橡膠樹形成層組織的酵母雙雜交cDNA文庫構建及HbHDA6互作蛋白篩選

摘 要：次生乳管是天然橡膠合成和貯存的場所，是由橡膠樹樹干樹皮中維管形成層細胞分裂分化而來。次生乳管的數量與天然橡膠產量直接相關，而這些乳管的數量取決于形成層分化次生乳管的頻率（乳管分化能力），是橡膠樹產量育種的主要指標。前期研究中，我們發現組蛋白去乙酰化酶（HDA）抑制劑曲古抑菌素A（TSA）能誘導橡膠樹乳管分化且組蛋白去乙?；富颍℉bHDA6）能夠參與橡膠樹乳管分化調控。由于組蛋白乙酰化修飾調控橡膠樹次生乳管分化的分子機制尚未闡明，因此該文使用冠菌素（COR）誘導橡膠樹形成層分化產生次生乳管的實驗系統，以分離形成層組織為材料，構建酵母雙雜交cDNA文庫，以HbHDA6基因為誘餌來篩選酵母雙雜交文庫，確定與HbHDA6相互作用的蛋白。結果表明：（1）利用Gateway技術構建的均一化COR誘導橡膠樹形成層組織的酵母雙雜交cDNA文庫，初級文庫的容量為6.34×10⁶ CFU·mL^-1，總單克隆數為1.27×10⁷，文庫重組率為100％；次級文庫的容量為7.72×10⁶ CFU·mL^-1，總單克隆數為1.54×10⁷，文庫重組率為100％。初級文庫和次級文庫的插入片段平均長度分別為1.1 kb和1.2 kb。（2）成功構建了篩選 HbHDA6互作蛋白的pGBKT7-HbHDA6誘餌載體，并確認無自激活活性。（3）使用該誘餌載體對構建的酵母雙雜交cDNA文庫進行篩選，并通過NCBI_BLAST比對和去除重復以后，獲得了22個與HbHDA6發生互作的蛋白，包括CLP1、ERF3、ERF4、HSP82、LARP6a、APT5、PP2A、FBA6等。該研究成果為解析組蛋白乙酰化修飾調控橡膠樹次生乳管分化的分子機制提供了理論基礎，為轉基因改良橡膠樹的產膠潛力提供了候選基因，為高性能天然橡膠遺傳改良育種提供了新線索。

關鍵詞：巴西橡膠樹，次生乳管分化，維管形成層，酵母雙雜交，HbHDA6

中圖分類號：Q943 文獻標識碼：A 文章編號：1000-3142（2024）02-0245-12

基金項目：海南省自然科學基金高層次人才項目（322RC781）；國家自然科學基金（31800577）；現代農業產業技術體系建設專項（CARS-33-YZ1）。

第一作者：張世鑫（1986-），博士，副研究員，主要從事橡膠樹乳管發育和分子育種研究，（E-mail） zhangshixin_1@163.com。

^*通信作者：田維敏，博士，教授，博士生導師，主要從事橡膠樹分子育種研究，（E-mail）wmtian@163.com。

Construction of yeast two-hybrid cDNA library in cambium tissue of Hevea brasiliensis and screening of HbHDA6 interacting proteins ZHANG Shixin ¹， WU Shaohua ¹， YANG Shuguang¹， CHAO Jinquan¹，

SHI Minjing¹， GE Lixin^1，2， JIANG Yi^1，2， TIAN Weimin^1*

（ 1. Rubber Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences / National Key Laboratory for Tropical Crop Breeding / Key Laboratory of Biology and Genetic Resources of Rubber Tree， Ministry of Agriculture and Rural Affairs / Hainan Key Laboratory for Cultivation amp;

Physiology of Tropical Crops， Haikou 571101， China; 2. Tibet Agricultural and Animal Husbandry University， Nyingchi 860000， Xizang， China ）

Abstract： The secondary laticifer is the position for synthesis and storage of natural rubber （NR）， which is differentiated from the vascular cambium cells of bark in stem of rubber trees （Hevea brasiliensis）. The quantity of secondary laticifer is depended on the frequency of the secondary laticifer differentiation from cambia， which is the main index of yield breeding of rubber tree. In previous studies， we found trichostatin A （TSA）， an inhibitor of histone deacetylase （HDA）， can also induce laticifer differentiation， and the histone deacetylase gene （HbHDA6） is a participator in laticifer differentiation. Because of the molecular mechanism of secondary laticifer differentiation regulated by histone acetylation has not been clarified. Therefore， we construct a yeast two-hybrid cDNA library used the vascular cambium tissues treatment by coronatine （COR）， and screening the yeast two-hybrid library by HbHDA6 gene as the bait， for determining the proteins interacting with HbHDA6. The results were as follows： （1） The homogenized yeast two-hybrid cDNA library of vascular cambium was" constructed by the technology of Gateway. The capacity of the primary library was 6.34×10⁶" CFU·mL^-1， the total number of clones was 1.27×10⁷， and the capacity of secondary library was 7.72×10⁶ CFU·mL^-1， the total number of clones was 1.54×10⁷， and the recombination rates of two libraries were 100%. The average length of inserted fragments was 1.1 kb and 1.2 kb in primary and secondary library， respectively. （2） The bait vector of pGBKT7-HbHDA6 for screening the proteins interacting with HbHDA6 was successfully constructed and confirmed no self-activation activity. （3） The pGBKT7-HbHDA6 bait vector was used to screen the constructed yeast two-hybrid cDNA library， and 22 proteins interacting with HbHDA6 were obtained by NCBI_BLAST comparison and removing duplicates， including CLP1， ERF3， ERF4， HSP82， LARP6a， APT5， PP2A， APT5， FBA6， etc. The results provide a theoretical basis for analyzing the molecular regulatory network of the secondary laticifer differentiation of rubber tree， and provide candidate genes for the rubber production potential of genetically modified and a new clue for the genetic improvement and breeding of high-performance NR.

Key words： Hevea brasiliensis， secondary laticifer differentiation， vascular cambium， yeast two-hybrid， HbHDA6

天然橡膠是關系國民生計的重要工業原料和戰略物資，世界所需的天然橡膠主要來自巴西橡膠樹（Hevea brasiliensis）（田維敏等，2015）。橡膠樹樹干樹皮中的次生乳管是天然橡膠合成和貯存的主要場所，是由維管形成層紡錘狀原始細胞分化而來（Gomez， 1982；Hao amp; Wu， 2000；Chao et al.， 2023）。隨著形成層分化的次生乳管不斷向外推移，要經過幼嫩—成熟—衰老—死亡，為維持產膠部位的乳管數量，需要形成層不斷分化出新的次生乳管。這些次生乳管的數量與天然橡膠產量直接相關，次生乳管數量取決于維管形成層分化次生乳管的頻率（即次生乳管分化能力），是橡膠樹產量育種的主要指標（田維敏等，2015；Chao et al.， 2023）。前期研究中，我們團隊發現外施茉莉酸（jasmonic， JA）及其前體亞麻酸（linolenic acid，LA）能誘導形成層細胞分化成次生乳管（Hao amp; Wu， 2000；劉惠芳等，2001；Tian et al.， 2003）；我們后續又發現與JA的活性形式JA-Ile結構相似的冠菌素（coronatine， COR）（Ichihara et al.， 1977），在誘導橡膠樹次生乳管分化的效應方面比茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，MeJA）更好（張世鑫等，2011；Zhang amp; Tian，2015），并建立了一種穩定的COR誘導橡膠樹萌條次生乳管分化的實驗系統（Zhang amp; Tian， 2015；Zhang et al.， 2015， 2016；Wu et al.， 2016， 2023；張世鑫等，2018）。最近，我們發現組蛋白去乙?；福╤istone deacetylase，HDA）的抑制劑——曲古抑菌素A（trichostatin A，TSA）也能誘導橡膠樹次生乳管分化（Zhang et al.， 2016），使用COR處理能夠顯著提高形成層區的組蛋白乙?；潭惹襀DA活性和含量也受影響。基于這些工作基礎，以及組蛋白乙?；揎椬鳛榛蜣D錄調控的重要方式，我們推測JA誘導橡膠樹次生乳管分化，可能是通過組蛋白乙?；揎椪{控橡膠樹次生乳管分化相關基因的轉錄而實現的。

酵母雙雜交技術（yeast two-hybrid technology）是研究蛋白質相互作用的經典技術之一，是由Fields和 Song等人在研究真核生物基因轉錄調控中提出并初步建立的（Fields， 1993）。隨著分子生物學的發展，在酵母雙雜交的基礎上又建立了酵母單雜交、膜體系酵母雙雜交、酵母三雜交等多項技術，用于蛋白-蛋白、蛋白-DNA/RNA/配體之間相互作用的研究，在功能基因組學和互作組學研究中發揮重要作用。利用酵母雙雜交系統能夠快速、直接分析已知蛋白之間的相互作用，并能尋找、分離與已知蛋白相互作用的配體，在研究抗原和抗體相互作用、發現新的蛋白質和發現蛋白質的新功能、篩選藥物作用位點及藥物對蛋白互作影響、建立基因組蛋白連鎖圖等方面應用廣泛。與Pull down技術、凝膠阻滯技術（electrophoretic mobility shift assay， EMSA）和表面等離子體共振技術（surface plasmon resonance， SPR）等體外的蛋白質相互作用的研究技術相比，酵母雙雜交技術能夠更好地模擬細胞內的環境，可以更真實地反映蛋白質之間的相互作用情況（Phizicky amp; Fields， 1995）。酵母雙雜交系統的建立是基于對真核生物轉錄調控過程的認識，真核生物中基因轉錄需要反式轉錄激活因子的參與，真核生物的轉錄激活因子含有兩個不同的結構域，即DNA結合結構域（binding domain，BD）和DNA轉錄激活結構域（activation domain，AD），這兩個結構域能夠獨立分開且功能相互不影響。BD和AD分別單獨起作用時，是不能激活轉錄反應的，只有當BD和AD兩者在空間上充分接近時，才能發揮完整的轉錄激活因子活性，促使下游基因的轉錄。酵母雙雜交技術的這種特點使其成為了鑒定與已知蛋白發生相互作用的未知蛋白質的常用實驗技術，并且在解析蛋白與蛋白間的分子調控網絡中起著重要作用（Paiano et al.， 2019）。

酵母雙雜交cDNA文庫構建技術在橡膠樹分子生物學研究中也有廣泛的應用，如巴西橡膠樹膠乳酵母雙雜交cDNA表達文庫（楊子平等，2013）、巴西橡膠樹膠乳均一化酵母雙雜交cDNA文庫（余海洋等，2016）、橡膠葉片和膠乳的cDNA文庫（歐陽沫等，2016）、巴西橡膠樹地上部地下部均一化酵母雙雜交cDNA文庫（陳洪舉等，2017）、橡膠樹未開割樹和開割樹膠乳的酵母雙雜交cDNA文庫（晁金泉等，2021）、橡膠樹膜系統酵母雙雜交cDNA文庫（聶智毅等，2022）等。由于組蛋白乙?；揎椪{控橡膠樹乳管分化的分子機制尚未闡明，而酵母雙雜交文庫構建和文庫篩選能夠獲得大量的蛋白質相互作用信息，因此使用該技術構建橡膠樹次生乳管分化分子調控網絡具有顯著的優勢。本文使用冠菌素（COR）誘導橡膠樹形成層分化次生乳管的實驗系統，以分離形成層組織為材料，構建酵母雙雜交cDNA文庫，以HbHDA6基因為誘餌來篩選酵母雙雜交文庫，篩選與HbHDA6相互作用的蛋白。旨在通過酵母雙雜交技術篩選出組蛋白乙酰化修飾調控橡膠樹次生乳管分化的基因或轉錄因子，為解析橡膠樹次生乳管分化的分子調控網絡提供理論基礎，為轉基因改良橡膠樹的產膠潛力提供候選基因，為高性能天然橡膠遺傳改良育種提供新線索。

1 材料與方法

1.1 材料

植物材料為巴西橡膠樹無性系熱研7-33-97的一年生萌條，種植在中國熱帶農業科學院橡膠研究所的五隊增殖苗圃內，這些萌條每年都經過鋸桿，并通過基部的潛伏芽重新生長新的萌條，并在一年內生長5～6個伸長單位（extension unit， EU）（張世鑫等，2011）。

主要試劑和耗材：RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（DP441）、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（DP204）、質粒小提試劑盒（DP103）、酵母質粒提取試劑盒（DP112）［購于天根生化科技（北京）有限公司］；mRNA分離及cDNA建庫使用的試劑，即FastTrack^? MAG mRNA isolation Kit （K158002）、LR Clonase^TM Ⅱ Enzyme Mix （11791-020）、UltraPure^TM Phenol∶Chloroform∶Isoamyl Alcohol （25∶24∶1， V/V/V） （15593-031）、5 M Ammonium Acetate （AM9070G）、PureLink^? HiPure Plasmid Filter Midiprep Kit （K2100-15）、ElectroMAX^TM DH10B^TM T1 Phage Resistant Cells （12033-015），以上均購于賽默飛世爾科技（中國）有限公司；Carrier DNA、培養基YPDA、培養基YPD plus、SD/Trp、SD/Leu、SD/His/Leu/Trp （TDO）、SD/Ade/His/Leu/Trp （QDO）、Aureobasidin A、X-α-Gal均購自Clontech公司；FastPfu DNA Polymerase （AP221-01）購于北京全式金生物技術股份有限公司；冠菌素（coronatine， COR）、DMSO、乙酰丁香酮（acetosyringone）、MES、MgCl₂、PEG、TE、LiAc等試劑均購于Sigma公司；其他試劑均為國產分析純，槍頭和離心管均為Axygen公司產品。

1.2 冠菌素（COR）處理植物材料

選取一年生橡膠樹萌條的第三伸長單位（EU3），節間長且健壯的樹干作為實驗材料，在EU3樹干中部，使用單面刀片刮去面積為2 cm×4 cm的莖表皮及部分皮層，用面積略大的滅菌無塵紙包裹處理部位，施加含有6 μg·mL^-1的COR溶液，用塑料封口膜纏繞并密封包裹。處理時間分別為0.5 h、1 h、2 h、4 h、8 h、1 d、2 d和3 d。然后拆去塑料封口膜和無塵紙，切取處理部位的樹皮（帶部分木質部），并立即分割成小塊，置于2 mL離心管中，液氮速凍。每個時間點的形成層區樣品取自5株橡膠樹萌條進行混合，并且每個時間點進行3組生物學重復，即每個時間點的共計處理15株橡膠樹萌條。

1.3 總RNA提取及mRNA 的純化

使用冰凍切片弦切的方法收集橡膠樹樹皮的形成層區組織，使用RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（天根，DP441）提取總RNA。通過微量紫外分光光度計測定RNA濃度和純度，使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性后，合格的總RNA樣品于-80℃冰箱中保存備用。將得到的不同時間段COR處理的形成層區組織總RNA進行等量混合，利用磁珠法FastTrack^? MAG mRNA isolation Kit （Invitrogen， K158096）對總RNA中的mRNA進行分離純化，將mRNA進行等量混合后，用于后續的酵母雙雜交文庫構建。

1.4 酵母雙雜交文庫的構建

用Gateway重組技術，使用CloneMiner^TM Ⅱ cDNA文庫構建試劑盒能夠快速構建cDNA文庫。操作流程：將分離純化并等量混合后的mRNA為模板進行反轉錄，先合成cDNA第一鏈后合成cDNA雙鏈，再將得到的雙鏈cDNA進行分級分離并收集。使用LR Clonase^TM Ⅱ Enzyme Mix進行BP重組反應；使用BTX指數衰減波電穿孔儀ECM630進行電轉化到大腸桿菌ElectroMAX DH10B感受態細胞中。將電轉化后的菌液，在搖床里37℃、220 r·min^-1活化培養1 h。培養結束后，取一部分菌液涂布平板進行初級文庫容量、重組率和插入片段長度的鑒定。剩余的菌液加入甘油，至終濃度20％，于-80℃保存，即得到COR誘導橡膠樹形成層組織的cDNA初級文庫菌液。

將上一步驟中驗證合格的cDNA初級文庫，使用PureLink^? HiPure Plasmid Filter Midiprep Kit （Life， K2100-15）提取文庫質粒。將得到的初級文庫質粒，稀釋到300 ng·μL^-1，使用LR Clonase^TM Ⅱ Enzyme Mix進行文庫質粒重組，并提取重組產物后使用BTX指數衰減波電穿孔儀ECM630將重組產物轉化到大腸桿菌ElectroMAX DH10B感受態細胞中，然后進行培養，條件同上。取轉化后的10 μL菌液稀釋1 000倍，再取50 μL稀釋后的菌液，涂布LB平板（含鏈霉素抗性），37℃培養過夜。進行次級文庫容量、重組率和插入片段長度的鑒定。剩余的菌液加入甘油，至終濃度20％，于-80℃保存，即得到COR誘導橡膠樹形成層組織的cDNA次級文庫菌液。文庫的細菌菌落總數（CFU）計算方法如下：

CFU濃度（CFU·mL^-1）=平板上的克隆數/50 μL×1 000倍×1 000 μL；

文庫總CFU=CFU濃度×文庫菌液總體積（mL）。

1.5 HbHDA6誘餌質粒構建、鑒定及自激活檢測

HbHDA6誘餌質粒構建時，先對含有目的基因HbHDA6的載體進行PCR擴增后，進行Sfi I酶切，獲得目的基因HbHDA6的克隆片段。使用Sfi I酶切，獲得線性化的酵母雙雜交誘餌載體（pGBKT7），再將目的基因HbHDA6的克隆片段連接到線性化的誘餌載體（pGBKT7）上。

具體操作如下：根據HbHDA6基因的cDNA序列，設計引物時分別在其兩端添加Sfi I的酶切位點序列，用于擴增HbHDA6基因的cDNA片段。引物序列為HbHDA6-F（5′-aaggccattacggccATGGGCGACACAACCGGTGGT-3′）和HbHDA6-R（5′-ccggccgaggcggccTCAAGAACGCGGATGCTCTTCTCTCT-3′）。并按照FastPfu DNA Polymerase （AP221-01）高保真酶體系進行PCR擴增，使用Sfi I進行HbHDA6擴增片段的酶切和pGBKT7載體的線性化。使用Axygen膠回收試劑盒進行酶切產物回收。將回收的酶切產物，連接轉化到大腸桿菌Top10中，在37℃條件下恒溫培養過夜。從上述連接體系轉化平板（含鏈霉素抗性）上隨機挑取4個大腸桿菌轉化子接種于LB液體培養基，37℃、220 r·min^-1條件下振蕩培養16 h后，用pGBKT7載體的通用引物pGBKT7-F（5′-TAATACGACTCACTATAGGGC-3′）和pGBKT7-R（5′-TAAGAGTCACTTTAAAATTT

GTAT-3′），進行PCR擴增驗證，并使用1%瓊脂糖凝膠電泳進行PCR擴增產物的檢測，對擴增得到陽性條帶的克隆，進行質粒抽提（Axygen質粒小量抽提試劑盒）和測序。插入片段測序結果在比對確認正確后，進行后續實驗。按照表1構建不同質粒和涂布不同類型的平板，將各種質粒轉入酵母受體菌株AH109中，觀察并檢測結果。

從pGADT7+pGBKT7-HbHDA6共轉化AH109長出的酵母轉化子中，隨機挑取了6個菌落，進行自激活檢測，包括對HIS3、ADE2和MEL1共3個報告基因的檢測。對HIS3、ADE2和MEL1報告基因的檢測采用點板培養的方法。將轉化子點板于SD-TL+X-α-Gal和SD-TLHA平板，30℃恒溫培養4 d，觀察其生長狀態。在預先配制好的SD-TLHA板上各涂布200 μL X-α-Gal溶液，待X-α-Gal溶液被平板培養基完全吸收后，將轉化子菌液進行點板并培養。

1.6 pGBKT7-HbHDA6誘餌質粒篩選酵母文庫

用含有測序正確pGBKT7-HbHDA6誘餌質粒的AH109酵母轉化子作為受體菌來制備酵母感受態細胞。將COR處理橡膠樹形成層組織的cDNA初級文庫質粒轉入酵母感受態細胞中，并將其涂在SD-Trp-Leu-His+5 mmol·L^-1 3AT平板上并倒置培養。從SD-Trp平板挑取單克隆菌斑，接種在SD-Trp液體培養基中，在30℃、220 r·min^-1條件下振蕩培養18 h，再轉接到YPDA培養基中培養，使用紫外分光光度計，測定菌液測定初始濃度為OD₆₀₀=0.2；在30℃、220 r·min^-1條件下振蕩培養4～5 h，中途使用紫外分光光度計測定菌液的濃度，當菌液濃度達到OD₆₀₀=0.6即停止培養。將菌液離心并棄上清，重懸菌體。按照加入試劑的體積從大到小，依次加入9.6 mL的50% PEG3350，1.44 mL的1 mol·L^-1 LiAc，300 μL的ssDNA （10 mg·mL^-1） ，以及25 μg的文庫質粒DNA，并混勻體系。在30℃條件下水浴孵育30 min后，在42℃條件下水浴熱激25 min，在30℃條件下水浴復蘇1 h，將復蘇后的菌液離心并重懸菌體。從重懸菌液中取20 μL酵母培養物經梯度稀釋后，分別涂在3塊SD-TL平板上，用于酵母文庫的轉化效率檢測。剩余的酵母培養物涂在SD-TLH + 5 mmol·L^-1 3AT平板上，每塊平板涂200 μL，共涂40塊平板。在30℃條件下恒溫倒置培養3～4 d，觀察并記錄轉化結果，分析轉化效率。

1.7 陽性克隆鑒定和測序分析

在pGBKT7-HbHDA6誘餌質粒篩選酵母雙雜交文庫的平板中，挑取陽性克隆的單菌落，轉接到SD-TL缺陷型培養基平板中，在30℃條件下恒溫倒置培養2～3 d。將在SD-TL缺陷型培養基平板上長出的初始陽性克隆轉化子分別用無菌水稀釋后，接種到SD-TL和SD-TLHA+X-α-Gal缺陷平板上，進行HIS3、ADE2和MEL1報告基因的檢測，在30℃條件下恒溫培養3～4 d。

對HIS3、ADE2和MEL1報告基因進行檢測，顯示結果為陽性對照在SD-TL和SD-TLHA+X-α-Gal缺陷型培養基平板上都能正常生長，并且SD-TLHA+X-α-Gal缺陷型培養基平板上的菌落呈現藍色；陰性對照由于不會激活HIS3和ADE2報告基因，雖然在SD-TL缺陷型培養基平板上可以正常生長，但菌落不呈現藍色，而在缺少Histidine和Adenine這兩種成分的SD-TLHA+X-α-Gal缺陷型培養基平板上不能生長。因此，初始陽性克隆能在SD-TLHA+X-α-Gal缺陷型培養基平板上生長并使菌落呈現藍色，表明同時激活了HIS3、ADE2和MEL1 3個報告基因。

為了鑒定篩選到的陽性克隆的基因信息，將上述陽性克隆的菌株，分別接種于SD-TL缺陷型液體培養基中，在30℃、220 r·min^-1條件下振蕩培養16 h。使用酵母質粒提取試劑盒［天根生化科技（北京）有限公司，DP112］提取并純化出酵母質粒。將提取純化好的酵母質粒轉化到大腸桿菌Top10感受態細胞中進行擴增，在37℃、220 r·min^-1條件下振蕩培養16 h，使用大腸桿菌質粒小提試劑盒［天根生化科技（北京）有限公司，DP103］提取大腸桿菌質粒后并送樣至生工生物工程（上海）股份有限公司進行DNA測序。將DNA測序結果與NCBI_GenBank數據庫中的序列進行BLAST比對分析，獲得與HbHDA6發生相互作用的基因信息。

2 結果與分析

2.1 橡膠樹樹皮的形成層區組織分離、總RNA提取和mRNA分離純化

使用冰凍切片弦切的方法分離COR處理的一年生橡膠樹萌條樹皮形成層區組織（圖1：A），通過光學顯微鏡觀察，發現冰凍切片得到橡膠樹樹皮的形成層組織沒有雜質，并且絕大多數形成層區細胞呈長梭形且排列致密，幾乎沒有其他類型的細胞（圖1：B）。

利用RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（DP441）提取的形成層組織的總RNA，使用Thermo NanoDrop2 000微量紫外分光光度計測定RNA濃度和純度，發現總RNA的濃度較高，平均為1 642.98 ng·μL^-1，A260/A280的平均值為2.11，A260/A230的平均值為2.13；經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果顯示28S rRNA和18S rRNA條帶清晰，兩個條帶的亮度比值約為2∶1，說明提取的總RNA沒有降解（圖1：C）。本實驗中提取的COR不同時間段處理橡膠樹形成層組織的總RNA質量較好，可用于后續的實驗。

將8個時間點的COR處理形成層區組織總RNA進行等量混合后，利用磁珠法FastTrack^? MAG mRNA isolation Kit （Invitrogen， K158096） 對總RNA中的mRNA進行分離純化，得到的mRNA經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果顯示分化純化的mRNA呈彌散的條帶且均勻分布（圖1：D），表明分離純化得到的mRNA質量較好，可用于后續的實驗。

2.2 cDNA初級文庫和次級文庫的構建和鑒定

將COR處理橡膠樹形成層區組織的cDNA初級文庫菌液涂板并培養后（圖2：A），進行cDNA初級文庫容量、重組率和插入片段長度的鑒定。結果表明，cDNA初級文庫轉化平板的容量（平板稀釋度為1∶1 000）=317/50 μL×1 000×1 000 μL=6.34×10⁶ "CFU·mL^-1，高于文庫構建的實驗要求1×10⁶ "CFU·mL^-1；總克隆數為6.34×10⁶ CFU·mL^-1×2 mL≈1.27×10⁷，也高于文庫構建標準1×10⁷。并對cDNA初級文庫的菌斑進行檢測，隨機調取24個菌斑進行PCR鑒定，發現插入效率為100%，插入片段長度分布于0.6～1.2 kb之間，平均插入片段長度為1.1 kb（圖2：C）。

將COR處理橡膠樹形成層區組織的cDNA次級文庫菌液涂板并培養后（圖2：B），進行cDNA次級文庫容量、重組率和插入片段長度的鑒定。結果表明，cDNA次級文庫轉化平板的容量（平板稀釋度1∶1 000）=386/50 μL×1 000×1 000 μL=7.72×10⁶ CFU·mL^-1，高于文庫構建的實驗要求1×10⁶ CFU·mL^-1；總克隆數為7.72×10⁶ CFU·mL^-1×2 mL≈1.54×10⁷，也高于文庫構建標準1×10⁷。并cDNA次級文庫的菌斑進行檢測，隨機挑取24個克隆進行菌落PCR鑒定，發現插入效率為100%，插入片段長度分布于1.0～1.6 kb之間，平均插入片段長度為1.2 kb（圖2：D）。

綜上所述，本研究構建的COR處理橡膠樹萌條樹皮形成層區組織的酵母雙雜交cDNA文庫質量較好，可用于后續的HbHDA6互作蛋白的篩選和鑒定實驗。

2.3 HbHDA6誘餌質粒構建、鑒定及自激活檢測

將含有HbHDA6基因的載體進行PCR擴增，獲得了約1.7 kb的條帶（圖3：A），經過與目的基因的DNA序列進行測序比對，顯示為HbHDA6的編碼框。經過Sfi I酶切，獲得該目的基因HbHDA6的克隆片段，并與Sfi I酶切的線性化酵母雙雜交誘餌載體質粒pGBKT7載體進行連接，獲得酵母雙雜交誘餌質粒pGBKT7-HbHDA6。經過菌落PCR檢測，發現條帶大小均為1.7 kb（圖3：B），并且測序結果顯示目的基因的DNA序列比對正確，可進行后續的誘餌質粒的自激活檢測實驗。

通過自激活檢測實驗發現對照菌株在SD-TL缺陷型平板上都能正常生長，而僅有陽性對照pGADT7-LargeT/pGBKT7-p53可在SD-TLHA+X-α-Gal缺陷平板生長。然而，在含有目的基因的pGADT7+pGBKT7-HDA6轉化子中隨機挑選的6個菌落在SD-TLHA+X-α-Gal缺陷平板上均不能生長，生長狀態同陰性對照pGADT7-LargeT/pGBKT7-LaminC一樣，MEL1檢測中結果也與陰性對照相同，因此不存在自激活（圖3：C）。

將COR處理橡膠樹萌條樹皮形成層區組織的酵母雙雜交cDNA文庫質粒轉入，用含有正確pGBKT7-HDA6誘餌質粒的AH109酵母轉化子作為受體菌來制備感受態細胞，從中取20 μL酵母培養物經梯度稀釋后，分別涂3塊SD-TL平板來檢測文庫轉化效率（圖3：D）。對平板的菌斑進行計數，結果顯示HbHDA6基因篩選文庫的轉化子總數為 （3 978/20+2 038/2+286/0.2）×1/3×8 000≈7.06×10⁶，轉化效率為7.06×10⁶/25·μg^-1≈2.82×10⁵·μg^-1。

HIS3、ADE2和MEL1報告基因的檢測結果顯示，陽性對照在SD-TL+X-α-Gal和SD-TLHA缺陷型培養基上都能正常生長，并使菌落呈藍色，而陰性對照由于不會激活HIS3和ADE2報告基因，在SD-TL缺陷型培養基上可以正常生長但菌落不顯藍色，而在缺少Histidine和Adenine這兩種成分的SD-TLHA培養基平板上不能生長。因此，本文獲得的24個初始陽性克隆，能在SD-TLHA生長并使菌落顯藍色，表明同時都激活了HIS3、ADE2和MEL1報告基因（圖3：E）。A和B分別為HbHDA6的PCR擴增和連接誘餌質粒后的電泳圖；C為HbHDA6誘餌質粒自激活檢測結果；D為HbHDA6基因篩選的文庫轉化效率分析圖；E為酵母文庫篩選得到的陽性克隆檢測圖。

2.4 陽性克隆鑒定和互作蛋白分析

為了鑒定pGBKT7-HDA6誘餌質粒篩選到的陽性克隆基因信息，將以上陽性克隆菌株分別接入SD-TL液體培養基中振蕩培養過夜并提取純化酵母質粒，再將抽提得到的酵母質粒轉化到大腸桿菌Top10新鮮感受態細胞中進行擴增，將含有陽性克隆的Top10轉化子轉接LB液體培養基中擴增后抽提大腸桿菌質粒，進行DNA測序分析，并與NCBI_GenBank數據庫中的序列進行BLAST比對分析。BLAST比對結果（表2）顯示，篩選到與HbHDA6基因相互作用的陽性克隆質粒DNA，去除重復外，分別屬于22種蛋白編碼基因。

根據UniProt的蛋白信息預測，可將與HbHDA6互作的22種蛋白分為氧化還原酶、水解酶、蛋白/DNA/RNA結合、運輸、異構酶、染色質調節劑和糖蛋白7個類別，其中水解酶、氧化還原酶、蛋白/DNA/RNA結合3個類別的蛋白較多。根據亞細胞定位的結果顯示這22種蛋白在細胞各個部位都有分布，其中亞細胞定位在細胞膜、葉綠體、線粒體和細胞核4個類別的蛋白相對較多。

3 討論與結論

從動植物組織或細胞中提取的總RNA和純化的mRNA是構建酵母雙雜交cDNA文庫的起始材料，能夠獲得高質量的總RNA和mRNA是構建高質量酵母雙雜交cDNA文庫的前提（Gao et al.， 2014）。本研究中的橡膠樹樹皮的維管形成層組織是夾在韌皮部和木質部之間，為幾層至十幾層形成層紡錘狀細胞組成且排列精密，較難獲取到完整且純凈的形成層組織。前期研究中，我們發現橡膠樹萌條形成層細胞層數有明顯規律，在海南島每年春季新梢生長期（3—4月），樹干的形成層區開始分裂分化活動，此時形成層的細胞層數最少（約4層）（Wu et al.， 2002），而7—8月正值高溫高濕環境，利于橡膠樹萌條生長和維管形成層細胞分裂活動，此時形成層的細胞層數量多（10～11層）（張世鑫等，2011）。本文在7—8月時，采集萌條EU3的節間樹皮樣品，此時的形成層細胞量多且EU3的次生韌皮部未分化出次生乳管，能夠獲得量多且純凈的形成層區組織。使用冰凍切片弦切獲取形成層區組織，光學鏡檢發現冰凍切片得到橡膠樹樹皮的形成層區組織沒有雜質，絕大多數形成層區細胞呈長梭形且排列緊密。因此，從有限的組織材料中，也能提取出含量較高、質量較好總RNA。后續使用成熟的磁珠法技術分離純化mRNA，獲得的mRNA捕獲率和成功率都很高（Albretsrn et al.， 1990），保證了后續構建酵母雙雜交cDNA文庫研究所需的高質量總RNA和mRNA。使用mRNA反轉錄合成cDNA，在均一化前后都進行一輪LD-PCR，這樣通過兩輪的LD-PCR放大，不但能夠保證在起始總RNA較少的情況下純化收集到足夠量的cDNA用于文庫構建，而且能夠使低豐度的基因得到增加，相應地提高了篩庫篩到低豐度基因的概率（楊子平等，2013；余海洋等，2016）。

對酵母雙雜交cDNA文庫質量評判主要從3個重要的數據來分析，分別為酵母雙雜交文庫的單克隆數、重組率和插入片段長度。酵母雙雜交文庫的單克隆數代表了構建的cDNA文庫完整性和覆蓋度，插入片段的長度代表了cDNA文庫包含基因的完整性（Van amp; Beyaert， 1996）。cDNA文庫的單克隆是保證cDNA文庫完整性和覆蓋度的一個重要指標，文庫單克隆數大于1×10⁶ 是文庫篩選所必須的（李可琪等，2016）。一方面，本文中利用Gateway^TM技術構建了茉莉酸誘導橡膠樹次生乳管分化形成層組織的均一化酵母雙雜交cDNA文庫，初級文庫容量為6.34×10⁶ CFU·mL^-1，總單克隆數為1.27×10⁷，次級文庫的容量為7.72×10⁶ CFU·mL^-1，總單克隆數為1.54×10⁷，文庫重組率均為100％，這些數值均要高于酵母雙雜交cDNA文庫構建的基本要求。另一方面，構建的酵母雙雜交cDNA初級文庫和次級文庫的插入片段平均長度分別為1.1 kb和1.2 kb，這個數值是接近于本文使用的橡膠樹熱研7-33-97基因組序列中公布的CDS平均長度（Tang et al.， 2016）。由此可見，本文構建的COR處理橡膠樹萌條樹皮形成層組織的酵母雙雜交文庫的單克隆數、重組率和插入片段長度均達到較高水平，滿足酵母雙雜交文庫篩選的工作。

前期研究中，本團隊最早發現外施茉莉酸（JA）及其前體亞麻酸（LA）能誘導形成層細胞分化次生乳管（Hao amp; Wu， 2000；Tian et al.， 2003），與茉莉酸的活性形式JA-Ile結構相似的COR可以與COI1受體結合，激活JA信號途徑（Katsir et al.， 2008），其誘導橡膠樹乳管分化的效應比MeJA更好（張世鑫等，2011）。據此，我們建立了一種穩定的COR誘導橡膠樹萌條次生乳管分化的實驗系統，在COR處理后的5 d內可以觀察到誘導形成的次生乳管（Zhang amp; Tian， 2015；Zhang et al.， 2015， 2016；Wu et al.， 2016， 2023；張世鑫等，2018）。近期我們發現組蛋白去乙?；福℉DA）的抑制劑——曲古抑菌素A（TSA）不但能夠誘導橡膠樹次生乳管分化（Zhang et al.， 2016），而且COR處理能夠顯著提高形成層區的組蛋白乙?；潭群虷DA活性，尤其是HDA6的含量和基因表達都受COR的影響（未發表資料）?；谶@些工作基礎以及組蛋白乙?；揎椬鳛榛虮磉_調控的重要方式，本文構建了COR處理橡膠樹萌條樹皮形成層組織的酵母雙雜交文庫，并通過HbHDA6誘餌載體進行酵母雙雜交文庫篩選，共篩選到與HbHDA6基因相互作用的22種蛋白。根據UniProt的蛋白信息預測，這些蛋白可分為氧化還原酶、水解酶、蛋白/DNA/RNA結合、運輸、異構酶、染色質調節劑和糖蛋白7個類別，其中水解酶、氧化還原酶、蛋白/DNA/RNA結合3種類別的蛋白較多。亞細胞定位結果，顯示主要集中在細胞膜、葉綠體、線粒體和細胞核等。下一步，我們將對HbHDA6與這22個互作蛋白進行點對點酵母雙雜交驗證，解析這些蛋白的相互作用，為后續篩選組蛋白乙?；揎椪{控橡膠樹次生乳管分化的靶標蛋白奠定基礎，為構建橡膠樹次生乳管分化的分子調控網絡提供理論依據。

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（責任編輯 周翠鳴）