繡球‘杜麗’AP3基因克隆與基因編輯載體構建

摘 要：繡球 （Hydrangea macrophylla） 是以花序為主要觀賞部位的園林植物，多用作切花裝飾和景觀營造，在亞洲、美洲、歐洲廣泛栽培。為探究AP3基因在繡球花萼形成過程中的功能，加快重瓣繡球新品種培育進程，該研究以繡球‘杜麗’為材料，克隆其MADS-box B類基因HmAP3，并結合生物信息學方法預測基因功能；根據HmAP3序列信息，篩選出高特異性編輯靶點并構建CRISPR/Cas9基因編輯載體，通過農桿菌轉化法將載體整合到繡球基因組中。結果表明：（1） 克隆到1段HmAP3基因的cDNA序列，其序列全長546 bp，共編碼181個氨基酸，測序結果表明其氨基酸序列與參考序列一致性為100%，與擬南芥AtAP3相似度為58.8%。（2）不同屬植物AP3氨基酸序列差異較大，在同屬不同物種中，AP3蛋白主要結構較為保守，僅在少數基序上存在差異。（3）在HmAP3中共鑒定到2個高特異性靶點，并成功構建2個單靶點CRISPR/Cas9基因編輯載體。（4）該研究共獲得5株基因組內含有Cas9序列的抗性芽，但其靶點均未突變，在抗性芽中沒有檢測到Cas9表達。該研究探討了AP3基因在重瓣繡球育種中的價值，對繡球的CRISPR/Cas9基因編輯技術進行了初探，為繡球優良品種繁育工作奠定了基礎。

關鍵詞：繡球， MADS-box家族， AP3， CRISPR/Cas9， 載體構建

中圖分類號：Q943 文獻標識碼：A 文章編號：1000-3142（2024）02-0257-10

基金項目：國家林業和草原局引進國際先進林業科學技術項目（2015-4-15）。

第一作者：李童（1997-），碩士，主要從事花卉物種質資源創新與育種研究，（E-mail）13051865858@163.com。

^*通信作者：趙惠恩，博士，教授，研究方向為花卉種質資源創新與育種，（E-mail）zhaohuien@bjfu.edu.cn。

AP3 gene cloning and gene-editing vector construction of Hydrangea macrophylla ‘Dooley’

LI Tong， WANG Yueying， ZHAO Huien^*

（ Beijing Key Laboratory of Ornamental Plants Germplasm Innovation amp; Molecular Breeding， Key Laboratory of Genetics and Breeding in Forest Trees and Ornamental Plants of Ministry of Education， National Engineering Research Center for Floriculture， Beijing Laboratory of Urban and Rural Ecological Environment， College of Landscape Architecture， Beijing Forestry University， Beijing 100083， China ）

Abstract： Hydrangea macrophylla is a garden plant widely cultivated in Asia， America， and Europe with its inflorescence as main ornamental feature. It is commonly used in interior decoration and landscape creation. To investigate the role of AP3 gene in hydrangea during calyx formation， H. macrophylla ‘Dooley’ was used as the material. The MADS-box Class B gene HmAP3 was cloned， and its gene function was predicted by bioinformatics analysis. To explore methods for quicker breeding new varieties， highly-specific editing targets were screened and CRISPR/Cas9 gene-editing vectors were constructed. The vector sequence was integrated into the H. macrophylla genome by agrobacterium-mediated transformation. The results were as follows： （1） The cDNA sequence full length of HmAP3 was 546 bp， encoding 181 amino acids. Its amino acid sequence was 100% similar to the reference sequence and 58.8% similar to Arabidopsis thaliana. （2） AP3 differed greatly in different genera. Within the same genus， the main structure of AP3 protein was conserved and differed only in a few motifs. （3） There were two highly specific targets in HmAP3. Sequencing results indicated that two single-target CRISPR/Cas9 gene-editing vectors were constructed successfully. （4） There were five resistant buds with Cas9 sequences in their genomes. However， their target sequences did not change due to the absence of Cas9 expression. In this study， the potential of AP3 gene in the breeding work of double flower phenotype was investigated， and a preliminary exploration of CRISPR/Cas9 gene-editing technology for Hydrangea macrophylla was conducted. These results provide a basis for the breeding of H. macrophylla.

Key words： Hydrangea macrophylla， MADS-box family， AP3， CRISPR/Cas9， vector construction

繡球 （Hydrangea macrophylla），虎耳草科繡球屬，又名八仙花，在庭院景觀中的應用歷史悠久，是一種具有較高觀賞價值的園林植物，作為世界流行的切花深受大眾喜愛。目前繡球主要有蕾絲帽形和圓球形兩類花序，其花序中的不育花具有大而艷麗的花瓣狀萼片，是繡球的主要觀賞組織。繡球不育花有單瓣和重瓣之分，其中單瓣類只有一輪觀賞性萼片，重瓣類則具有多輪觀賞性萼片。相比之下，重瓣繡球具有更高的觀賞和經濟價值，是繡球新品種培育的重要方向 （Suyama et al.， 2015）。目前，國內外的繡球育種方式以雜交育種為主，其育種效率低、周期長，難以適應日益增長的市場需求 （Wu et al.， 2021），需要探索更快捷、高效的育種方式。

CRISPR/Cas9技術是一種新興的基因編輯技術，能夠定向改變植物的觀賞性狀，如改造花型和花色，延長觀賞周期等，在園林植物新品種繁育工作中具有極大的發展潛力和經濟價值 （Kaur et al.， 2021）。CRISPR/Cas9基因編輯系統由Cas9核酸酶和單引導RNA （single guide RNA， sgRNA） 構成 （Jinek et al.， 2012），二者在植物細胞內轉錄后形成復合體，識別植物基因組中的間區序列鄰近基序 （protospacer adjacent motif， PAM） 前端約20 nt 核苷酸序列并結合，Cas9核酸酶切割該序列形成DNA雙鏈缺口（DNA double-strand breaks， DSBs），引發植物自身損傷修復機制，產生隨機的堿基缺失 （Hsu et al.， 2013）。與其他園藝作物相比，CRISPR/Cas9技術在園林植物中的應用較少，僅應用于毛白楊 （Fan et al.， 2015）、矮牽牛 （Zhang et al.， 2016; Sun amp; Kao， 2018; Xu et al.， 2020; Yu et al.， 2021）、菊花 （Kishi-Kaboshi et al.， 2017）、鐵皮石斛 （Kui et al.， 2017）、百合 （Yan et al.， 2019）、牽牛花 （Shibuya et al.， 2018; Watanabe et al.， 2018）、藍豬耳 （Nishihara et al.， 2018）與蝴蝶蘭 （Tong et al.， 2020; Semiarti et al.， 2020） 。

花器官由花瓣、花萼、雄蕊和心皮4個部分組成，其基因表達調控機制可以用ABCDE模型來解釋。在ABCDE模型中，B類基因主要負責與A類基因共同調控花瓣的形成，以及與C類基因共同調控雄蕊的形成 （Coen amp; Meyerowitz， 1991）；除A類基因中的AP2屬于AP2/ERF家族外，該模型中的其余基因均屬于MADS-box基因家族 （王瑩等， 2021）。MADS-box B類基因亞家族成員廣泛存在于現存植物的基因組中，在裸子植物小孢子葉球與被子植物花瓣和雄蕊中均有表達，在植物發育過程中具有重要地位 （Albert et al.， 1998）。B類基因包含APETALA3 （AP3） 和PITILLATA （PI） 兩個譜系，其中AP3譜系主要調控花瓣和花萼的形成 （Jaramillo amp; Kramer， 2004）。AP3蛋白中含有保守的K-BOX結構域，該結構域能夠引導AP3蛋白與PI、SEP3、AP1蛋白形成四聚體，誘導花瓣原基形成 （Melzer amp; Theien， 2009; Theien et al.， 2016）。在觀賞植物中，已經發現AP3基因沉默能夠導致矮牽牛 （van der Krol， 1993）、蘭花 （Mondragón-Palomino amp; Theien， 2009）與耬斗菜 （Zhang et al.， 2013）等發生從花瓣向花萼的同源異型轉變。

因此，本研究對繡球‘杜麗’的MADS-box B 類基因HmAP3進行了克隆和生物信息學分析；同時結合組內前期繡球‘杜麗’再生體系建立基礎，借助CRISPR/Cas9基因編輯系統，構建了2個HmAP3單靶點載體，轉化獲得抗性芽，擬探討以下問題：（1） HmAP3氨基酸序列保守結構域特征與蛋白結構分析；（2） HmAP3系統進化關系及其生物學功能預測；（3） 探究影響繡球CRISPR/Cas9基因編輯工作成功率的因素。以期為繡球的性狀改良和新品種繁育工作提供實踐參考和技術支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料和試劑

繡球‘杜麗’種植于北京植物園 （116° 28′ E、40°00′ N）。于4月選取翠綠、無病蟲害的葉片作為試驗材料，將葉片與葉柄一并剪下，放入干凈的蒸餾水中轉移至實驗室。

試驗所用的試劑盒包括植物總RNA提取試劑盒 ［天根生化科技（北京）有限公司，DP432］，cDNA反轉錄試劑盒 （TaKaRa，RR047A），DNA凝膠回收試劑盒 （北京擎科生物科技股份有限公司，GE0101），One step ZTOPO-Blunt/TA零背景快速克隆試劑盒 （北京莊盟生物科技有限公司，ZC206），SE無縫克隆和組裝試劑盒 （北京莊盟生物科技有限公司，ZC231），限制性內切酶Bsa I ［紐英倫生物技術（北京）有限公司］。

1.2 繡球‘杜麗’HmAP3基因克隆

依據在NCBI 上查找到的繡球‘Blue Sky’ （H. macrophylla ‘Blue Sky’） AP3基因 （GenBank： AF230702.1） 的CDS序列進行引物設計 （表1） 并合成高特異性引物。

按照試劑盒說明書提取試驗材料RNA，并將RNA反轉錄成cDNA。以cDNA為模板，用KOD One高保真DNA聚合酶 （TOYOBO，KMM-101），以HmAP3-F1/R1為引物 （表1） 進行PCR擴增。擴增產物利用瓊脂糖凝膠電泳進行純化，將目的片段所處區域凝膠切割下來，按照DNA凝膠回收試劑盒說明書回收。純化后的PCR產物連接T載體后轉入DH5α大腸桿菌感受態涂布平板培養12 h，選取單菌落送至測序公司 （北京擎科生物科技股份有限公司） 進行質粒提取和測序工作，獲得HmAP3基因的CDS序列。

1.3 繡球‘杜麗’HmAP3基因生物信息學分析

使用Cell-PLoc （http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/） 對HmAP3進行亞細胞定位預測 （Chou amp; Shen， 2010）。利用NCBI-BLAST （https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi） 比對HmAP3氨基酸序列相似性，下載比對結果中排名在前列的其他植物AP3氨基酸序列，同時下載擬南芥AtAP3氨基酸序列，通過MEGA-X軟件的鄰接法 （neighbor-joining method， NJ） 構建系統進化樹 （Zhang et al.， 2019）。利用MEME （http：//meme-suite.org/tools/meme/） 預測HmAP3氨基酸序列保守基序。通過ProrParam （https：//web.expasy.org/protparam/） 分析HmAP3蛋白的理化性質 （Li et al.， 2020）。分別使用蛋白二級結構預測工具SOPMA （https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html/）和蛋白三級結構預測工具Swiss model （https：//swissmodel.expasy.org/） 對HmAP3氨基酸序列進行分析。

1.4 CRISPR/Cas9基因編輯載體構建和轉化

使用CRISPR靶點設計網站CRISPRdirect" （http：//crispr.dbcls.jp/） 根據HmAP3基因的CDS序列，選擇PAM位點和GC含量在40%～60% 之間的高特異性靶點。以pCAMBIA1300-sgRNA/Cas9載體質粒為模板，以HmAP3-F2/R2、HmAP3-F3/R3為引物 （表1），進行PCR擴增獲得帶有黏性末端的目的片段。使用內切酶Bsa Ⅰ酶切獲得pCAMBIA1300-sgRNA/Cas9 線性載體，用無縫克隆試劑盒 （北京莊盟生物科技有限公司， ZC231） 連接載體和目的片段，獲得重組質粒。構建好的質粒轉入DH5α大腸桿菌感受態涂布平板培養12 h，選取單菌落送至測序公司 （北京擎科生物科技股份有限公司） 進行質粒提取和測序工作，回收構建成功的載體質粒。將構建好的載體pCAMBIA1300：：HmAP3利用凍融法轉入GV3101農桿菌感受態中，在2抗LB培養基 （50 mg·L^-1 卡那霉素+50 mg·L^-1 利福平） 中28℃培養2 d，挑取單菌落在LB液體培養基擴繁。離心收集擴繁的農桿菌菌體，加入適量侵染液 （MS+30 g·L^-1 蔗糖+200 μmol·L^-1 乙酰丁香酮） 調至OD₆₀₀=0.4。

將繡球‘杜麗’葉片剪切成1 cm×1 cm的小塊，在葉背劃3～4刀，放入上述配制好的侵染液中浸泡侵染10 min，轉接到共培養培養基 （MS+2.0 mg·L^-1 6-BA+0.1 mg·L^-1 IBA） 上暗培養2 d，再轉移到篩選培養基 （MS+2.0 mg·L^-1 6-BA+0.1 mg·L^-1 IBA+2 mg·L^-1 潮霉素+200 mg·L^-1 頭孢霉素） 中至獲得抗性再生芽。

1.5 抗性芽檢測和鑒定

取抗性芽葉片，使用基因組提取試劑盒獲取葉片DNA，再依次使用總RNA提取試劑盒、cDNA反轉錄試劑盒獲取葉片cDNA。分別以葉片DNA和cDNA為模板，以Cas9-F/R為引物擴增Cas9序列，擴增片段長度為764 bp。以葉片DNA為模板，以HmAP3-F1/R1為引物擴增抗性芽HmAP3序列，擴增產物送至測序公司 （北京擎科生物科技股份有限公司） 測序。使用DNAMAN比對測序結果與野生型序列差異。

2 結果與分析

2.1 繡球‘杜麗’AP3基因克隆與序列分析

參考繡球‘Blue Sky’ AP3基因CDS序列，利用HmAP3-F1/HmAP3-R1引物 （表1），在繡球‘杜麗’cDNA文庫中克隆到了一段完全一致的核苷酸序列。克隆到的基因序列全長546 bp，共編碼181個氨基酸，利用NCBI分析其氨基酸序列，發現在30～123 bp處包含1個K-BOX保守結構域 （圖1）。該氨基酸序列C端含有PI基序和euAP3基序，符合MADS-box家族特征，命名為HmAP3。將HmAP3與擬南芥AtAP3氨基酸序列比對，其相似度為58.8%；HmAP3與繡球‘Blue Sky’ AP3 的DNA序列相似度為100%。因此，推測該基因為繡球‘杜麗’AP3基因。亞細胞定位預測結果顯示HmAP3在細胞核中表達。

2.2 繡球‘杜麗’AP3蛋白理化性質與結構分析

以擬南芥MADS-box類蛋白三級結構為模型，預測HmAP3蛋白三級結構，可見該結構中含有2條長α-螺旋，螺旋間紐結為90°；其預測結果GMQE （全球模型質量估計） 值為0.32，QMEAN得分為0.74±0.05，模型可信度和質量較高（圖2）。繡球‘杜麗’的HmAP3蛋白分子式為C₉₂₇H₁₄₆₂N₂₆₈O₂₈₇S₇，分子量為21 177.85 D。該蛋白共包含181個氨基酸，不穩定系數為38.79，屬穩定蛋白。蛋白帶負電荷殘基總數 （Asp+Glu）為28，帶正電荷殘基總數（Arg+Lys）為25，理論等電點為6.17。蛋白脂肪指數為79.12，親水性 （GRAVY）為-0.791，為親水性蛋白。HmAP3蛋白二級結構中α-螺旋占比最高，為64.09%；其他結構占比由高到低依次為無規則卷曲 （22.65%）、延伸鏈（8.84%）、β-折疊（4.42%） （圖3）。

2.3 繡球‘杜麗’AP3蛋白系統進化與motif分析

將HmAP3氨基酸序列提交到NCBI進行BLAST比對，在比對結果中選取下載與該序列相似度較高的其他植物AP3氨基酸序列，在MEGA-X軟件上用鄰接法構建系統進化樹 （圖4）。從整體上來看，繡球等薔薇亞綱菊超目植物被聚為同一大支，說明AP3蛋白在系統進化過程中具有一定保守性。從各小分支來看，不同物種間的AP3序列存在一定差異，而同物種間的序列相似度則較高。相對而言，繡球與神秘果 （Synsepalum dulcificum）、灑金桃葉珊瑚 （Aucuba japonica var. borealis） 和歐洲枸骨 （Ilex aquifolium） 親緣關系最近。在模式植物中，繡球與煙草 （Nicotiana tabacum） 的親緣關系比擬南芥 （Arabidopsis thaliana） 更近。因此，使用煙草基因組作為預測繡球基因編輯靶點的參考基因組更為適宜。

在MEME-motif suite工具上對上述氨基酸序列進行分析后，獲得了15個motif及其在序列中的相對位置 （圖4）。大部分植物AP3序列包含7個motif，其中有8個AP3序列包含8個motif，1個AP3序列包含9個motif。所有AP3序列C端較為保守，均含有motif 2、motif 4、motif 5、motif 6和motif 7，而N端多含motif 3。與其他植物相比，繡球AP3序列中含有特有的motif 12，此外僅灑金桃葉珊瑚AP3序列中含有這一基序，說明HmAP3相對其他植物AP3蛋白可能會有更多功能。對同源基因來說，其序列的motif大體相似，然而在不同物種間仍存在一定的差異，這些差異導致了不同物種間同源基因的功能差異。

2.4 CRISPR/Cas9基因編輯載體構建

利用CRISPRdirect在HmAP3上共選取到2個特異性強的靶點，分別命名為HmAP3-Taget1 （5′- GATCTGTACCAGACGACAAT+GGG-3′） 和HmAP3-Taget2 （5′- TGAACGAAAGTATCGAGTAC+CGG-3′），其GC含量分別為45 %和40 %，其與PAM位點相鄰的12 bp在參考基因組 （煙草） 中均僅比對到1個位點，證明該靶點具有較強特異性。用引物HmAP3-F2/R2、HmAP3-F3/R3在質粒上擴增含有黏性末端的目的片段，與線性載體連接，用大腸桿菌轉化后挑取單菌落測序，測序結果表明目的片段已成功插入載體，插入片段與載體結構如圖5所示。繡球對潮霉素敏感性很高，經2 mg·L^-1潮霉素篩選后，在侵染約2 000枚葉片后僅培育出9株抗性芽（圖6：A）。以抗性芽葉片DNA為模板，分別使用靶基因序列擴增引物HmAP3-F1/HmAP3-R1和Cas9序列擴增引物Cas9-F/Cas9-R對抗性芽進行鑒定。擴增和測序結果表明，9株抗性芽葉片基因組中有5株可克隆到Cas9序列，但其靶點序列均未發生突變 （圖6：B）。提取抗性芽葉片總RNA后反轉錄獲得cDNA，再次克隆Cas9序列，發現所有樣品均無法擴增出條帶。該現象說明雖然載體序列已成功整合到載體基因組上，但是Cas9蛋白并未成功轉錄和表達，因此，編輯靶點的序列沒有改變。

3 討論與結論

本研究克隆了繡球‘杜麗’的HmAP3基因，并對其核苷酸序列與氨基酸序列進行了生物信息學分析。研究發現HmAP3與模式植物擬南芥 （Yang et al.， 2003） 及園藝作物綠竹 （朱龍飛，2013）、葡萄 （胡曉燕等，2021）、菠蘿 （鄭雪文等，2021） 在特有的K-BOX結構域上長度相近、結構相似，表明此結構域在不同物種的AP3中高度保守。理化性質分析結果表明HmAP3是穩定的親水性蛋白，與鄭雪文等 （2021）的研究結果一致。在HmAP3蛋白三級結構模型中，K-BOX形成長α-螺旋結構，與植物MADS-box家族中K-BOX結構域特征一致，該結構在AP3與其他蛋白結合形成四聚體的過程中發揮關鍵作用 （Yang amp; Jack， 2004）。

HmAP3蛋白系統進化樹表明AP3基因在植物系統進化過程中的保守性，其中繡球與金魚草、煙草和番茄AP3基因聚類在同一大分支，親緣關系較近，與Viaene等 （2009） 研究結果相似。Martino等 （2006） 和Liu等 （2004） 研究發現，番茄SlAP3與煙草NtAP3基因沉默后代表現出花萼輪數增多、花瓣消失的性狀。通過同源比對，推測繡球‘杜麗’HmAP3基因與其同源基因SlAP3、NtAP3功能相似，可能負責調控繡球花器官中花萼和花瓣的形成。

本研究構建了2個繡球HmAP3單靶點載體，并在轉化獲得的抗性芽基因組中檢測到載體序列，但在抗性芽中未檢測到Cas9序列的表達和編輯位點序列突變。本研究與Ren等 （2013）的研究結果相似，他推測基因編輯效率與啟動子活性有關，當CRISPR/Cas9基因編輯載體中的啟動子從nos-mini變為U6b啟動子時，遺傳突變率可從0提高至3.2%。在觀賞植物中，Kishi-Kaboshi等 （2019） 的研究也佐證了這一觀點，系統性比較了Ubiqutin、CaMV 35S和CmActin2啟動子的表達活性差異后，發現 CaMV 35S和Ubiqutin啟動子在菊花愈傷組織中活性均低于菊花CmActin2啟動子。本研究使用的Cas9序列啟動子為Ubiqutin啟動子，猜想其在繡球組織中的表達活性極低，導致Cas9序列在抗性芽中未表達。在下一步繡球基因編輯工作中，可將載體中啟動子更換為繡球本源啟動子，進一步探究啟動子活性對基因編輯成功率的影響。

本研究發現繡球對潮霉素的高敏感性也是影響CRISPR/Cas9基因編輯效率的重要因素。本研究使用2 mg·L^-1潮霉素濃度對繡球抗性芽進行篩選，再生率僅為0.45%，與蘋果 （賈東杰等，2013） 等在潮霉素篩選下的再生情況相符，推測繡球野生型基因組內不含有潮霉素抗性基因。甘煌燦等 （2018） 提出可通過在再生篩選過程中逐漸增加潮霉素濃度的方法，提高抗性芽的成活率。后續的繡球抗性芽的篩選條件可通過調整不同再生階藍色表示α-螺旋，紫色表示無規則卷曲，綠色表示β-折疊，紅色表示延伸鏈。段潮霉素濃度的方式來進一步優化，以提高基因編輯效率。

本研究在繡球‘杜麗’中克隆到1個HmAP3基因，cDNA序列全長546 bp，共編碼181個氨基酸，為穩定的親水性蛋白，氨基酸序列結構分析證明其具有MADS-box B 類基因亞家族特征，系統進化分析表明HmAP3與煙草、番茄、金魚草親緣關系較近，基序組成結構保守；以HmAP3為靶點，成功構建2個以Cas9基因、sgRNA、潮霉素抗性基因為骨架的CRISPR/Cas9基因編輯載體，并將載體序列整合到繡球基因組中。上述研究結果為進一步研究HmAP3基因功能奠定了理論基礎，為重瓣繡球基因編輯輔助育種工作提供技術支撐。

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（責任編輯 周翠鳴）