基于UHPLC-Q-Exactive Orbitrap MS的復方一枝蒿顆粒化學成分快速鑒定△

劉明娟，李凱琳a，張敏，唐蘇女，劉玲，李晴，郭俐蘭，楊建波，李輝*

1.湖南醫藥學院 藥學院 侗醫藥研究湖南省重點實驗室，湖南 懷化 418000；2.新疆維吾爾自治區藥品檢驗研究院 國家藥品監督管理局中藥（維藥）質量控制重點實驗室，新疆 烏魯木齊 830054；3.中國食品藥品檢定研究院，北京 100050

復方一枝蒿顆粒是維吾爾族醫學中治療感冒的臨床經驗方，由板藍根、大青葉、一枝蒿3 味藥組成[1]。板藍根為菘藍Isatis indigoticaFort.的干燥根，大青葉為菘藍的干燥葉，一枝蒿為菊科蒿屬多年生草本植物一枝蒿Artemisia rupestrisL.的全草，臨床多用于抗病毒[2]。多項研究表明，板藍根和大青葉主要成分包括氨基酸類、核苷類、多糖類、生物堿類、萜類、苯丙素類、有機酸類等成分，其中靛玉紅是大青葉原藥材含量控制成分，也屬于大青葉特征性成分[3-4]；表告依春在板藍根中含量穩定，屬于其特征成分[5]。一枝蒿主要含有黃酮類、倍半萜類、生物堿類等化學成分[6]。復方一枝蒿顆粒主要有2 種制法，傳統制粒為濕法制粒，將一枝蒿、大青葉、板藍根3 味藥加水煎煮濾過，濃縮醇沉，取上清液，回收乙醇并濃縮至稠膏，和輔料加入濕法制粒機制粒；改進制粒工藝采用噴霧制粒法，將一枝蒿、大青葉、板藍根3 味藥加水煎煮濾過，濃縮醇沉取上清液，回收乙醇并濃縮至清膏，和輔料加入噴霧制粒機容器倉制粒，改進制粒生產工藝更簡單，顆粒成型良好[7]。

維吾爾族醫學中記載復方一枝蒿顆粒功效為清除“乃孜來”、解毒利咽，用于治療“乃孜來”所致的感冒、發燒、咽喉腫痛；中醫記載其功效為解表祛風、涼血解毒，用于邪毒所致的感冒發熱、咽喉腫痛，病毒性感冒見上述證候者[8]。現代研究證明，復方一枝蒿顆粒具有抗炎、抗病毒和免疫調節等功效，臨床上主要用于治療感冒發燒和咽喉腫痛，療效確切[9-14]，但目前對復方一枝蒿顆粒成分研究報道較少。

超高效液相色譜-四極桿-靜電軌道場離子阱質譜法（UHPLC-Q-Exactive-Orbitrap-MS）具有高分辨率高、高靈敏度、高分離度等特點，可同時快速分辨物質裂解的一級質譜和二級質譜信息，常被用于中藥材及中藥復方復雜化學成分的鑒定[15-18]。

本研究采用UHPLC-Q-Exactive-Orbitrap-MS 表征復方一枝蒿顆粒的化學成分，對各成分進行鑒定歸屬、系統分析，以期為復方一枝蒿顆粒的藥效物質基礎、質量控制等研究提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Q-Exactive Focus 型四極桿-靜電軌道場離子阱質譜儀、Dionex UltiMate 3000 型高效液相色譜儀均購于美國Thermo Fisher Scientific 公司；KQ-300DE型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Mighty-10 型超純水機（上海礫鼎水處理設備有限公司）；AUW120D 型電子天平（福州華志科學儀器有限公司）；5424 R 型高速離心機（德國Eppendorf公司）。

1.2 試藥

復方一枝蒿顆粒（新疆銀朵蘭藥業股份有限公司，批號：220208、221226）。

對照品新綠原酸（批號：X-014-170309）、隱綠原酸（批號：Y-067-180425）、異綠原酸A（批號：Y-068-170903）、異綠原酸C（批號：Y-070-170515）、異綠原酸B（批號：Y-069-180105）、咖啡酸（批號：RDD-K00311812016）、異槲皮苷（批號：Y-076-181025）、木犀草素-7-O-葡萄糖苷（批號：M-025-181025）、木犀草素（批號：M-007-190422）、山柰酚（批號：S-014-171216）均購自成都瑞芬思生物科技有限公司；蘆丁（成都埃法生物科技有限公司，批號：AF8032520）；山柰酚-3-O-新橙皮糖苷（武漢天植生物技術有限公司，批號：CFN201901）；蒙花苷（寶雞市晨光生物科技有限公司，批號：HR16926S1）；芹菜素（成都普菲德生物技術有限公司，批號：22042001）；以上對照品純度均大于98%；色譜純甲酸、乙腈、甲醇購自天津康科德科技有限公司；水為純凈水（屈臣氏飲用水有限公司）。

2 方法

2.1 供試品溶液制備

精確稱取復方一枝蒿顆粒2 g，移入100 mL 具塞錐形瓶中，加入70%甲醇50 mL，超聲處理1 h后，將提取液抽濾得續濾液，在50 ℃旋干，取100 mg左右，加入甲醇1 mL溶解，在4 ℃、13 523×g離心20 min，取上清液置于進樣小瓶中，即得供試品溶液。

2.2 對照品溶液制備

分別精密稱取各對照品，加入甲醇溶解，配制成質量濃度為1 mg·mL-1的對照品溶液，再分別取50 μL 置于同一液相小瓶中，加入甲醇稀釋至1 mL，搖勻，基于對照品不同的相對分子質量，將其制備成不同的混合對照品溶液（50 μg·mL-1），放于4 ℃保存，備用。

2.3 色譜條件

Thermo Scientific Syncronis C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動相為0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～2 min，95%～92%A；2～5 min，92%～85%A；5～10 min，85%～78%A；10～12 min，78%～50%A；12～20 min，50%～35%A；20～25 min，35%～20%A；25～26 min，20%～95%A；26～30 min，95%A）；體積流量為0.3 mL·min-1；柱溫為45 ℃；進樣量為2 μL。

2.4 質譜條件

電噴霧離子源（ESI），正、負離子模式下采集，數據采用一級母離子全掃描和數據依賴性二級子離子掃描（Full Scan MS/dd-MS2）或平行反應監測模式（PRM）；Full Scan MS/dd-MS2參數設置：噴霧電壓正離子模式下為3.5 kV、負離子模式下為3.0 kV；質譜掃描范圍為m/z120～1000；分辨率為35 000；噴霧電壓為3 kV；鞘氣壓力為30 arb；輔助氣壓力為10 arb；毛細管溫度為320 ℃；S-lens 為50 eV，碰撞能量為30 eV。PRM 參數設置：分辨率為35 000，隔離窗口為m/z2.0，碰撞能量為50 eV，自動增益控制（AGC）設置為5.0×105。

2.5 化合物鑒定策略

建立基于UHPLC-Q-Exactive Orbitrap MS 鑒定中藥成分化學成分的分析策略，進而開展復方一枝蒿顆粒的化學成分定性研究。1）根據中英文文獻及網絡數據庫，檢索復方一枝蒿顆粒及單味藥材已報道的化學成分，建立該經典名方的化學成分數據庫；2）通過Orbitrap 超高分辨率全掃描采集，根據一級質譜提供的精確相對分子質量，運用Xcalibur 4.2軟件精確推測色譜峰的元素組成和分子式；3）將未知化合物的二級碎片離子與現有文獻和已經建立的復方一枝蒿顆粒成分庫對比，初步推測該色譜峰歸屬；對于具有相同元素組成和相似質譜碎片的同分異構體，考察其色譜保留時間，推測色譜峰可能的結構；4）歸納對照品和已確定的化學成分質譜裂解規律，不飽和度、N規律、同位素峰度規律等，推測未知化合物的類型和結構。

3 結果與分析

采用UHPLC-Q-Exactive Orbitrap MS對供試品溶液和對照品溶液進行分析，得到正、負離子模式下的總離子流圖。通過分析準分子離子峰、碎片離子信息，結合對照品和文獻報道，共鑒別了90 個化學成分，包括2個氨基酸、8個萜類、25個有機酸、11個含氮化合物、44個黃酮。其中，16個成分通過與對照品比對確認，見表1，其基峰離子色譜圖見圖1。

圖1 復方一枝蒿顆粒正、負離子模式下的基峰離子色譜圖

表1 復方一枝蒿顆粒中化學成分鑒定結果

3.2 氨基酸類成分

復方一枝蒿顆粒中鑒定出2個氨基酸成分（化合物1、3）。該類化合物在正離子模式下以準分子離子[M+H]+形式被檢測出。化合物1的tR為2.42 min，正離子模式下準分子離子峰為m/z166.086 18 [M+H]+，預測分子式為C9H11NO2，MS2圖譜中碎片離子主要有m/z149.059 7 [M+H-NH3]+、120.080 9 [M+HHCOOH]+和103.054 4 [M+H-HCOOH]+，與數據庫基本一致，推斷化合物1 為苯丙氨酸。化合物3 的tR為4.13 min，正離子模式下準分子離子峰為m/z205.096 89 [M+H]+，MS2圖譜中碎片離子主要有m/z188.070 3 [M+H -NH3]+和146.059 8 [M+H -CHNO2]+，與文獻[19]報道基本一致，推斷化合物3為L-色氨酸。

3.3 萜類

倍半萜二聚體是新疆一枝蒿中極具特點的一類化合物，該類化合物在裂解時的主要特征是酯鍵斷裂或環發生逆狄爾斯-阿德爾反應裂解（RDA）產生一枝蒿酮酸，進一步發生脫水、脫羧反應。從復方一枝蒿顆粒中共鑒定出8個萜類化合物（化合物65、70、79、81、86、88～90）。化合物90的tR為19.16 min，負離子模式下準分子離子峰為m/z479.280 27 [M-H]-，預測分子式為C30H40O5。MS2圖譜中碎片離子主要有m/z435.290 9 [M-CO2-H]-、247.133 8 [M-HC15H30O3-H]-、231.138 7 [M-C15H30O3-OH-H]-，與文獻[20]報道基本一致，推斷該化合物為artepestrin E。化合物81負離子模式下的tR為14.23 min，準分子離子峰為m/z247.133 96，MS2圖譜中碎片離子主要有m/z203.143 5 [M-CO2-H]-，188.120 1 [M-CO2-CH3-H]-，163.112 0 [M-C4H4O2-H]-，149.096 3[M-C2O3-C2H2-H]-，與文獻[21]報道基本一致，推斷該化合物為一枝蒿酮酸，可能的質譜裂解途徑見圖2。

圖2 一枝蒿酮酸的裂解途徑

3.4 有機酸類

有機酸是一類廣泛存在于植物中的具有酸性的有機化合物，該類化合物在ESI 負離子模式下響應好，易失去H2O、CO2等中性碎片[22]。從復方一枝蒿顆粒中共鑒定出25 個有機酸類化合物（化合物2、5、7、12～16、18、19、21、23、27、30、32、34、43、51～53、57、66、67、69、71）。化合物5、12、13、16、51、52、57的tR分別為4.50、6.12、6.36、6.71、11.25、11.69、12.40 min，結合對照品的tR、高分辨質譜信息分別鑒定為新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、異綠原酸B、異綠原酸A 和異綠原酸C。隱綠原酸由1 分子的奎尼酸和1 分子的咖啡酸酯化生成，在負離子模式下準分子離子為m/z353.087 89 [M-H]-，二級碎片離子信息為m/z191.055 4、179.034 2、173.044 8、135.044 1，其裂解途徑為酯鍵斷裂得到奎尼酸碎片離子峰m/z191.055 4 [M-C9H6O3-H]-及咖啡酸碎片離子峰m/z179.034 2 [M-C7H10O5-H]-，奎尼酸繼續脫去1 分子H2O 生成m/z173.044 8 [M-C9H6O3-H2O-H]-，而咖啡酸繼續脫去CO2得到碎片離子m/z135.044 1[M-C7H10O5-CO2-H]-[23]。異綠原酸C 在負離子模式下準分子離子峰為m/z515.119 75 [M-H]-，預測分子式為C25H24O12。MS2圖譜中碎片離子主要有m/z353.088 0 [M-caffeoyl-H]-、191.055 5 [M-2caffeoyl-H]-、179.034 2 [M-C7H10O5-H]-、173.044 7 [M-2caffeoyl-H2O-H]-，其可能的裂解途徑見圖3。

圖3 異綠原酸C的裂解途徑

3.5 含氮化合物類

從復方一枝蒿顆粒中共鑒定出11 個含氮化合物（化合物4、6、8～11、24、55、62、72、80）。化合物4的tR為2.42 min，正離子模式下準分子離子峰為m/z130.032 10 [M+H]+，預測分子式為C5H7NOS，MS2圖譜中碎片離子主要有m/z84.044 9 [M-SCH2+H]+、70.065 8 [M-SC2H4+H]+，與文獻[24]報道基本一致，推斷該化合物為表告依春。化合物8 的tR為5.76 min，正離子模式下準分子離子峰為m/z217.097 08 [M+H]+，預測分子式為C12H12N2O2，MS2圖譜中碎片離子主要有m/z144.080 7 [M-C4H11N+H]+和74.024 1 [M-C6H11N2O2+H]+，與文獻[19]報道基本一致，推斷該化合物為2,3-二氫-1H-吡咯并[2,1-C][1,4]苯并二氮雜卓-5,11(10H,1laH)-二酮。

3.6 黃酮類

黃酮類化合物是以2-苯基色原酮為骨架衍生的一類廣泛存在于自然界的化合物，在ESI 電離條件下，黃酮類化合物易脫去H2O、CO 和CH2O 等中性碎片，黃酮的母核C 環易發生RDA 裂解反應，產生A環和B環特征碎片離子[22]。從復方一枝蒿顆粒中共鑒定出44 個黃酮類化合物（化合物17、20、22、25、26、28、29、31、33、35～42、44～50、54、56、58～61、63、64、68、73～78、82～85、87）。化合物36、41、45、47、73～75、77、78的tR分別為10.01、10.29、10.47、10.67、13.20、13.42、13.43、13.91、13.97 min，通過與對照品的tR、準分子離子和碎片離子比對，分別鑒定為蘆丁、山柰酚-3-O-新橙皮苷、異槲皮苷、木犀草素-7-O-葡萄糖苷、蒙花苷、木犀草素、槲皮素、芹菜素、山柰酚。以化合物36蘆丁的質譜裂解為例進行分析，見圖4。蘆丁為槲皮素的蕓香糖苷，tR為10.01 min，預測分子式為C27H30O16，負離子模式下準分子離子峰m/z609.147 03[M-H]-，在丟失蕓香糖中性碎片后形成苷元碎片m/z301.035 1 [M-Rha-Glc-H]-，苷元碎片發生RDA 裂解產生碎片m/z151.002 3、178.997 8[25]。化合物82正離子模式下的tR為14.43 min，準分子離子峰為m/z361.091 06 [M+H]+，預測分子式為C5H7NOS，MS2譜中碎片離子主要有m/z328.057 2[M-CH3-H2O+H]+、346.067 7 [M+H-CH3]+，與文獻[26]報道基本一致，推斷化合物82為貓眼草酚D。

圖4 蘆丁的裂解途徑

4 討論

中藥復方中含有較為復雜的化學成分，明確化學成分組成對于闡明其藥效物質基礎、制定質量標準和進一步研究制備工藝具有重要意義[27]。新疆一枝蒿具有顯著的清熱解毒、消食健胃、利膽、解蛇毒、抗菌消炎、抗過敏作用，作為民族藥，在民間應用已久。隨著中藥研究領域的擴大及中藥制劑新技術的應用，新疆一枝蒿顆粒被廣泛應用于臨床[28]，但其復方制劑藥效成分尚不明確，藥理研究不夠深入[29]。

本研究采用UHPLC-Q-Exactive Orbitrap MS 對復方一枝蒿顆粒的成分進行研究，通過獲得的準分子離子峰、二級碎片離子峰，結合參考文獻、數據庫及對照品信息共鑒定出90 個化合物，以黃酮類、有機酸類和含氮類成分為主。已有研究表明，無特殊取代基的小分子黃酮類化合物（如木犀草素）可以較好地抑制新型冠狀病毒主蛋白酶，發揮抗病毒作用[30]。現代藥理學研究表明，黃酮類化合物具有抗炎、抗氧化、降血壓、抗動脈粥樣硬化、抗心肌缺血等藥理作用[31-32]，有機酸類成分結構中的酚羥基具有易氧化的特點，使得這一類化合物均有不同程度的抗氧化、抗炎等藥理作用[22]。這些可能是復方一枝蒿顆粒的主要的藥效物質基礎。本研究對復方一枝蒿顆粒的化學組成進行了較為系統的闡釋，可為深入分析其藥效物質基礎及建立質量標準提供依據，也為進一步的藥理作用機制研究提供了化學依據。

[利益沖突]本文不存在任何利益沖突。