照品溶液、供試品溶液吸光度RSD分別為0.33%、0.53%，表明對照品和供試品溶液120 min內穩定。

2.3.6 重復性試驗 按2.3.1 項下方法制備6 份供試品溶液，在波長510 nm 處測定吸光度，測得6 份供試品溶液吸光度RSD 為0.77%，表明方法重復性良好。

2.3.7 加樣回收率試驗 精密吸取已知含量的供試品儲備液1.5 mL 和2.3.1 項下的對照品儲備溶液2 mL 于同一10 mL 棕色量瓶中，平行制備6 份，顯色操作同2.3.1 項下的對照品溶液，在波長510 nm處測定吸光度，每份連續測定2 次，平均吸光度代入2.3.3 項下的線性方程，計算含量、平均加樣回收率和RSD，結果見表1。

表1 西藏蕁麻樣品的總黃酮加樣回收試驗結果

2.3.8 輻照樣品含量測定 取不同劑量輻照后的西藏蕁麻細粉約2 g，每個樣品平行稱取3 份，按2.3.1 項下方法制備供試品溶液，測定吸光度，代入2.3.3 項下的線性方程，計算總黃酮的含量。運用SPSS 26.0 分析軟件進行數據計算處理。兩組間比較采用成對樣本t檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。結果顯示，不同劑量輻照后西藏蕁麻粉末中總黃酮含量與輻照前差異無統計學意義（表2）。

表2 不同輻照劑量西藏蕁麻樣品總黃酮質量分數（,n=3）

表2 不同輻照劑量西藏蕁麻樣品總黃酮質量分數（,n=3）

2.4 綠原酸、異牡荊苷、紫云英苷的含量測定

2.4.1 溶液制備 對照品溶液的制備：分別精密稱取綠原酸20.18 mg 置10 mL 量瓶中，異牡荊苷9.30 mg、紫云英苷9.81 mg 置50 mL 量瓶中，分別加入30%乙醇充分溶解定容，得各對照品儲備液。分別精密吸取綠原酸對照品儲備液8 mL、異牡荊苷對照品儲備液10 mL、紫云英苷對照品儲備液10 mL，置同一50 mL 量瓶中，加30%乙醇定容至刻度，得混合對照品儲備液。

供試品溶液的制備：稱取西藏蕁麻樣品細粉約2 g，置于錐形瓶中，加入30%乙醇30 mL，稱定質量，超聲（功率250 W，頻率40 kHz）處理60 min，放冷，再稱定質量，用30%乙醇溶液補足減失的質量，搖勻，抽濾，濾液置蒸發皿中60 ℃水浴蒸干，加入30%乙醇5 mL 溶解轉移至10 mL 量瓶中，用30%乙醇定容，搖勻，0.45 μm 微孔濾膜過濾，即得供試品溶液[12]。

陰性樣品溶液的制備：不加西藏蕁麻細粉，其余操作同供試品溶液的制備方法制得陰性樣品溶液。

2.4.2 色譜條件 采用ULtimate XB-C18液相色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為0.2%磷酸-0.2%三乙胺水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～5 min，12%～13%B；5～22 min，13%～15%B；22～40 min，15%～35%B；40～50 min，35%～55%B）；檢測波長：360 nm；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL·min-1；進樣量：20 μL。

2.4.3 系統適用性試驗 分別吸取2.4.1項下混合對照品儲備液、供試品溶液、陰性樣品溶液各20 μL，按2.4.2 項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，結果見圖2。供試品和對照品溶液的保留時間一致，且綠原酸、異牡荊苷、紫云英苷的色譜的分離度＞1.5，拖尾因子為0.95～1.05，理論板數＞3000，陰性樣品溶液在目標峰處無干擾，表明該方法的專屬性良好。

圖2 供試品、混合對照品、陰性樣品的HPLC圖

2.4.4 線性關系考察 取2.4.1 項下混合對照品儲備 液0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL，分別置于10 mL 量瓶中，30%乙醇定容，配制成綠原酸、異牡荊苷和紫云英苷質量濃度分別為15.55～311.00、1.85～37.00、1.94～38.80 μg·mL-1的混合對照品溶液，按2.4.2 項下色譜條件進樣測定，以3個指標成分的質量濃度（X）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標，繪制標準曲線并進行回歸分析，得到綠原酸的回歸方程為Y=16 540X+2 158.4（r=0.999 9），異牡荊苷的回歸方程為Y=65 044X-5 412.1（r=0.999 9），紫云英苷的回歸方程為Y=65 150X+4 113.2（r=0.999 9），表明線性良好。

2.4.5 精密度試驗 取2.4.1 項下供試品溶液，按2.4.2 項下色譜條件連續進樣6 次，綠原酸、異牡荊苷和紫云英苷峰面積的RSD 分別為0.20%、0.69%、0.71%，表明儀器精密度良好。

2.4.6 穩定性試驗 重新按照2.4.1 項下方法制備供試品溶液，室溫下分別于0、2、4、8、12、16、20、24 h 按2.4.2 項下色譜條件進樣測定，綠原酸、異牡荊苷和紫云英苷峰面積的RSD 分別為1.33%、1.50%、1.40%，表明供試品溶液24 h內穩定。

2.4.7 重復性試驗 重新按2.4.1 項下方法平行制備供試品溶液6 份，按2.4.2 項下色譜條件進樣測定，綠原酸、異牡荊苷和紫云英苷含量的RSD 分別為1.64%、3.09%、2.23%，表明方法重復性良好。

2.4.8 加樣回收率試驗 稱取已知含量的西藏蕁麻粉末約2 g，平行稱取6 份，分別加入綠原酸對照品儲備液0.3 mL、異牡荊苷對照品儲備液0.1 mL、紫云英苷對照品儲備液0.1 mL，按2.4.1 項下方法制備供試品溶液，2.4.2 項下色譜條件測定，每份連續測定2 次，計算綠原酸、異牡荊苷和紫云英苷的平均加樣回收率和RSD，結果見表3。

表3 綠原酸、異牡荊苷和紫云英苷加樣回收率實驗結果

2.4.9 輻照樣品含量測定 分別稱取不同輻照劑量的西藏蕁麻粉末約2 g，每個樣品平行稱取3 份，按2.4.1 項下方法處理樣品，按2.4.2 項下色譜條件測定，計算綠原酸、異牡荊苷、紫云英苷的含量。

采用SPSS 26.0 分析軟件進行數據計算處理。以輻照前的樣品（輻照劑量為0 kGy）為對照，兩組間比較采用成對樣本t檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。結果顯示，2～10 kGy 不同劑量輻照后西藏蕁麻粉末中綠原酸、異牡荊苷、紫云英苷含量與輻照前差異無統計學意義，結果見表4。

表4 不同輻照劑量西藏蕁麻樣品中指標成分質量分數測定實驗結果（,n=3）

表4 不同輻照劑量西藏蕁麻樣品中指標成分質量分數測定實驗結果（,n=3）

2.5 指紋圖譜相似度評價

采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”（2012版）處理色譜圖，以0 kGy樣品色譜圖為參照，經過多點校正、全譜峰匹配，生成對照圖譜，并計算相似度[13-14]。結果所有樣品間相似度均不低于0.997，共有峰保留時間的RSD均小于2.0%（圖3、表5）。

表5 不同輻照劑量西藏蕁麻樣品HPLC相似度評價

圖3 不同輻照劑量西藏蕁麻樣品HPLC疊加圖譜

2.6 微生物檢查

按《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）2020年版（四部）通則[通則1105（微生物計數法）、通則1106（控制菌檢查法）及通則1107（非無菌藥品微生物限度標準）][15]檢查電子加速輻照前后西藏蕁麻粉末細菌菌落總數、霉菌酵母菌菌落總數、大腸埃希菌的變化，每個樣品平行檢測3次[16]。運用SPSS 26.0 分析軟件進行數據計算處理。兩組間比較采用成對樣本t檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。結果顯示，輻照后西藏蕁麻粉末樣品細菌菌落總數、霉菌酵母菌落總數均較輻照前顯著下降（P＜0.01）。當輻照劑量達到6 kGy時，微生物水平符合《中國藥典》2020 年版規定，當輻照劑量為8 kGy 時，霉菌及酵母菌均已無法檢出，當輻照劑量為10 kGy 時，霉菌、酵母菌及細菌菌落總數均未檢出（表6）。

表6 西藏蕁麻粉末微生物限度檢查結果（,n=3）

表6 西藏蕁麻粉末微生物限度檢查結果（,n=3）

注：與0 kGy輻照劑量比較，**P＜0.01；ND表示未檢出。

3 討論

3.1 指標成分的選擇

國內外對蕁麻屬植物化學成分進行了大量的研究，結果表明該植物含有黃酮類、有機酸、甾類、香豆素、木脂素[17-21]等成分，其中黃酮類、有機酸類成分為蕁麻的主要藥效成分，具有抗炎、抗菌、抗氧化、抗前列腺增生、免疫調節、促進腸道平滑肌收縮[22-27]等藥理活性。已有文獻報道了蕁麻屬麻葉蕁麻中含有異牡荊苷、異槲皮苷、紫云英苷、槲皮苷、阿福豆苷等黃酮苷[28]，其中異牡荊苷、紫云英苷均是天然植物黃酮碳苷類化合物，目前較多的研究表明其具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等多種藥理作用[29-30]，這2 個成分在抗消化系統炎癥疾病、抗腫瘤方面具有顯著的療效[31-33]，與西藏蕁麻在藏醫古籍中記載的用途及藏醫臨床用藥實踐經驗相吻合。因此，本研究選用總黃酮，黃酮單體異牡荊苷、紫云英苷和綠原酸作為代表性指標成分。

3.2 滅菌方式的選擇

本研究嘗試了通過濕熱、干熱的滅菌方式控制藥材的微生物水平，結果發現熱滅菌處理后西藏蕁麻的色澤、氣味、總黃酮含量發生明顯的變化，這與西藏蕁麻中富含的有機酸、黃酮類化合物的熱不穩定性有關。黃酮類化合物在植物體中通常與糖結合成苷類，小部分以游離態（苷元）的形式存在。在加熱條件下，一方面，黃酮苷會脫去苷類配基變成黃酮或黃酮醇[34]；另一方面，西藏蕁麻黃酮類化合物的分子結構中存在酮式羰基、酚羥基，具有強還原性，而西藏蕁麻中富含的有機酸具有強氧化性，在加熱條件下，發生氧化還原反應，導致黃酮A 環與B 環脫離，降低黃酮含量[35-36]。此外，西藏蕁麻中的綠原酸等有機酸，具有抗炎、抗氧化等作用，但熱穩定性較差，因此，西藏蕁麻藥材不適用于熱滅菌處理。相較于傳統的熱滅菌技術，輻照滅菌最大的優勢在于其是一種冷滅菌技術，在食品、農產品中使用廣泛，近年來逐步推廣到中藥滅菌[37-41]，尤其適用于含揮發性、熱不穩定性成分的滅菌。因此，本研究選擇了電子束輻照滅菌。

3.3 指標成分含量測定及指紋圖譜的研究

本研究不但通過高效液相色譜法（HPLC）同時測定綠原酸、異牡荊苷、紫云英苷的含量，還對綠原酸、異牡荊苷、紫云英苷的色譜峰的前后峰進行了定性鑒別，結果發現，綠原酸色譜峰的前后分布了新綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸等色譜峰，異牡荊苷、紫云英苷色譜峰周邊可能分布了山柰酚-7-O-鼠李糖苷、異槲皮苷、槲皮苷、阿福豆苷等色譜峰，為建立西藏蕁麻藥材的指紋圖譜提供參考，但相關色譜峰確證、定量測定等研究工作需進一步開展。

4 結論

2～10 kGy 吸收劑量的電子束輻照對西藏蕁麻藥材性狀，總黃酮、綠原酸、異牡荊苷、紫云英苷含量，以及指紋圖譜均無顯著影響，且當輻照劑量達到6 kGy 時，微生物水平符合《中國藥典》2020 年版規定，為西藏蕁麻藥材及其制劑的輻照滅菌提供了參考。本研究建立了紫外法測定西藏蕁麻中總黃酮含量，以及HPLC 同時測定綠原酸、異牡荊苷、紫云英苷的含量測定方法，為西藏蕁麻藥材的質量標準提升提供了參考。

[利益沖突]本文不存在任何利益沖突。