UPLC-MS/MS測定心悅膠囊中6個皂苷類成分的含量△

趙振霞，王曉蕾，耿韞，朱靖，2，于新蘭，劉永利*

1.河北省藥品醫(yī)療器械檢驗研究院 河北省中藥質(zhì)量評價與標準研究重點實驗室，河北 石家莊 050227；2.河北醫(yī)科大學，河北 石家莊 050017；3.新疆維吾爾自治區(qū)藥品檢驗研究院，新疆 烏魯木齊 830004

心悅膠囊是由西洋參莖葉總皂苷制成的單方制劑，具有益氣養(yǎng)心、和血之功效，多用于治療氣陰兩虛、瘀血阻絡引起的冠心病、心絞痛[1]。此外，尚有心悅膠囊治療冠心病慢性充血性心衰、慢性心功能不全的臨床報道[2-3]。西洋參莖葉總皂苷是從西洋參莖葉中提取的總皂苷，可補氣養(yǎng)陰、和血[4]。西洋參莖葉含有以人參皂苷為主的多種活性成分[5-7]，《中華人民共和國藥典》2020 年版中僅對人參皂苷Rg1、人參皂苷Re 與人參皂苷Rb3進行了含量測定，人參皂苷Rg1與人參皂苷Re為五加科植物的共有成分[8-9]，人參皂苷Rb3也非西洋參莖葉的特征性成分[10-12]，不能全面有效地控制該品種的內(nèi)在質(zhì)量。

超高效液相色譜-質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS）以其專屬性強、簡便快捷等優(yōu)勢在中成藥測定中被廣泛應用[13-15]。因此，參考相關文獻[16-17]，采用UPLC-MS/MS 建立心悅膠囊中人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1、擬人參皂苷F11、人參皂苷Rd和20(S)-人參皂苷F1的含量測定方法，不僅對共有的皂苷類成分進行了測定，還對西洋參莖葉的專屬性成分擬人參皂苷F11與20(S)-人參皂苷F1進行了測定，提高了方法的專屬性，可為心悅膠囊的質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Acquity UPLC/XEVO TQ-S 型超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國Waters 公司）；AE240型電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；Mili-Q型超純水儀（美國Millipore公司）。

1.2 試藥

對照品人參皂苷Rg1（批號：110703-201530，純度：91.7%）、人參皂苷Re（批號：110754-201525，純度：92.3%）、人參皂苷Rb1（批號：110704-201424，純度：93.7%）、擬人參皂苷F11（批號：110841-201406，純度：100.0%）、人參皂苷Rd（批號：111818-201302，純度：94.2%）均購自中國食品藥品檢定研究院；20(S)-人參皂苷F1（南通飛宇生物科技有限公司，批號：FY15401226，純度：100.0%）；甲醇、乙腈均為色譜純；水為超純水。

樣品心悅膠囊購自藥店（批號分別為2107591、180601、180604）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

Waters BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；以乙腈（A）-水（B）為流動相梯度洗 脫（0～2.00 min，20%～50%A；2.00～2.01 min，50%～80%A；2.01～3.00 min，80%A）；柱 溫：40 ℃；流速：0.5 mL·min-1；進樣量：5 μL。

2.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源（ESI），負離子掃描，多反應監(jiān)測（MRM）模式，毛細管電壓：3.0 kV；錐孔電壓：20 V；脫溶劑氣溫度：500 ℃，質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 心悅膠囊中6個皂苷類成分質(zhì)譜分析

2.3 溶液的制備

2.3.1 對照品溶液的制備 對照品儲備液：精密稱取對照品人參皂苷Rg110.51 mg、人參皂苷Re 10.66 mg、人參皂苷Rb110.62 mg、擬人參皂苷F1110.54 mg、人參皂苷Rd 10.20 mg、20(S)-人參皂苷F19.81 mg置100 mL量瓶中，加甲醇使溶解并定容至刻度，搖勻，再分別精密吸取上述溶液各2 mL，置同一100 mL量瓶中，加甲醇稀釋并定容至刻度，搖勻，得到人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1、擬人參皂苷F11、人參皂苷Rd、20(S)-人參皂苷F1質(zhì)量濃度分別為1.928、1.968、1.990、2.108、1.922、1.962 μg·mL-1的對照品儲備液。

系列對照品溶液：分別精密量取人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd對照品儲備液0.5、1.0、2.5、5.0、40.0、50.0 mL 置100 mL量瓶中，以20%乙腈水溶液稀釋并定容至刻度，人參皂苷Rg1質(zhì)量濃度分別為9.638、19.280、48.190、96.380、771.000、963.800 ng·mL-1，人參皂苷Re質(zhì)量濃度分別為9.839、19.680、49.200、98.390、787.100、983.900 ng·mL-1，人參皂苷Rb1質(zhì)量濃度分別為9.951、19.900、49.750、99.510、796.100、995.100 ng·mL-1，人參皂苷Rd 質(zhì)量濃度分別為9.608、19.220、48.040、96.080、768.700、960.800 ng·mL-1的系列混合對照品溶液；分別精密量取擬人參皂苷F11、20(S)-人參皂苷F1對照品儲備液0.25、1.00、2.50、5.00、40.00、50.00 mL置100 mL 量瓶中，以20% 乙腈水溶液稀釋并定容至刻度，擬人參皂苷F11質(zhì)量濃度分別為5.270、21.080、52.700、105.400、843.200、1 054.000 ng·mL-1，20(S)-人參皂苷F1質(zhì)量濃度分別 為4.905、19.620、49.050、98.100、784.800、981.000 ng·mL-1的系列混合對照品溶液。

2.3.2 供試品溶液的制備 取本品10 粒的內(nèi)容物（平均每粒質(zhì)量為0.3 mg），研細，取約0.25 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入80%甲醇25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，置水浴中加熱回流75 min，取出，放冷，再稱定質(zhì)量，用80%甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液1 mL，置100 mL量瓶中，加20%乙腈水溶液稀釋并定容至刻度，搖勻，濾過，即得。

2.4 方法學考察

2.4.1 專屬性試驗 精密量取2.3 項下的對照品溶液和供試品溶液適量，按2.1項下色譜條件和2.2項下質(zhì)譜條件進樣分析。結果各成分峰形良好，相互之間互不干擾，專屬性較好（圖1）。

圖1 心悅膠囊中6個皂苷類成分定量、定性離子二級質(zhì)譜圖

2.4.2 線性關系考察 分別精密吸取人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1、擬人參皂苷F11、人參皂苷Rd、20(S)-人參皂苷F1溶液5 μL，注入超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀，測定，以對照品進樣質(zhì)量濃度為橫坐標（X）、峰面積積分值為縱坐標（Y），進行線性回歸，結果見表2，表明各成分在各自線性范圍內(nèi)線性關系良好。

表2 心悅膠囊中6個皂苷類成分線性關系

2.4.3 精密度試驗 取人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1、擬人參皂苷F11、人參皂苷Rd 和20(S)-人參皂苷F1質(zhì)量濃度分別為48.19、49.20、49.75、52.70、48.04、49.05 ng·mL-1的混合對照品溶液，重復進樣6 次，各成分峰面積的RSD 分別為2.5%、3.7%、3.1%、3.5%、1.9%、3.1%，表明儀器精密度良好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液（批號：2107591），室溫放置，分別于0、1、4、8、15、24 h 分別進樣測定。結果各成分峰面積的RSD 分別為3.5%、2.0%、4.6%、2.6%、3.6%、3.9%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.5 重復性試驗 取同一批樣品（批號：2107591），研細，取0.125、0.250、0.375 g各3份，精密稱定，按2.3.2 項下方法分別制備供試品溶液，按2.1 項下色譜條件和2.2 項下質(zhì)譜條件進樣測定，記錄各成分峰面積積分值，計算含量及其RSD，結果人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1、擬人參皂苷F11、人參皂苷Rd 和20(S)-人參皂苷F1質(zhì)量分數(shù)分別為2.590、14.720、1.880、13.770、15.810、0.430 mg·g-1，含 量的RSD 分別 為3.1%、3.3%、3.9%、3.8%、2.1%、4.1%，表明方法重復性良好。

2.4.6 加樣回收率試驗 取已知含量的樣品（批號：2107591）9 份，每份約 0.125 g，精密稱定，分別加入用80%甲醇配制的低、中、高3個質(zhì)量濃度的混合對照品溶液25 mL，按2.3.2項下方法分別制備供試溶液，進樣測定，計算回收率，結果見表3，表明本方法回收率較好。

表3 心悅膠囊6個皂苷類成分加樣回收率試驗結果

2.5 樣品測定

采用所建立的方法測定3批心悅膠囊樣品中6個皂苷類成分的含量，結果見表4。

表4 心悅膠囊6個皂苷類成分含量測定結果mg/粒

3 討論

3.1 檢測方法的選擇

人參皂苷Rg1與人參皂苷Re 分離困難，用常規(guī)液相色譜方法實現(xiàn)分離分析時間較長，且難以檢測到一些含量較低的成分，UPLC-MS/MS 表現(xiàn)出的高選擇性、高靈敏度，大大縮短了分析時間。另外，人參皂苷類成分沒有生色團，采用紫外檢測器時只能在末端吸收處進行測定，干擾多，且其特征性成分擬人參皂苷F11無紫外吸收。因此選擇了質(zhì)譜檢測器，以MRM 模式進行測定，專屬性強、重復性好，可準確測定樣品中皂苷類成分的含量，有效地提高藥品質(zhì)量控制水平。

3.2 質(zhì)譜條件的選擇

在質(zhì)譜條件的選擇中，為使各成分準分子離子峰信號達到最強，分別用6個成分1 μg·mL-1的對照品溶液，以正、負離子模式進行檢測。之后對其進行二級質(zhì)譜掃描，離子源為ESI，定量方式為MRM，通過能量優(yōu)化來選擇特征碎片離子，研究過程中發(fā)現(xiàn)其在負離子模式下基線平穩(wěn)，具有較高的響應值和較好的峰形。因此，本研究選擇負離子模式進行測定，最終確定了最佳質(zhì)譜條件。

3.3 提取條件的選擇

本研究分別考察40%甲醇、60%甲醇、80%甲醇、100%甲醇作為提取溶劑，超聲與回流2 種提取方式，結果發(fā)現(xiàn)，選用80%甲醇回流提取75 min，各被測成分能被提取完全，且峰形較好，因此選擇以80%甲醇25 mL，回流75 min 作為本研究的提取方法。

4 結語

本研究建立了心悅膠囊中主要皂苷類成分的快速、準確的UPLC-MS/MS 分析方法，可以將超高效液相色譜的分離能力與質(zhì)譜分析的高選擇性相結合。應用所建立的方法，被測成分色譜峰峰形良好，相互之間無干擾。該方法具有重復性好、靈敏度高、選擇性強等特點，可為心悅膠囊質(zhì)量標準提高提供參考。

[利益沖突]本文不存在任何利益沖突。