HPLC多組分定量結(jié)合化學(xué)計量學(xué)及灰色關(guān)聯(lián)度的葆宮止血顆粒質(zhì)量評價△

田紅女，張曉冬，王海燕

1.南陽市中心醫(yī)院 藥學(xué)部，河南 南陽 473000；2.河南中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，河南 鄭州 450046

葆宮止血顆粒由地黃、三七、醋北柴胡、白芍、仙鶴草、金櫻子、煅牡蠣、椿皮、大青葉和側(cè)柏炭10 味中藥經(jīng)提取、濃縮等加工工藝制備而成，可固經(jīng)止血、滋陰清熱，主要用于沖任不固、陰虛血熱所致月經(jīng)過多、經(jīng)期延長、經(jīng)色深紅、經(jīng)血質(zhì)稠或有小血塊、腰膝酸軟、咽干口燥、潮熱心煩、舌紅少津、苔少或無苔、脈細(xì)數(shù)、功能性子宮出血及上環(huán)后子宮出血等，其現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為國家藥品標(biāo)準(zhǔn)[WS3-641（Z-113）-2005（Z）-2020][1]，其中僅以白芍中芍藥苷為指標(biāo)對其進行定量分析，指標(biāo)成分單一；中國知網(wǎng)、萬方、維普等數(shù)據(jù)庫檢索到對其定量控制的相關(guān)文獻也僅限單味藥的少數(shù)成分[2-3]，均不能表征其整體內(nèi)在質(zhì)量。中藥制劑是多味中藥協(xié)同作用而發(fā)揮療效，化學(xué)成分的差異會影響其藥效。化學(xué)計量學(xué)通過對多指標(biāo)的含量數(shù)據(jù)進行降維、提取，找出對質(zhì)量控制具有顯著貢獻的主要因子[4-5]。灰色關(guān)聯(lián)度分析（GRA）[6]根據(jù)各因素數(shù)列曲線形狀相似程度分析發(fā)展態(tài)勢，可充分利用較少的原始數(shù)據(jù)尋找體系中的規(guī)律，直觀表達各指標(biāo)的綜合評判值，避免了主觀的人為判斷。本研究采用高效液相色譜法（HPLC）同時檢測葆宮止血顆粒中13 個成分（梓醇、地黃苷D、地黃苷A、益母草苷、三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、苯甲酰芍藥苷和鶴草酚）的含量，結(jié)合化學(xué)計量學(xué)和GRA 對其進行綜合質(zhì)量評價，為葆宮止血顆粒的整體質(zhì)量評價及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供參考。

1 材料

1.1 儀器

DS-2510DTH 型超聲波清洗器（上海生析超聲儀器公司）；Primaide 1430型高效液相色譜儀（日立公司）；AB135-S型分析天平（Mettler-Toledo公司）。

1.2 試藥

對照品梓醇（批號：110808-202313，純度：99.6%）、人參皂苷Rg1（批號：110703-202235，純度：98.5%）、三七皂苷R1（批號：110745-202322，純度：97.8%）、芍藥苷（批號：110736-202246，純度：96.7%）、柴胡皂苷d（批號：110778-201912，純度：96.3%）、地黃苷D（批號：112063-202103，純度：94.2%）、人參皂苷Rb1（批號：110704-202230，純度：95.1%）、柴胡皂苷a（批號：110777-201912，純度：94.8%）均購于中國食品藥品檢定研究院；芍藥內(nèi)酯苷（批號：PRF8101147，純度：98.6%）、地黃苷A（批號：PRF23040721，純度：97.1%）、苯甲酰芍藥苷（批號：PRF8040621，純度：97.2%）、益母草苷（批號：PRF9103142，純度：94.4%）均購于成都普瑞法科技開發(fā)有限公司；鶴草酚（批號：PCS3363，純度：95.0%）購于成都植標(biāo)化純生物技術(shù)有限公司；乙腈、磷酸均為色譜級；其余試劑均為分析純。

13 批葆宮止血顆粒（規(guī)格：15 g/袋，批號分別為 2006026、2010040、2011008、2011027、2011074、2102017、2104031、2104051、2105035、2203030、2205037、2205047、2206027，編號為S1～S13）購于天津中盛海天制藥有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

2.1.1 混合對照品溶液制備 精密稱取各對照品適量，用50%甲醇制成梓醇、地黃苷D、地黃苷、益母草苷、三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、苯甲酰芍藥苷和鶴草酚質(zhì)量濃度分別為0.536、0.328、0.176、0.114、0.470、2.386、1.942、0.410、0.372、1.924、3.810、0.356、0.132 mg·mL-1的混合對照品母液。再用50%甲醇將混合對照品母液稀釋20倍，混勻，即得。

2.1.2 供試品溶液制備 取葆宮止血顆粒適量，研細(xì)，取約2 g，精密稱定，加50%甲醇約20 mL，超聲處理30 min，溶劑定容，濾過，備用。

2.1.3 陰性樣品溶液制備 取按葆宮止血顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中制法項下方法分別制備的缺地黃、缺三七、缺北柴胡、缺白芍和缺仙鶴草陰性樣品，再2.1.2項下方法制成陰性樣品溶液，濾過，備用。

2.2 色譜條件及專屬性試驗

采用CAPCELL PAK C18色譜柱；檢測波長：0～46 min，203 nm[7-16]（檢測梓醇、地黃苷D、地黃苷A、益母草苷、三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、柴胡皂苷a 和柴胡皂苷d）；46～59 min，230 nm[17-20]（檢測芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷和苯甲酰芍藥苷）；59～70 min，292 nm[21]（檢測鶴草酚）。乙腈（A）-0.2%磷酸水溶液為流動相梯度洗脫（0～10 min，10%A；10～21 min，10%～12%A；21～35 min，12%～28%A；35～46 min，28%～38%A；46～59 min，38%～40%A；59～65 min，40%～70%A；65～70 min，70%～10%A）；進樣量為10 μL；流速為1.0 mL·min-1；柱溫為30 ℃。色譜圖見圖1。理論板數(shù)按芍藥苷計應(yīng)不低于5500。葆宮止血顆粒供試品中上述13 個成分色譜峰形良好，與對照品保留時間一致，與相鄰色譜峰能有效分離（分離度均大于1.5），各成分測定不受其他組分的干擾。

圖1 混合對照品溶液、葆宮止血顆粒供試品溶液和陰性樣品溶液的HPLC圖

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系考察 分別精密吸取混合對照品母液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 mL，置不同的20 mL量瓶中，用50%甲醇定容，混勻，得到6個不同質(zhì)量濃度的混合對照品溶液，依法檢測13 個成分峰面積，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）、峰面積為縱坐標(biāo)（Y），進行線性回歸（表1）。

表1 葆宮止血顆粒13個成分的線性關(guān)系

2.3.2 精密度試驗 按2.2 項下色譜條件重復(fù)進樣同一份葆宮止血顆粒（S1）供試品溶液6 次，檢測峰面積，13 個成分峰面積RSD 分別為1.03%、1.33%、1.39%、1.50%、1.15%、0.95%、1.03%、1.22%、1.09%、0.92%、0.75%、1.21%、1.41%，表明儀器精密度良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗 取1 份葆宮止血顆粒（S1）供試品溶液，于制備后0、2、4、7、12、18、24、36 h進樣，檢測峰面積，13 個成分峰面積RSD 分別為1.62%、1.85%、1.93%、1.96%、1.79%、1.44%、1.60%、1.81%、1.93%、1.52%、1.43%、1.88%和1.95%，表明葆宮止血顆粒供試品溶液在36 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.4 重復(fù)性試驗 取葆宮止血顆粒（S1）6 份，按2.1.2 項下方法制成供試品溶液，檢測峰面積，計算13 個成分含量，各成分行列的RSD 分別為1.51%、1.89%、1.91%、1.97%、1.72%、1.42%、1.49%、1.79%、1.86%、1.38%、1.27%、1.85%和1.95%，表明方法重復(fù)性良好。

2.3.5 加樣回收率試驗 取已知13 個成分含量的葆宮止血顆粒（S1）9 份，每份1 g，精密稱定，平分為3 組，分別加入已知含量80%、100%、120%的混合對照品溶液（梓醇、地黃苷D、地黃苷、益母草苷、三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、苯甲酰芍藥苷和鶴草酚質(zhì)量濃度分別為0.419、0.161、0.094、0.059、0.323、1.416、1.137、0.262、0.219、1.304、2.861、0.185、0.069 mg·mL-1）0.8、1.0、1.2 mL，按2.1.2項下方法制成加樣供試品溶液，進樣檢測，計算各成分的回收率及RSD，結(jié)果見表2。

表2 葆宮止血顆粒13個成分加樣回收率試驗結(jié)果

2.4 葆宮止血顆粒樣品含量檢測

取13 批葆宮止血顆粒（S1～S13）依法制成的供試品溶液（每批制備3份），進樣檢測13個成分峰面積，計算葆宮止血顆粒中13個成分含量（表3）。

表3 13批葆宮止血顆粒樣品中13個成分質(zhì)量分?jǐn)?shù) mg·g-1

2.5 葆宮止血顆粒化學(xué)計量學(xué)質(zhì)量評價

2.5.1 主成分分析（PCA）利用SPSS 26.0 統(tǒng)計分析軟件對13批樣品中的13個成分進行PCA，當(dāng)特征值＞1 時，共提取到2 個主成分因子，其特征值和累積方差貢獻率見表4。再以葆宮止血顆粒中13 個化學(xué)成分含量為變量（X）、13 批次為變量（Y），建立13×13 數(shù)列矩陣，以樣品成分的含量為特征值，運用SIMCA 14.1 軟件進行PCA，結(jié)果13 批葆宮止血顆粒分為3 類（圖2），相鄰批次聚在一起，其中S10～S13 位于得分圖左側(cè)，S1～S5 位于得分圖右上側(cè)，S8、S6、S7和S9位于得分圖右下側(cè)，呈現(xiàn)一定分類趨勢，但圖中顯示各批次較為分散，表明批次間質(zhì)量差異較大。

表4 葆宮止血顆粒主成分因子的特征值和方差貢獻率

圖2 13批葆宮止血顆粒的PCA得分

2.5.2 正交偏最小二乘法-判別分析（OPLSDA）為進一步分析葆宮止血顆粒樣品質(zhì)量，了解不同批次組間差異因素，在PCA 的基礎(chǔ)上，繼續(xù)運用SIMCA 14.1 軟件，以2 個主成分為預(yù)測成分進行OPLS-DA（圖3），結(jié)果識別模型對Y矩陣的解釋率（R2Y）=0.889，預(yù)測度（Q2）=0.759，可認(rèn)為各成分含有量的模型對X矩陣的解釋率（R2X）=0.902，說明建立的OPLS-DA 模型較好[22]。再按變量重要性投影（VIP）值大小進行排序（圖4），其中芍藥苷、人參皂苷Rg1、芍藥內(nèi)酯苷、人參皂苷Rb1、梓醇、柴胡皂苷a和三七皂苷R1的VIP值＞1，表明這7個成分為不同批次樣品分組的主要因子，即上述7個成分在13批葆宮止血顆粒的富集中差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖3 13批葆宮止血顆粒樣品OPLS-DA模型得分

圖4 13批葆宮止血顆粒樣品VIP圖（，n=13）

2.6 GRA

參考文獻[23]對13 批葆宮止血顆粒中13 個成分含量測定結(jié)果進行GRA，考察13 批樣品綜合情況，綜合分析其質(zhì)量。首先對13×13矩陣數(shù)據(jù)進行規(guī)格化處理，得規(guī)格化處理矩陣。再以13 批葆宮止血顆粒中各評價指標(biāo)規(guī)格化處理后的最大值0.659 6、0.693 4、0.649 2、1.002 8、0.665 6、0.541 2、0.652 9、0.739 4、0.553 3、0.542 1、0.516 6、0.989 1和0.448 6為最優(yōu)參考序列，最小值0.659 6、0.693 4、0.649 2、1.002 8、0.665 6、0.541 2、0.652 9、0.739 4、0.553 3、0.542 1、0.516 6、0.989 1 和0.448 6 為最差參考序列。按參考文獻[23]相關(guān)公式分別計算各評價單元與最優(yōu)參考序列的關(guān)聯(lián)系數(shù)、與最差參考序列的關(guān)聯(lián)系數(shù)、相對關(guān)聯(lián)度。以相對關(guān)聯(lián)度大小為測度，對葆宮止血顆粒樣品進行質(zhì)量優(yōu)劣排序（表5）。結(jié)果13 批葆宮止血顆粒樣品相對關(guān)聯(lián)度為0.344 6～0.574 2，S10～S13 排名位于前4 位，S1～S5 排名位于中間位置，S6～S9排名位于后4位。

表5 13批葆宮止血顆粒相對關(guān)聯(lián)度排序結(jié)果

3 討論

3.1 HPLC流動相組分的選擇

本研究考察了以乙腈為有機相，0.2%磷酸水溶液、0.1%磷酸水溶液、水、0.1%甲酸溶液、0.1%乙酸溶液等為水相的流動相系統(tǒng)時，葆宮止血顆粒中所測13 個成分的色譜響應(yīng)值及分離效果。結(jié)果乙腈-0.2%磷酸水溶液系統(tǒng)較優(yōu)，且基線平穩(wěn)，13 個待測成分的檢驗用時、峰形及峰純度均最優(yōu)，色譜峰面積最大。

3.2 指標(biāo)成分選擇

葆宮止血顆粒由10 味中藥配伍，組方較為復(fù)雜，所含成分更為復(fù)雜。本研究選取方中地黃所含主要成分梓醇、地黃苷D、地黃苷A 和益母草苷，三七所含代表性成分三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1，醋北柴胡的活性成分柴胡皂苷a、柴胡皂苷d，白芍的代表性成分芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、苯甲酰芍藥苷，仙鶴草特征成分鶴草酚為指標(biāo)成分，采用HPLC對以上13個成分進行定量分析。

3.3 結(jié)果分析

建立了HPLC 測定葆宮止血顆粒樣品中13 個化學(xué)成分含量的方法，所選指標(biāo)涵蓋了處方中5 味中藥的主要成分，基本能體現(xiàn)制劑的整體質(zhì)量。該方法操作便捷，方法學(xué)驗證項目均符合《中華人民共和國藥典》2020 年版要求，數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示，13個成分含量差異較大，表明建立HPLC 多組分定量控制方法對降低葆宮止血顆粒質(zhì)量差異具有重要意義。

PCA和OPLS-DA是化學(xué)計量學(xué)中最常見的數(shù)據(jù)分析方法。PCA 為無監(jiān)督模式，通過數(shù)據(jù)降維，挖掘復(fù)雜數(shù)據(jù)間存在的內(nèi)在關(guān)系，對樣本進行分組，展示數(shù)據(jù)組內(nèi)的重復(fù)性和組間的差異性。PCA 結(jié)果顯示，13 批葆宮止血顆粒樣品聚為3 類，不同批次樣品質(zhì)量差異較大，同時相鄰批次差異較小，可能與原藥材批次間質(zhì)量差異有關(guān)，建議企業(yè)通過不斷摸索，結(jié)合指標(biāo)成分的藥理作用，建立原藥材多指標(biāo)定量控制方法，從而降低產(chǎn)品質(zhì)量差異。OPLSDA為有監(jiān)督模式，通過組間數(shù)據(jù)比較，挖掘影響產(chǎn)品整體質(zhì)量的差異標(biāo)志物。OPLS-DA 結(jié)果顯示，芍藥苷、人參皂苷Rg1、芍藥內(nèi)酯苷、人參皂苷Rb1、梓醇、柴胡皂苷a 和三七皂苷R1對葆宮止血顆粒質(zhì)量影響較大，是影響葆宮止血顆粒產(chǎn)品質(zhì)量的差異標(biāo)志物，結(jié)合含量測定數(shù)據(jù)來看，各成分含量高低和批間差異是篩選差異標(biāo)志物的主要影響因素。

GRA 是一種多因素統(tǒng)計分析方法，通過曲線間相似程度來判斷因素間的關(guān)聯(lián)程度，通過對數(shù)據(jù)進行無量綱化處理，降低了數(shù)據(jù)信息不對稱帶來的影響，結(jié)果更真實可靠，避免了主觀意愿，近年來已逐步應(yīng)用于中藥及其制劑的質(zhì)量評價中。GRA 結(jié)果顯示，13 批樣品的相對關(guān)聯(lián)度分別為0.448 7、0.538 1、0.513 3、0.545 1、0.504 6、0.377 1、0.379 7、0.430 2、0.344 6、0.561 3、0.558 3、0.565 3 和0.574 2，最大值與最小值差距較大，表明樣品質(zhì)量差異較大，同時相鄰批次差異較小，被評價對象排序與PCA、OPLS-DA 得分圖中樣品分類趨勢相吻合，表明GRA 模型可用于葆宮止血顆粒樣品質(zhì)量優(yōu)劣評價，也為生產(chǎn)企業(yè)從根本上查找引起質(zhì)量差異的原因指明了方向。

本研究所建立的HPLC 多組分定量聯(lián)合化學(xué)計量學(xué)及GRA 模型可用于葆宮止血顆粒綜合質(zhì)量評價。

[利益沖突]本文不存在任何利益沖突。