荷葉產(chǎn)地加工與飲片炮制一體化工藝研究△

吳梅青，羅栩強(qiáng)，陳丹，王姣

1.湘潭醫(yī)衛(wèi)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南 湘潭 411102；2.中山市仙逸堂中藥飲片有限公司，廣東 中山 528436

荷葉為睡蓮科植物蓮Nelumbo nuciferaGaertn.的干燥葉，具有清暑化濕、升發(fā)清陽、涼血止血之功效，用于暑熱煩渴、暑濕泄瀉、脾虛泄瀉、血熱吐衄、便血崩漏[1]?，F(xiàn)代藥理研究表明，荷葉具有調(diào)血脂、抗氧化及衰老、抗炎抑菌、鎮(zhèn)靜安神、抗疲勞等藥理活性[2]。以其為原料的制劑主要有荷葉丸、荷丹片等，荷葉還可以制作荷葉茶和荷葉食品，被中華人民共和國國家衛(wèi)生健康委員會(huì)列入藥食同源目錄中。荷葉中主要含有生物堿類和黃酮類等活性成分，其中荷葉堿被廣泛關(guān)注，其具有調(diào)血脂、降血糖、抗腫瘤、抗腦缺血等多種藥理作用[3]?！吨腥A人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）2020年版（一部）中以荷葉堿為荷葉含量測(cè)定項(xiàng)的質(zhì)量控制指標(biāo)。黃酮類成分具有調(diào)血脂、抑菌、抗氧化等多種藥理活性[4-5]，主要包括金絲桃苷、異槲皮苷等，其為目前研究較多的成分[6-7]。有研究建議將金絲桃苷和異槲皮苷含量測(cè)定納入荷葉質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，以期更全面地反映和評(píng)價(jià)荷葉的質(zhì)量，保證其臨床用藥的合理、有效[8]。

目前，荷葉藥材的產(chǎn)地加工過程和飲片炮制過程是相對(duì)獨(dú)立的，產(chǎn)地加工過程為鮮荷葉采收-凈制-干燥；飲片公司購買后的炮制過程為再潤濕-切絲-干燥，從藥材到飲片需經(jīng)過干燥和潤濕過程，費(fèi)工費(fèi)時(shí)，還可能影響荷葉及其炮制品有效成分，從而影響藥效。本研究以湘潭產(chǎn)荷葉為研究對(duì)象，采用不同工藝制備荷葉飲片，測(cè)定各飲片的醇溶性浸出物的含量，活性成分荷葉堿、金絲桃苷和異槲皮苷的含量，分析并比較荷葉產(chǎn)地加工與飲片炮制一體化（以下簡稱一體化）工藝飲片和傳統(tǒng)飲片的質(zhì)量差異，并進(jìn)行驗(yàn)證，優(yōu)選最佳的一體化工藝，以期為荷葉生產(chǎn)加工及飲片炮制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

LC16 型高效液相色譜儀、ATY224 型電子天平（島津公司）；MSA36P-OCE-DB 型百萬分之一電子天平（賽多利斯公司）；KQ3200E 型數(shù)控超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）；TG1650-WS 型臺(tái)式高速離心機(jī)（湖南賽特湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；300Y 型多功能粉碎機(jī)（永康市鉑歐五金制品有限公司）；GZX-9070MBE 型電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）。

1.2 試藥

對(duì)照品荷葉堿（批號(hào)：111566-201605）、金絲桃苷（批號(hào)：111521-201809）、異槲皮苷（批號(hào)：111809-201403）均購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈、甲醇、磷酸均為色譜純；自制蒸餾水；其他試劑均為分析純。

荷葉鮮藥材購于湖南潭蓮食品有限公司，購買后立即放在有冰袋的泡沫箱中，送至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。荷葉鮮藥材經(jīng)中山市仙逸堂中藥飲片有限公司羅栩強(qiáng)主管藥師鑒定為睡蓮科植物蓮Nelumbo nuciferaGaertn.的鮮荷葉。

2 方法與結(jié)果

2.1 荷葉的炮制

2.1.1 傳統(tǒng)荷葉飲片制備 稱取鮮荷葉4 片（約100 g）曬至七成干，此時(shí)整片荷葉不脆，干燥度均勻且能對(duì)折成半圓形，上表面綠色、下表面灰綠色。將七成干的荷葉除去葉柄，折成半圓形或折扇形，干燥，得荷葉藥材；噴水，稍潤，切絲，干燥[1]，得傳統(tǒng)荷葉飲片1#樣品。

2.1.2 荷葉一體化炮制飲片制備 通過預(yù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，將新鮮荷葉在50 ℃下干燥至七成干（含水量約為30%）時(shí)，荷葉堿、金絲桃苷和異槲皮苷成分含量最高，且高于傳統(tǒng)工藝飲片。參考相關(guān)文獻(xiàn)[9-10]，進(jìn)行荷葉一體化炮制：稱取鮮荷葉4 片（約100 g，共9 個(gè)樣品，編號(hào)為2#～10#，每個(gè)樣品平行制備3份），分別置烘箱，單葉平鋪，在設(shè)定不同溫度下烘至七成干，取出切絲（寬度約1.0 cm)，50 ℃干燥，得一體化炮制飲片樣品，見表1。

表1 荷葉樣品信息

2.2 水分測(cè)定

依據(jù)《中國藥典》 2020 年版（四部）通則“0832水分測(cè)定法第二法烘干法”測(cè)定[11]。

2.3 醇溶性浸出物的含量測(cè)定

以70%的乙醇為溶劑，按《中國藥典》2020 年版（四部）通則“2201 浸出物測(cè)定法”項(xiàng)下熱浸法操作，測(cè)定樣品中醇溶性浸出物的含量[11]。

2.4 荷葉堿含量測(cè)定

2.4.1 色譜條件 島津LC16 型高效液相色譜儀；Amethyst C18-H 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；以乙腈-水-三乙胺-冰乙酸（27∶70.6∶1.6∶0.78）為流動(dòng)相；檢測(cè)波長為270 nm；流速為1.0 mL·min-1；柱溫為35 ℃；進(jìn)樣體積為20 μL。色譜圖見圖1。

圖1 荷葉堿對(duì)照品溶液與樣品溶液高效液相色譜圖

2.4.2 對(duì)照品溶液的配制 精密稱取荷葉堿對(duì)照品適量置于50 mL 量瓶中，加甲醇定容至刻度線，搖勻，即得對(duì)照品儲(chǔ)備液（荷葉堿質(zhì)量濃度為0.403 3 mg·mL-1）。精密吸取對(duì)照品儲(chǔ)備液1 mL置25 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度線，搖勻，即得對(duì)照品溶液（荷葉堿的質(zhì)量濃度為0.016 12 mg·mL-1）。

2.4.3 供試品溶液的制備 按《中國藥典》2020年版[1]規(guī)定制備供試品溶液。取荷葉粗粉約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流2.5 h，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液5 mL，置10 mL 量瓶中，加水至刻度，搖勻，即得。

2.4.4 線性關(guān)系考察 精密吸取荷葉堿對(duì)照品儲(chǔ)備液0.25、0.50、1.00、2.00、3.00、4.00 mL，分別置于10 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，按2.4.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定峰面積，以各待測(cè)成分質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）、峰面積為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：Y=64 361X＋3 646.6（r=0.999 9）。結(jié)果表明，荷葉堿在質(zhì)量濃度為10.075～161.200 μg·mL-1時(shí)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.4.5 含量測(cè)定 取荷葉飲片，按2.4.3 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按2.4.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算樣品中荷葉堿的含量。每個(gè)樣品平行測(cè)定3次，取平均值。

2.5 金絲桃苷和異槲皮素的含量測(cè)定

2.5.1 色譜條件 島津LC16 型高效液相色譜儀；Zorbax SB-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；以乙腈-0.1%甲酸溶液（15∶85）為流動(dòng)相；流速為1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長為354 nm；柱溫為35 ℃；進(jìn)樣量為10 μL。

2.5.2 混合對(duì)照品溶液的配制 分別精密稱取金絲桃苷和異槲皮苷對(duì)照品適量，置于25 mL 量瓶中，加50%甲醇定容至刻度線，搖勻，即得質(zhì)量濃度分別為0.106 8、0.108 2 mg·mL-1的單一對(duì)照品儲(chǔ)備液。分別精密稱取金絲桃苷和異槲皮苷對(duì)照品儲(chǔ)備液各1 mL，置于25 mL 量瓶中，加50%甲醇定容至刻度線，搖勻，即得質(zhì)量濃度分別為21.36、21.64 mg·mL-1的混合對(duì)照品溶液。

2.5.3 供試品溶液的制備 參考《中國藥典》2020年版（一部）月季花中金絲桃苷和異槲皮苷含量測(cè)定方法和文獻(xiàn)[8]并結(jié)合預(yù)試驗(yàn)，制備供試品溶液。取荷葉炮制品粉末（過四號(hào)篩）約0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，加熱回流1 h，放冷，再稱定質(zhì)量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.5.4 專屬性考察 取混合對(duì)照品溶液、供試品溶液各10 μL 注入高效液相色譜儀，按2.5.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果表明，各成分分離度均大于1.5，理論板數(shù)按金絲桃苷計(jì)不低于20 000。色譜圖見圖2。

圖2 金絲桃苷、異槲皮苷混合對(duì)照品與樣品溶液高效液相色譜圖

2.5.5 線性關(guān)系考察 精密吸取金絲桃苷和異槲皮苷對(duì)照品儲(chǔ)備液（質(zhì)量濃度分別0.106 8、0.108 2 mg·mL-1）0.25、0.50、1.00、2.00、3.00、4.00 mL，分別置10 mL 量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，分別得系列對(duì)照品溶液，按2.5.1 項(xiàng)下色譜條件測(cè)定峰面積，以各待測(cè)成分質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）、峰面積為縱坐標(biāo)（Y）分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得金絲桃苷回歸方程：Y=38 355X+10 499（r=0.999 3）、異槲皮苷回歸方程Y=37 038X+13 009（r=0.999 9）。結(jié)果表明，金絲桃苷質(zhì)量濃度為2.67～42.72 μg·mL-1、異槲皮苷質(zhì)量濃度為2.71～43.28 μg·mL-1時(shí)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.5.6 精密度考察 精密吸取混合對(duì)照品溶液10 μL，按2.5.1 項(xiàng)下色譜條件下進(jìn)樣，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積，計(jì)算其RSD。金絲桃苷和異槲皮苷峰面積的RSD 分別為1.34%和1.28%，均小于2.0%，表明儀器精密度良好。

2.5.7 穩(wěn)定性考察 取同一供試品溶液，分別在 0、2、4、8、12、16、24 h 按2.5.1 項(xiàng)下色譜條件下分別進(jìn)樣，測(cè)定金絲桃苷和異槲皮苷的峰面積，計(jì)算得金絲桃苷和異槲皮苷峰面積的RSD 分別為1.54%、1.67%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.8 重復(fù)性考察 取同一個(gè)樣品，按2.5.3 項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液，按2.5.1項(xiàng)下色譜條件下分別進(jìn)樣，測(cè)定金絲桃苷和異槲皮苷的峰面積，并計(jì)算含量。結(jié)果樣品中金絲桃苷的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.40%，含量的RSD 為0.92%；異槲皮苷的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.58%，含量的RSD 為0.86%。表明此方法的重復(fù)性良好。

2.5.9 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的荷葉樣品粉末6 份，每份約 0.1 g，精密稱定，置25 mL 具塞錐形瓶中，分別精密加入金絲桃苷和異槲皮苷單一對(duì)照品儲(chǔ)備液，按2.5.3 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按2.5.1 項(xiàng)下色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算金絲桃苷和異槲皮苷加樣回收率，結(jié)果見表2。金絲桃苷及異槲皮苷平均回收率分別為99.72%（RSD為0.72%）、98.99%（RSD為1.04%）。

表2 金絲桃苷和異槲皮苷加樣回收率測(cè)定結(jié)果

2.5.10 含量測(cè)定 取荷葉藥材和荷葉飲片，按2.5.3 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按2.5.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定樣品中金絲桃苷和異槲皮苷的含量。每樣品平行測(cè)定3次，取平均值。

3 結(jié)果

3.1 水分測(cè)定結(jié)果

《中國藥典》2020 年版（一部）規(guī)定荷葉及其炮制品的水分不得高于15%[1]，根據(jù)表3，本研究制得的傳統(tǒng)荷葉飲片和9 個(gè)一體化炮制飲片中的水分均符合規(guī)定。

表3 傳統(tǒng)荷葉飲片和9個(gè)一體化炮制飲片中水分、醇溶性浸出物測(cè)定結(jié)果%

3.2 醇溶性浸出物測(cè)定結(jié)果

《中國藥典》2020 年版（一部）規(guī)定荷葉的醇溶性浸出物不得少于10.0%[1]，根據(jù)表3，本研究制得的傳統(tǒng)荷葉飲片和9 個(gè)一體化炮制飲片的醇溶性浸出物均符合規(guī)定。其中醇溶性浸出物量8#最高，達(dá)20.10%。

3.3 荷葉堿、金絲桃苷和異槲皮素的含量測(cè)定結(jié)果

《中國藥典》2020 年版（一部）規(guī)定按荷葉干燥品中荷葉堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)不得少于0.10%，荷葉飲片中荷葉堿的質(zhì)量分?jǐn)?shù)不得少于0.070%。10個(gè)炮制樣品中荷葉堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.58%～0.92%，均符合《中國藥典》2020 年版規(guī)定。所制得的傳統(tǒng)荷葉飲片和9 個(gè)一體化炮制飲片中金絲桃苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.18%～0.42%、異槲皮苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.32%～0.60%，測(cè)定結(jié)果見表4。

表4 傳統(tǒng)荷葉飲片和9個(gè)一體化炮制飲片中荷葉堿、金絲桃苷、異槲皮苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定結(jié)果%

3.4 最優(yōu)炮制工藝的確定

3.4.1 不同炮制工藝中3 個(gè)有效成分含量比較 通過預(yù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，將新鮮荷葉在50 ℃干燥至七成干（含水量約為30%）時(shí)，荷葉堿、金絲桃苷和異槲皮苷含量最高，且高于傳統(tǒng)工藝。結(jié)果表明，9 個(gè)一體化炮制飲片中，5#～10#飲片中荷葉堿、金絲桃苷和異槲皮苷含量均高于1#。其中8#飲片中荷葉堿、金絲桃苷和異槲皮苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，分別為0.92%、0.42%和0.60%，8#飲片醇溶性浸出物含量相對(duì)較高。

3.4.2 不同干燥時(shí)間和溫度對(duì)炮制工藝的影響 新鮮荷葉采摘后如果保存不當(dāng)，很快脫水、干癟。本研究購買新鮮荷葉后立即存放在有冰袋的泡沫箱中，送至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。荷葉中主要活性成分為生物堿、黃酮類等，高溫下容易被破壞，本研究考察了30～110 ℃下干燥時(shí)間對(duì)炮制工藝的影響。結(jié)果表明，干燥溫度升高，炮制工藝所需時(shí)間越短。2#～4#樣品中金絲桃苷和異槲皮苷含量均低于1#，原因可能是低溫干燥時(shí)間長且處于濕熱環(huán)境，荷葉中酶活性強(qiáng)，使金絲桃苷、異槲皮苷和荷葉堿發(fā)生部分降解與轉(zhuǎn)化，3 個(gè)有效成分含量降低。當(dāng)干燥溫度在60 ℃以上時(shí)，測(cè)得樣品中荷葉堿、金絲桃苷和異槲皮苷含量升高；當(dāng)干燥溫度超過90 ℃后荷葉堿、金絲桃苷和異槲皮苷含量又呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，原因可能是在90 ℃以上荷葉堿和黃酮類成分開始降解。

3.4.3 優(yōu)選的一體化工藝 根據(jù)以上分析，初步優(yōu)選的一體化工藝為烘箱90 ℃烘至七成干（含水量約30%），取出切絲，置烘箱中50 ℃下烘干。

3.5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

取同一批荷葉新鮮藥材6 份，每份100 g。3份按優(yōu)選的一體化工藝制備荷葉飲片，3份按傳統(tǒng)工藝制備飲片。分別按2.3、2.4、2.5 項(xiàng)下方法測(cè)定醇溶性浸出物、荷葉堿、金絲桃苷和異槲皮苷，并按公式（1）計(jì)算變化率[12]，結(jié)果見表5。

表5 傳統(tǒng)荷葉飲片和一體化炮制飲片中相關(guān)指標(biāo)測(cè)定結(jié)果比較%

與傳統(tǒng)工藝制備的飲片比較，一體化工藝制備荷葉飲片中水分符合《中國藥典》2020 年版要求[1]。荷葉堿、金絲桃苷和異槲皮素含量均增加，變化率分別為16.67%、20.24%和20.41%，醇溶性浸出物無明顯變化。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果與3.2、3.3 項(xiàng)下結(jié)果基本一致，證明優(yōu)選的一體化工藝比較穩(wěn)定，且兩者外觀無明顯差異，見圖3。

圖3 荷葉一體化炮制飲片與傳統(tǒng)飲片的外觀

4 討論

一體化技術(shù)體系的構(gòu)建是推動(dòng)一體化穩(wěn)定發(fā)展、提升中藥飲片質(zhì)量的關(guān)鍵[13]。一體化能夠從源頭保障中藥飲片的質(zhì)量，也是目前研究的熱點(diǎn)，已有關(guān)于黃絲郁金[14]、廣藿香[15]、川芎[16]、虎 杖[17]、黃精[18]、姜半夏[19]等一體化研究的相關(guān)報(bào)道。

首先通過預(yù)試驗(yàn)比較了新鮮荷葉切絲后再干燥和在50 ℃干燥至七成干再切絲荷葉中荷葉堿、金絲桃苷和異槲皮苷的含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，新鮮荷葉直接切絲得到的飲片中各成分的含量明顯低于50 ℃干燥至七成干再切絲的荷葉；再通過預(yù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，新鮮荷葉在50 ℃下干燥至七成干（含水量為30%）時(shí)，荷葉堿、金絲桃苷和異槲皮苷成分含量最高，且高于傳統(tǒng)工藝；荷葉中主要活性成分為生物堿、黃酮類等，高溫容易被破壞，所以預(yù)試驗(yàn)考察了不同溫度下烘至七成干所需的時(shí)間?；谝陨项A(yù)試驗(yàn)，設(shè)計(jì)了9 個(gè)一體化炮制工藝，以荷葉堿、金絲桃苷、異槲皮苷的含量和醇溶性浸出物得率為指標(biāo)，優(yōu)選最佳的一體化炮制工藝：烘箱90 ℃烘至七成干，切絲后，50 ℃干燥，此工藝下所得樣品中荷葉堿、金絲桃苷、異槲皮苷含量，醇溶性浸出物均最高，并高于傳統(tǒng)工藝，且外觀顏色無明顯差異。

與傳統(tǒng)荷葉飲片加工方法相比，一體化工藝既縮短了生產(chǎn)周期，又節(jié)約了生產(chǎn)成本，而且極大程度地保留了荷葉中的活性成分，能有效促進(jìn)荷葉的開發(fā)利用。本研究所用新鮮荷葉僅來源于湘潭縣，研究結(jié)果是用小批量荷葉樣品在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行測(cè)試分析確定的，優(yōu)選的一體化炮制飲片的藥理活性是否改變、能否適用于工業(yè)化和大規(guī)模生產(chǎn)還有待進(jìn)一步研究。

[利益沖突]本文不存在任何利益沖突。