基于薄層色譜與一測多評法的沙棘顆粒質量評價方法研究△

樊修和，唐志書，2*，宋忠興，王昌利，王珂

1.陜西中醫藥大學 陜西中藥資源產業化省部共建協同創新中心，陜西 咸陽 712046；2.中國中醫科學院，北京 100700；3.陜西海天制藥有限公司，陜西 咸陽 712000

沙棘顆粒是由沙棘加工處理后制成的顆粒劑，具有止咳化痰、消食化滯、活血散瘀功效。沙棘是胡頹子科植物沙棘Hippophae rhamnoidesL.的干燥成熟果實，具有健脾消食、止咳祛痰、活血散瘀功效，含有多種營養物質和人體所需的氨基酸[1]。其主要活性成分是黃酮類化合物，多為以異鼠李素、槲皮素、山柰素為母核的黃酮苷元及苷。現代研究表明，沙棘黃酮類化合物通過增加血管柔韌性和可塑性、改善心肌舒張功能、抑制血小板凝聚、改善微循環等發揮藥理作用[2-3]。

對沙棘顆粒進行總黃酮及單一黃酮類成分的含量測定、薄層鑒別研究已有報道[4-6]，但由于成分具有復雜性，僅對單一成分進行檢測難以全面評價藥物質量。一測多評法（QAMS）可對多成分進行同時測定，并能夠降低成本，快速實用[7-10]。本研究優化、完善了沙棘顆粒的薄層鑒別方法，建立了黃酮類成分的QAMS，可為該制劑的質量標準提升提供參考。

1 材料

1.1 儀器

e2695 型高效液相色譜儀（美國Waters 公司）；1260型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；WFH-201BJ 型紫外-可見透射反射儀（上海精科實業有限公司）；TH-Ⅱ型薄層加熱器（上海科哲生化科技公司）；CPA225D 型電子天平（北京賽多利斯科學儀器有限公司）。

1.2 試藥與耗材

對照品槲皮素（批號：100081-201610）、山柰素（批號：110861-201310）、異鼠李素（批號：110860-201611）純度均≥98%，沙棘對照藥材（批號：121519-201302）均購于中國食品藥品檢定研究院；色譜純乙腈（美國Honeywell 公司）；色譜純磷酸（天津市科密歐化學試劑有限公司）；水為娃哈哈純凈水；其余試劑均為分析純；硅膠G板（批號：20211111，青島海洋化工有限公司）。

沙棘顆粒樣品由內蒙古海天制藥有限公司生產（批號分別為200901、200902、200903、200904、200905、200906、201001、201002、201003、201004、201005、201101、201102、201103、201104），規格為15 g/袋。

2 方法與結果

2.1 薄層鑒別

2.1.1 對照品溶液和對照藥材溶液的制備 取山柰素、異鼠李素、槲皮素對照品適量，加甲醇制成質量濃度為1 mg·mL-1的混合對照品溶液。

按《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）2020 年版沙棘藥材鑒別項下方法[11]制備沙棘對照藥材溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 取本品2.0 g，加石油醚20 mL，浸泡12 h，回流1 h 脫脂，揮去石油醚，加70%乙醇50 mL 加熱回流1 h，趁熱濾過，濾液水浴蒸干，殘渣加水25 mL 使溶解，加鹽酸3.5 mL，水浴加熱水解30 min，立即冷卻，乙酸乙酯振搖提取2 次，每次20 mL，合并上層液，水洗2 次，每次15 mL，蒸干乙酸乙酯，殘渣加甲醇2 mL 溶解，備用。

2.1.3 色譜條件 吸取供試品溶液3 μL、對照品溶液1 μL、對照藥材溶液4 μL，分別點于同一含3%乙酸鈉溶液的硅膠G 板，以甲苯-甲酸乙酯-甲酸（10∶8∶1）為展開劑，展開后取出，晾干，噴以1%的三氧化鋁無水乙醇溶液，置紫外光燈（365 nm）下檢視。

2.1.4 鑒別結果 采用2.1.3 項下方法對15 批沙棘顆粒進行薄層鑒別，結果見圖1。在與對照品和對照藥材相應的位置上，15 批沙棘顆粒供試品均顯相同顏色的熒光斑點。

圖1 15批沙棘顆粒薄層色譜圖

2.2 QAMS含量測定

2.2.1 色譜條件 Welch Ultimate? XB-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為0.1%磷酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～1 min，5%～7%B；1～5 min，7%～28%B；5～23 min，28%～32%B；23～33 min，32%～44%B；33～37 min，44%～95%B）；流速為1.0 mL·min-1；柱溫為35 ℃；檢測波長為365 nm；進樣量為10 μL。

2.2.2 對照品溶液的制備 分別取槲皮素、山柰素和異鼠李素對照品適量，精密稱定，加甲醇定容，制得質量濃度分別為14.67、16.67、13.33 μg·mL-1的混合對照品溶液（以純度為98%計算）。

2.2.3 供試品溶液的制備 取研細的沙棘顆粒約3.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入鹽酸（1.6 mol·L-1）-甲醇（1∶4）50 mL，稱定質量并于80 ℃加熱回流150 min，立即冷卻后再稱定質量，補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液25 mL 置于50 mL 量瓶中，加80% 甲醇至刻度，搖勻，0.22 μm 濾膜濾過，取續濾液，備用。

2.2.4 方法學考察

2.2.4.1 專屬性試驗 分別取混合對照品溶液和供試品溶液，按2.2.1 項下色譜條件分別進樣10 μL，記錄色譜圖（圖2）。供試品色譜圖中待測成分呈與對照品一致的色譜峰，與相鄰峰的分離度均大于1.5，表明該方法專屬性良好，可用于沙棘顆粒中3個成分的含量測定。

圖2 混合對照品溶液和沙棘顆粒供試品溶液的高效液相色譜圖

2.2.4.2 線性關系考察 精密吸取2.2.2 項下混合對照品溶液，用80%甲醇逐級稀釋，搖勻，制得系列質量濃度的混合對照品溶液。按2.2.1 項下色譜條件進樣分析，以對照品質量濃度為橫坐標（X）、峰面積為縱坐標（Y），計算得回歸方程及r，結果見表1。

表1 沙棘顆粒中3個成分的線性關系考察結果

2.2.4.3 精密度試驗 精密吸取2.2.2 項下的混合對照品溶液，連續進樣6 次，記錄色譜圖，槲皮素、山柰素、異鼠李素峰面積的RSD 分別為0.23%、0.90%、0.33%，表明儀器精密度良好。

2.2.4.4 穩定性試驗 取沙棘顆粒（批號：190101），按2.2.3項下方法制備供試品溶液，分別在0、2、4、8、12、24 h 進樣分析，記錄色譜圖，槲皮素、山柰素、異鼠李素峰面積的RSD分別為0.71%、1.02%、0.51%，表明24 h內樣品穩定性良好。

2.2.4.5 重復性試驗 取沙棘顆粒（批號：190101），精密稱定6 份，按2.2.3 項下方法制備供試品溶液，進樣測定并記錄色譜圖，得槲皮素、山柰素、異鼠李素含量的RSD 分別為2.01%、2.99%、2.70%，表明該方法重復性良好。

2.2.5 QAMS的建立

2.2.5.1 相對校正因子（f）的計算 取2.2.4.2項下系列混合對照品溶液，進樣測定，以槲皮素為內參物，按公式（1）計算f。

式中，As為內參物峰面積；Cs為內參物質量濃度；Ai為待測成分峰面積；Ci為待測成分質量濃度。

山柰素和異鼠李素的f分別為1.57、0.92，RSD分別為2.18%、2.11%。

2.2.5.2 耐用性考察 取2.2.4.2 項下混合對照品溶液，進樣測定，考察不同色譜儀（Agilent 1260 及Waters e2695）、不同色譜柱[Welch Ultimate? XB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、島津Inertsil ODS-SP（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Agilent 5 TC-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）]對各成分f的影響，見表2。采用Waters e2695色譜儀、Welch Ultimate? XB-C18色譜柱考察不同流速和柱溫對各成分f的影響，結果見表3、表4。不同儀器、色譜柱、流速和柱溫對f影響較小，表明該方法耐用性較好。

表2 不同色譜儀和色譜柱考察沙棘顆粒2個待測成分的f

表3 不同流動相流速考察沙棘顆粒2個待測成分的f

表4 不同柱溫考察沙棘顆粒2個待測成分的f

2.2.5.3 色譜峰的定位 對2.2.5.2 項下儀器和色譜柱的相對保留時間進行考察以定位色譜峰，結果見表5，待測成分相對保留時間的RSD 均小于3%。

表5 不同色譜儀、色譜柱沙棘顆粒2個待測成分的相對保留時間

2.2.5.4 QAMS與外標法（ESM）比較 取15 批沙棘顆粒樣品，按2.2.3 項下方法制備供試品溶液，測定。采用ESM 和QAMS 對樣品中3 個成分含量進行測定，采用SPSS 21.0軟件對2組結果進行Pearson相關性分析，2 種方法的r均為1.000，計算的含量具有較高相關性（P＜0.01），結果見表6。按公式（2）計算相對誤差，以相對誤差表示2種方法測得的結果差異。

表6 ESM與QAMS測定沙棘顆粒中各成分含量mg/袋

式中，W1為QAMS 所測含量；W2為ESM 所測含量。

結果發現，2 種方法測得的組分含量一致性好，相對誤差均小于3%，表明建立的QAMS 可用于沙棘顆粒含量測定。

2.2.5.5 沙棘顆粒質量控制標準分析 采用Graph-Pad Prism 8.0.1 軟件對15 批樣品的3 個成分含量數據進行分析，如圖3 所示，山柰素含量批間差異較小，含量為0.104 9～0.156 3 mg/袋；槲皮素含量（0.129 1～0.208 7 mg/袋）和異鼠李素含量（0.317 4～0.675 3 mg/袋）批間差異較大。通過對批間3 個成分的對比分析，建議取各成分最小含量值的80%作為標準，即將沙棘顆粒含槲皮素、山柰素、異鼠李素含量不少于0.10、0.08、0.25 mg/袋作為其質量控制標準。

圖3 不同批次沙棘顆粒中3個待測成分含量差異（,n=3）

3 討論

沙棘顆粒由沙棘單味藥制成，其黃酮類成分含量高，藥理活性明確。本研究以槲皮素、山柰素和異鼠李素為檢測對象，優化完善了薄層鑒別方法，建立了QAMS含量測定方法。

3.1 薄層鑒別條件的考察與優化

基于《中國藥典》2020 年版中沙棘藥材的薄層鑒別方法，結合參考文獻[12-13]，增加了槲皮素和山柰素作為指標成分。因沙棘顆粒以沙棘鮮果壓榨后提取合并制成，制劑中的沙棘油會干擾待測成分的分離和顯色。本方法采用石油醚除油，薄層斑點明顯減少且顏色更加鮮明。

在展開系統考察中，分別采用甲苯-甲酸乙酯-甲酸和正己烷-乙酸乙酯-甲酸為展開劑展開，取出，晾干，噴以1%的三氧化鋁無水乙醇溶液，置紫外光燈（365 nm）下檢視。通過對比待測成分的分離度，不斷優化展開劑配比，選擇甲苯-甲酸乙酯-甲酸作為沙棘顆粒薄層鑒別的展開系統。

選擇溫度（4、40 ℃）和相對濕度（18%、72%）為色譜方法學考察條件。結果表明，在上述條件下供試品、對照品的色譜斑點位置、顏色差別不大，溫度和相對濕度對沙棘顆粒的薄層鑒別結果影響不大。同時考察了3個不同品牌硅膠G 板，用3%乙酸鈉溶液處理后的青島海洋硅膠G 板分離度和清晰度最佳，可滿足沙棘顆粒的薄層鑒別要求。

3.2 QAMS含量測定方法建立

從提取方法、流動相種類及配比、柱溫、檢測波長方面系統考察了含量測定方法的分離效果。結果顯示，回流提取優于超聲提取；乙醇作提取溶劑時色譜峰數目少，且異鼠李素峰面積較小，參考文獻[14-15]后選擇甲醇與低濃度鹽酸為提取溶劑；考察回流時間時發現，回流150 min 時3 個成分含量均較高，隨回流時間增加，3 個成分含量呈下降趨勢。流動相選擇甲醇-磷酸水溶液時分離效果差，故選用乙腈-0.1%磷酸水溶液。柱溫考察選擇25、30、35 ℃，在35 ℃時山柰素與異鼠李素的分離效果最佳。3 個成分在365 nm 波長下均有最大吸收，因此選擇365 nm 為檢測波長。本研究以酸水解方式提取待測成分，故計算的槲皮素、山柰素和異鼠李素含量均以苷元計。最后，通過分析15 批樣品中3 個待測成分的含量，對沙棘顆粒中槲皮素、山柰素和異鼠李素的含量限度給出了參考范圍。

本研究對沙棘顆粒薄層鑒別條件進行了優化，建立了以槲皮素為內參物、同時測定其中山柰素和異鼠李素含量的QAMS，從定性和定量2 個方面評價制劑質量，可為其質量標準的修訂提供參考。

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