土壤含水率對豫中植煙土壤微生物群落多樣性及氮循環功能基因豐度的影響

劉威 趙園園 陳小龍 史宏志

摘要：為揭示豫中典型濃香型烤煙產區植煙土壤氮素礦化動態變化、土壤微生物多樣性以及氮素循環功能基因對水分條件的響應特征，通過室內培養法研究50%（H-50%）、65%（H-65%）和80%（H-80%））持水量條件下，河南許昌植煙土壤細菌和真菌群落功能多樣性的差異。結果表明，H-65%處理土壤的無機氮礦化量及礦化速率均高于其他處理。在土壤細菌中，變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）、厚壁菌門（Firmicutes）、酸桿菌門（Acidobacteria）、浮霉菌門（Planctomycetes）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）為優勢菌門（相對豐度>3%），其中，H-80%處理中變形菌門的相對豐度顯著高于其他處理，而厚壁菌門的相對豐度顯著低于其他處理；H-50%處理中放線菌門、綠彎菌門的相對豐度顯著高于其他處理。在土壤真菌中，子囊菌門（Ascomycota）占土壤真菌總OTU（operational taxonmic units）數的90%以上，其相對豐度隨土壤含水率增加呈倒“V”的變化趨勢。LEfSe（LDA effect size）分析結果表明，各處理在細菌屬水平共檢測出6種活性生物標志物（LDA值>3.5）。細菌群落具有豐富的功能多樣性，一級功能層表現為代謝方面較活躍，二級功能層的功能基因豐度在不同含水率條件下發生明顯變化；與固氮過程相關的固氮酶基因nifK、nifD、nifH 的相對豐度在不同處理中表現為H-50%>H-65%>H-80%，反硝化過程相關基因norB、nirK、nosZ的相對豐度均在H-65%處理最高。綜合來看，合理調控土壤含水率可以有效調節豫中煙區土壤氮素礦化動態、土壤微生物群落功能多樣性以及氮循環相關功能基因的豐度。

關鍵詞：氮素礦化；土壤含水率；氮素循環；功能基因；土壤微生物群落結構

doi：10.13304/j.nykjdb.2022.0810

中圖分類號： S153； S154 文獻標志碼：A 文章編號：10080864（2024）01021412

土壤微生物作為構成土壤生態系統的重要組成部分，在維持土壤生態系統物質循環、有機質分解、養分供應、能量流動等方面發揮著重要作用[1]。土壤微生物不僅是土壤營養元素微生物礦化、固定的執行者，其自身也是土壤養分庫，通過微生物作用與周圍環境發生交換，獲得營養物質來滿足自身需要，對生態系統土壤養分的有效性和流動性具有重要作用[23]。土壤氮循環是農業生態系統元素循環的關鍵組成部分，主要包括氮異化還原、氮同化還原、反硝化作用、固氮作用、硝化作用等過程[4]。氮礦化是土壤氮素循環中把有機氮轉化成能被植物吸收利用的無機氮的過程[56]。

土壤含水率作為土壤氮素轉化過程中至關重要的影響因素，通過改變土壤的孔隙度及孔隙分布影響氧氣在土壤中的流通，進而影響微生物活性及其利用有機質的能力，最終影響土壤生態系統中的氮素礦化過程[7]。

從本質上講，氮循環是由植物、真菌、細菌和古菌等共同催化的氮化合物氧化還原反應網絡[8]，其中土壤微生物作為主要的驅動者通過一系列相互關聯的生化途徑在促進氮循環上發揮著不可或缺的作用[9]。與氮循環相關的功能微生物主要通過相關功能基因的表達來調控各過程中關鍵酶的合成，進而調控土壤氮循環過程[10]。nifH 作為編碼固氮酶的結構基因，也是固氮微生物最保守的功能基因，在生物固氮中發揮著重要的指示作用[11]。nirK和nirS 基因編碼催化反硝化過程最關鍵的酶——亞硝酸還原酶，是反硝化過程中研究最多也是最重要的功能基因[12]。norB、nosZ 基因分別參與了反硝化過程中NO和NO2的還原[13]。amoA 基因的豐度可以表征催化硝化過程氨單加氧酶的活性。因此，通常采用以上功能基因來評價土壤微生物參與的氮循環過程[14]。

河南作為典型的濃香型烤煙產區，其氣候特點表現為旺長期雨熱同步，伸根期降雨偏少，成熟期溫度較高[15]。烤煙生育期內雨熱條件的變化導致其最適土壤相對含水量的不同，勢必會引起土壤中可吸收氮量的差異，使烤煙從生理到形態上均表現出較大差異。在全球變暖的背景下，土壤水熱環境發生極大變化，而土壤含水量作為影響土壤氮循環的重要外部因子，會引起微生物活性、豐度和群落結構及相關功能基因的改變。本研究以河南許昌植煙土壤為研究對象，采用室內模擬培養的方法，研究植煙土壤的氮素礦化過程、土壤微生物及氮循環功能基因對水分變化的響應，以期為煙草栽培中最適宜土壤含水率的設置提供理論依據，并為預測環境條件變化對植煙土壤氮素循環的影響提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試土壤取自濃香型烤煙代表產區河南許昌（33°95′N，113°55′E），該區屬暖溫帶季風氣候，年均氣溫16.30 ℃，年均降水量91.34 mm，主要集中在7—9月。該地土壤為黃河沉積物發育的潮土，質地為沙壤土。統一于煙株移栽前采集2—20 cm耕層土壤，按“S”形設置5個采樣點，將各點土樣混合，于室內自然風干后去除石礫和動植物殘體等，磨細過0.01 mm篩。取一部分土壤用于土壤基礎理化性質的測定，其余儲存于4 ℃冷藏柜，用于室內培養。土壤基礎理化性質：全氮1.48 g·kg-1，堿解氮68.76 mg·kg-1，有機質10.13 g·kg-1，硝態氮14.25 mg·kg-1，銨態氮11.97 mg·kg-1，pH 7.56，田間持水量203.00 g·kg-1。

1.2 試驗設計與樣品采集

試驗設置50%（H-50%）、65%（H-65%）、80%（H-80%）共3個田間持水量水平，于35 ℃恒溫培養35 d，各處理重復3次。稱取過0.01 mm篩的土樣25.00 g裝入100 mL容量瓶中，加入蒸餾水調節至設定含水量。調節方法如下：將土樣在容量瓶底均勻鋪開，計算所需的水量，用注射器均勻加入。瓶口用塑料薄膜密封，薄膜上扎2個小孔，保持通氣。期間每隔3 d通過稱重法補充瓶內水分。于培養的第7、14、21、28、35天進行破壞性取樣，用于測定土壤中硝態氮、銨態氮含量；于第35天采集土樣用于分析土壤微生物群落功能多樣性。

1.3 土壤指標測定及計算

土壤pH 按照土水質量比1.0∶2.5 混合后用pH 計測定；全氮（total nitrogen，TN）含量采用硫酸-催化劑消解-凱氏定氮法測定[16]；土壤有機質（soil organic matter，SOM）含量采用重鉻酸鉀容量法-外加熱測定；堿解氮含量采用堿解擴散法[17]測定；土壤田間持水量采用環刀法測定；土壤硝態氮（nitrate nitrogen，NO-3-N）、銨態氮（ammonianitrogen，NH+4-N）含量均使用試劑盒（蘇州科銘生物技術有限公司）測定，并根據試劑盒使用說明書進行操作。計算土壤礦質氮含量、土壤硝化速率和土壤礦化速率。

土壤礦質氮含量=NO-3 含量+NH+4 含量（1）

土壤硝化速率=（各時段土壤NO-3 含量-初始

土壤NO-3 含量）/培養時間（2）

土壤礦化速率=（各時段土壤NO-3 和NH+4 總含量-初始土壤NO-3 和NH+4 含量）/培養時間（3）

1.4 土壤微生物群落分析

1.4.1 DNA提取和PCR擴增 土壤總DNA的提取采用HiPure Soil DNA Kit 試劑盒（D3142；廣州美基生物科技有限公司），并用帶有barcode的特異引物對提取的細菌和真菌基因組進行16SrRNA 區、ITS2 區進行PCR 擴增。其中細菌引物為341F （CCTACGGGGGCWCAG） 和806R（GGACTACHVGGGTATCTAAT）[18]；真菌引物為ITS3-KYO2 （GATGAAGACGAGYRAA） 和ITS4（TCCTCCGCTTATTGATATGC）[19]。擴增產物經2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后進行純化，構建測序文庫，將純化產物使用Novaseq PE250測序平臺進行上機測序。

1.4.2 聚類與物種注釋 用Usearch軟件對獲得的基因序列進行大規模篩選，并以97%的相似性將序列聚類成為操作分類單元（operationaltaxonomic units，OTUs），使用QIIME軟件包挑選序列集合中豐度最高的序列作為各OTUs的代表序列，這些代表性序列集合用RDP Classifier 的Na?ve Bayesian assignment算法與數據庫比對進行物種注釋（設定置信度的閾值為0.8～1.0），獲得各分類水平上的群落組成[2021]。

1.5 數據處理分析

利用Excel 2011 進行數據統計，用Origin2021 作圖，通過SPSS 17.0 用多重比較法進行差異顯著性檢驗（P<0.05）。基于已分類的OTU，利用QIIME 軟件[22]計算細菌、真菌的α 多樣性，包括Coverage 指數、Chao1 指數、Simpson 指數和Shannon 指數。利用R 軟件包（R Studio）[23]對細菌和真菌群落進行主坐標分析（principalcoordinate analysis，PCoA）。使用基于線性判別分析（linear discriminant analysis， LDA）[24]的LEfSe（LDA effect size）找到豐度有差異的微生物類群及標志性物種，細菌LDA 閾值為3.5。利用PICRUSt2 軟件進行16S rRNA 基因數據功能預測，參考KEGG（kyoto encyclopedia of genes andgenomes）數據庫，得到KO（KEGG orthology）功能的豐度預測表及KEGG 氮循環途徑相關基因豐度。

2 結果與分析

2.1 土壤含水率對土壤氮素礦化特征的影響

2.1.1 土壤含水率對無機氮礦化量的影響 從整個NO-3-N變化過程來看（圖1），NO-3-N的礦化主要發生在培養的前21 d，其含量隨培養時間的延長逐漸增加，在培養后期達到穩定狀態。培養結束時，H-50%、H-65%和H-80%處理的土壤NO-3-N含量分別為63.39、82.19 和64.29 mg·kg-1，其中H-65%處理的NO-3-N含量顯著高于其他處理。即NO-3-N含量隨土壤含水率的增加而增加，超過一定范圍，隨著土壤含水率的繼續增大，NO-3-N含量反而下降。由圖1可知，NH+4-N的礦化主要發生在培養的前14 d，隨著培養時間的延長，NH+4-N含量呈速增、平緩、速降的變化規律，最終穩定在較低水平。在培養的各個時期，H-65%處理的土壤NH+4-N 含量顯著高于其他處理。各處理礦質氮含量隨著培養時間的延長呈先迅速增加后緩慢增加的趨勢，其中H-65% 和H-80% 處理的礦質氮含量在培養35 d時略有下降；在培養過程中，H-65%處理土壤礦質氮含量顯著高于其他處理；在培養結束時，其土壤礦質氮含量最高，為99.31 mg·kg-1（圖1）。

2.1.2 土壤含水率對無機氮礦化速率的影響

由圖2 可知，隨著時間的推移，各處理土壤的硝化速率和礦化速率均表現為先升高后快速降低、最終緩慢降低的趨勢，在第7天時各處理土壤的硝化速率和礦化速率均達到峰值，其中H-65%處理的硝化速率和礦化速率最高，分別為4.09 和5.49 mg·kg-1·d-1。總體來看，H-65% 處理土壤的硝化速率、礦化速率最高；其次為H-80% 處理；H-50%處理最低。

2.2 土壤微生物群落結構分析

2.2.1 微生物物種Venn圖分析 細菌OTUs分析結果（圖3A）顯示，H-50%、H-65%、H-80%處理檢測到的特有OTU數分別為1 502、1 203、984；3個處理檢測到的共有OTUs數為834；且隨著土壤含水率的升高，細菌OTU數逐漸減少。真菌OTUs分析結果（圖3B）顯示，H-50%、H-65%、H-80%處理檢測到的特有OTUs數分別為220、184、213，共有OTUs數為97，即真菌OTUs數表現為H-50%>H-80%>H-65%。

2.2.2 微生物群落在門水平上的組成 由圖4A可知，相對豐度排名前10的菌門涵蓋了土壤樣品中超過98% 的細菌類群，其中變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）、厚壁菌門（Firmicutes）、酸桿菌門（Acidobacteria）、浮霉菌門（Planctomycetes）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）的相對豐度大于3%，為優勢菌門，累計占比超過90%。由表1可知，變形菌門在H-80%處理中的相對豐度顯著高于其他處理；厚壁菌門在H-50%和H-65%處理中的相對豐度差異不顯著，但均顯著高于H-80%處理；放線菌門和綠彎菌門在H-50%處理中的相對豐度顯著高于其他處理。隨著土壤含水率的升高，變形菌門和浮霉菌門的相對豐度逐漸升高；而放線菌門、綠彎菌門的相對豐度逐漸降低。

由圖4B可知，不同土壤含水率的樣本中平均相對豐度大于1%的真菌門有3個，分別為子囊菌門（Ascomycota）、綠藻門（Chlorophyta）和擔子菌門（Basidiomycota）。其中子囊菌門占土壤真菌總OTU數的90%以上，在H-65%處理中的相對豐度略高于其他處理，但差異不顯著（表1）。

2.2.3 物種差異分析 LEfSe分析是一種基于線性判別分析（LDA）效應量，并將其與非參數的Kruskal-Wallis及Wilcoxon秩和檢驗相結合，從而篩選關鍵生物標記物（即組間差異顯著物種）的分析方法。由圖5 可知，H-50%、H-65% 和H-80% 處理的土壤樣本中存在差異的細菌分別有18、2 和17 種。在屬水平，苯基桿菌屬（Phenylobacterium）、硝基菌屬（Nitrolancea）、水恒桿菌屬（Mizugakiibacter） 、鏈霉菌屬（Streptomyces）、牙單胞菌屬（Gemmatimonas）、固定桿菌屬（Conexibacter）為6 種活性生物標志物（LDA 值>3.5），且表現出顯著差異。其中，鏈霉菌屬、固定桿菌屬為H-50%處理的標志微生物；苯基桿菌屬、硝基菌屬、水恒桿菌屬、牙單胞菌屬為H-80% 處理的標志微生物； H-65% 處理未檢測到標志微生物。

2.3 土壤微生物群落α 和β 多樣性分析

Illumina MiSeq 測序分析表明，利用各樣本在不同測序深度時的微生物OTUs 指數構建稀釋曲線，隨著測序深度的增加稀釋曲線趨于平緩且測序數據達到飽和（圖6），即測序數據量能夠覆蓋本研究中絕大部分土壤微生物群落，可以進行下一步分析。

Simpson 指數和Shannon 指數用來評價群落的多樣性，Chao1 指數反映群落的豐富度，Coverage 指數反映群落覆蓋度。對不同土壤含水率條件下土壤細菌和真菌群落的α 多樣性指數進行分析，結果（圖7）表明，不同處理下土壤細菌和真菌群落的豐富度和多樣性存在差異。

H-65%、H-80% 處理下細菌的Coverage 指數顯著高于H-50%處理，而H-50%處理下細菌的Chao1指數、Shannon 指數顯著高于其他處理。真菌在不同含水率處理間的Chao1指數、Simpson指數、Shannon指數差異不顯著，而H-80% 處理下真菌的Coverage指數顯著高于其他處理。

細菌群落主坐標分析結果（圖8）顯示，PC1和PC2的貢獻率分別為84.83% 和10.12%。可以看出，同一處理下不同樣本間的重復性良好，且不同處理間群落結構差異較大，說明土壤含水率對土壤微生物細菌群落結構影響顯著。真菌群落主坐標分析結果（圖8）顯示，PC1和PC2的貢獻率分別為74.69%和8.02%。可以看出，同一處理下不同樣本間的重復性較差，且不同處理間真菌群落差異不明顯。

2.4 PICRUSt 功能預測分析

2.4.1 功能基因代謝通路特征 基于PICRUSt2軟件進行菌群功能分析，得到不同處理樣品細菌的功能預測信息（圖9）。利用KEGG數據庫對測序數據進行比對，在一層級下所有樣品共涉及6類生物代謝通路，包括細胞過程（represents cellularprocess）、生物體系統（organismal systems）、代謝（metabolism）、人類疾病（human diseases）、遺傳信息處理（geneticinformation processing）和環境信息處理（environmental information）。其中占主導功能的是代謝；其次為遺傳信息處理和環境信息處理。二級功能層共預測出35種子功能，其中最主要的有24種。

2.4.2 氮素循環相關基因變化 基于16S rRNA測序結果和PICRUSt2工具獲得的KEGG 65個直系同源基因簇（KO）的具體注釋信息。將注釋得到的所有KO值映射到KEGG代謝通路數據庫的“氮代謝通路圖”中，可比對出與氮代謝相關的功能基因，如圖10所示。參與氮循環5個階段（Ⅰ硝化作用、Ⅱ同化硝酸鹽還原、Ⅲ異化硝酸鹽還原、Ⅳ固氮作用、Ⅴ反硝化作用）的相關基因共有23個，展現出豐富的氮代謝功能多樣性。

由圖11可知，硝化過程常用氨單加氧酶的編碼基因amoA、amoB、amoC 及羥胺氧化還原酶的編碼基因hao 作為主要的功能基因均在H-50%處理中的相對豐度較高。與固氮作用相關的固氮酶基因主要包括nifK、nifD、nifH、anfH，其中nifK、nifD、nifH 基因在不同處理中的相對豐度表現為H-50%>H-65%>H-80%，而anfH 基因在H-65% 處理中的相對豐度最高。一氧化氮還原酶基因norB、亞硝酸還原酶基因nirK、氧化亞氮還原酶基因nosZ 作為反硝化作用過程的關鍵基因均在H-65% 處理中的相對豐度較高。氧化亞氮還原酶基因nirS 在H-50%處理中的相對豐度較高。

3 討論

本研究表明，在一定范圍內，土壤NO-3 -N、NH+4 -N含量隨著土壤含水率的增加而增加；超過一定范圍后，其含量隨著土壤含水率的增大反而下降。H-65% 處理土壤的NO-3-N、NH+4-N 含量均顯著高于其他處理，與周才平等[25]的研究結果相似。這可能是由于土壤中氧氣含量隨著土壤含水率的升高逐漸降低，抑制了氨化作用微生物的活性。隨著培養時間的延長，NH+4-N含量總體上呈速增、平緩、速降的變化規律，最終穩定在較低水平，可能是由于NH+4-N含量的增加抑制了氨化微生物的活性，而以礦化出的NH+4 -N為氮源的土壤微生物迅速繁殖，將NH+4-N逐漸轉化為NO-3-N，導致NH+4-N含量逐漸降低[26]。NO-3-N含量隨著培養時間的延長整體呈現上升趨勢，與韓曉飛等[27]研究結果一致。

本研究表明，隨著土壤含水率的變化，土壤細菌群落多樣性及豐富度發生顯著變化，而真菌群落對水分變化的響應并不明顯，與Ren 等[28]、Waldrop等[29]的研究結果一致。這可能是由于水分條件的改變使土壤碳氮含量及養分有效性發生變化，細菌、真菌在不同土壤環境中具有生理差異性[30]。研究發現，土壤不同細菌群落存在適宜其生長的水分條件的生態位[31]。放線菌門作為對固氮作用、硝化作用貢獻率最大的細菌門[32]，其相對豐度隨著土壤含水率的升高逐漸降低。Barnard等[33]也發現，在干旱條件下放線菌門的相對豐度較大，變形菌門的相對豐度則隨含水率的升高逐漸升高。變形菌門大多是兼性或專性厭氧菌，具有較強的氧化脅迫耐受能力，說明其更適應含水率較高的生長環境，與本研究結果一致。土壤真菌群落隨著土壤水分梯度的變化也會發生變化，本研究表明，擔子菌門的相對豐度隨土壤水分含量的升高逐漸降低，這與劉會會等[34]的研究結果一致。子囊菌門作為典型的陸生型真菌，占土壤真菌總OTUs數的90%以上，適應在土壤水分低、通氣條件好的環境中生存與繁殖[35]。本研究發現，子囊菌門的相對豐度隨土壤水分含量的升高呈倒“V”型的變化趨勢，即在H-65%處理最高，因此需要進一步研究影響其豐度變化的因素。

土壤水分條件的變化能夠影響氮循環基因的豐度。本研究顯示，nirK 基因的相對豐度隨著土壤含水率的增加呈倒“V”型的變化趨勢，在H-65%處理最高，可能是因為土壤含水率的升高形成了土壤中過度還原的條件，使反硝化底物濃度降低，從而抑制了反硝化微生物的繁殖與生長[4]。研究表明，nirK 基因的相對豐度與NO-3-N、NH+4 -N含量呈顯著正相關[3，36]，這與本研究H-65%處理中NO-3-N、NH+4-N 含量顯著高于其他處理的研究結果一致。nirS 基因的相對豐度隨土壤含水率的升高逐漸降低，可能是由于高含水量的土壤環境不利于氨化作用和反硝化作用[37]。反硝化過程中通過（nirK+nirS）/nosZ 值可預測N2O 排放，通過提高nosZ 基因豐度，降低該比值使N2O還原大于產生，進而減少N2O 的排放[38]。本研究表明，H-65% 處理顯著提高了nosZ 基因的豐度，且（nirK+nirS）/nosZ 值低于其他處理，可減少N2O 的產生，進而減小反硝化過程對環境的污染。與硝化過程相關的amoA、amoB、amoC 基因的相對豐度均與NO-3-N、NH+4-N含量呈顯著負相關[39]，因此不同含水率的土壤可能通過影響其NO-3-N、NH+4-N含量進而影響硝化過程相關功能基因的表達。

本研究通過室內模擬培養的方法解析了不同土壤含水率對氮素礦化及土壤微生物的影響，但是土壤微生物（細菌、古菌、真菌及病毒）互作機制及土壤-微生物-煙草系統中三者是否存在協同進化的交互作用及機制亟待進一步研究，因此在今后的研究中有必要在大田生長條件下對功能基因與土壤性質、微生物群落結構間的關系進行深入分析，從而揭示土壤氮循環過程的分子生物學機制以及土壤微生物群落與生態功能間的關聯機制，為有效調控優質煙葉生產所需要土壤氮素供應量提供科學依據。

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（責任編輯：張冬玲）