三個玫瑰品種花色物質的代謝組學分析

摘 要：玫瑰（Rosa rugosa）具有很高的觀賞價值和商業價值，但其花色比較單一，限制了玫瑰的開發利用及其在園林造景中的應用。為了探究‘苦水玫瑰’‘墨紅玫瑰’和‘保加利亞白玫瑰’3個不同品種玫瑰的呈色物質，該研究利用超高效液相色譜-四級桿-飛行時間質譜（UPLC-Q-TOF-MS）聯用檢測花瓣類黃酮的種類和含量，通過KEGG數據庫對差異代謝物進行富集分析，篩選出關鍵代謝物，并分析與花色表型值的相關性。結果表明：（1）在3個不同色系玫瑰花瓣中共檢測到58種代謝物，其中花青素只有一種為矢車菊-3-O葡萄糖苷，約占30.45%。（2）K-means聚類分析表明，共有12種關鍵代謝物注釋到KEGG代謝通路中，其中喬松素和楊梅黃酮是決定‘苦水玫瑰’和‘墨紅玫瑰’花色呈紅色的主要物質，圣草酚、木犀草素和山萘酚是決定‘保加利亞白玫瑰’花色呈白色的主要物質。該研究結果可為具有特定顏色玫瑰的育種提供理論依據，并促進玫瑰在園林綠化中的應用。

關鍵詞：玫瑰品種，花色物質，代謝組學，UPLC-Q-TOF-MS，相關性

中圖分類號：Q946 文獻標識碼：A 文章編號：1000-3142（2024）02-0281-10

zhongpf@gsau.edu.cn。Metabolomics analysis of flower color substances in three Rosa rugosa cultivars

WEI Liqin， CHONG Peifang^*， BAO Xinguang， HE Hailing， LI Qingqing

（ College of Forestry， Gansu Agricultural University， Lanzhou 730070， China ）

Abstract： Rosa rugosa is a deciduous shrub belonging to Rosa L. in" Rosaceae. It has a high ornamental value and commercial value， but its single color limits the development and utilization of rose and its application in landscape architecture. In order to explore the coloring substances of three different varieties of roses， ‘Rosa rugosa×Rosa sertata’， ‘Rosa Crimson Glory’ and ‘Rosa alba’， this study used ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole-time-of-flight mass spectrometry （UPLC-Q-TOF-MS） to detect the types and contents of flavonoids in petals. The KEGG database was used to enrich the differential metabolites， screen out the key metabolites， and analyze the correlation with the phenotypic value of flower color. The results were as follows： （1） A total of 58 metabolites were detected in the petals of three different color rose varieties， of which only one anthocyanin was cyanidin-3-O-glucoside， accounting for 30.45%. （2） K-means clustering analysis showed that a total of 12 key metabolites were annotated to the KEGG metabolic pathway. Among them， pinocembrin and myricetin were the main substances that determined the red color of ‘Rosa rugosa×Rosa sertata’ and ‘Rosa Crimson Glory’， and eriodictyol， luteolin and kaempferol were the main substances that determined the white color of ‘Rosa alba’. In conclusion， this study can provide a theoretical basis for the breeding of roses with specific colors and promote the application of roses in landscaping.

Key words： Rosa rugosa cultivars， flower color substances， metabolomics， UPLC-Q-TOF-MS， correlation

花色是園林植物的重要特征，決定著觀賞植物的觀賞價值和商業價值（黃沙沙，2017）。近年來，有學者研究發現，影響花色形成的主要因素是植物色素的種類和含量。植物色素的種類主要有三大類，即類黃酮（flavonoids）、類胡蘿卜素（carotenoids）和生物堿類（alkaloids）（李秋琳等，2021；趙君等，2021），其中類黃酮次生代謝產物的積累是影響花色形成的重要因素。花色苷是一種在植物中以糖苷形式出現的花青素，它是花瓣中紅色、藍色、紫色等顏色的主要成分，查爾酮是黃色花朵中一種重要的顏色成分，但黃酮、黃酮醇通常都是無色或淡白色（周琳等，2009；林啟芳等，2021）。對杜鵑花科植物的研究發現，花色取決于類黃酮物質的種類，其中花色苷對花色起關鍵作用，而黃酮醇只起到輔助呈色的作用（王禹等，2020；張卉等，2022）。近年來，隨著植物代謝組技術的發展和應用，許多觀賞植物的呈色機理得到了初步研究，如山茶（Camellia japonica）、山櫻花（Prunus serrulata）、櫻桃（P. pseudocerasus）（Guo et al.，2018）、向日葵（Helianthus annuus）（趙君等，2021）等。施蕊等（2020）利用代謝組學闡明，不同代謝產物及其代謝途徑調節了‘滇紅玫瑰’和‘墨紅玫瑰’顏色的差異。綜上可見，關于觀賞植物花色的研究還在不斷進行中，但大多數研究認為植物色素的種類、含量和代謝合成途徑是影響植物花色多樣的重要因素（Fu et al.，2021；魏麗琴等，2023）。

玫瑰（Rosa rugosa）是薔薇科（Rosaceae）薔薇屬（Rosa L.）落葉灌木，原產于中國，具有悠久的栽培歷史，是兼具觀賞、經濟、生態和食用功能的植物，擁有“花中皇后”和“愛情之花”的美譽，被列為我國二級保護植物（張玲等，2015）。我國栽培的玫瑰品種極為豐富，據不完全統計，有重瓣、單瓣、復瓣、切花等各種類型的玫瑰品種。包括甘肅的‘苦水玫瑰’（‘Rosa rugosa×Rosa sertata’），為中國傳統玫瑰與鈍齒薔薇的自然雜交種，具有花小而多、紫紅色、有芳香、出油率高的特點，是重要的食用重瓣玫瑰（Wu et al.，2020）；‘墨紅玫瑰’（‘Rosa Crimson Glory’），又稱‘朱墨雙輝’，是雜種‘香水月季’（‘Rosahvbrida Hvbird Tea Rosa’）和雜種‘長春月季’（‘Hybrid Perpetual Rosa’）的雜交種，花朵為深紅色，具有花期長、香味濃郁、產量高等特點，作為云南食用玫瑰的主要品種而被廣泛種植（寧忻等，2021）；‘保加利亞玫瑰’（‘Rosa alba’），又稱 ‘突厥玫瑰’，花朵為淡粉色、粉紅色和白色，具有產量高、品質好、含油量高等特點，是一種可以提取玫瑰精油和加工玫瑰純露的優質食用玫瑰品種（趙偉巍，2017）。但玫瑰作為一種重要的園林觀賞植物，其花色主要為紅色、粉色、白色、紫色，少見其他花色，這極大地限制了玫瑰在園林綠化中的應用（Cheng et al.，2021）。目前，國內外學者對玫瑰的研究主要集中在揮發性油的提取和利用、玫瑰資源的開發和保護、玫瑰遺傳多樣性的分析和分子標記、玫瑰相關食品的生產、玫瑰的轉基因調控花色技術、玫瑰栽培和繁殖技術等方面（鄒凱，2018）。雖然已經有關于玫瑰花色轉基因調控技術的報道，并取得了一定的研究成果，但是對于食用玫瑰花色的形成以及花色素組成成分的研究仍然不夠完善，并且對玫瑰花呈色的物質基礎還缺乏系統梳理，這將阻礙玫瑰花色素的開發利用及其在園林綠化中的應用（徐宗大等，2011；楊志瑩等，2011）。

本研究主要以‘苦水玫瑰’‘墨紅玫瑰’和‘保加利亞白玫瑰’3個不同花色的食用重瓣玫瑰為對象，通過靶向代謝組學技術探究影響不同品種玫瑰花呈色的關鍵代謝物成分，擬探討以下問題：（1）分析這3個不同花色玫瑰品種中類黃酮化合物種類及其含量的差異；（2）對不同品種玫瑰花瓣中的差異代謝物及差異代謝通路進行篩選，分析影響玫瑰花呈色的主要代謝物成分的種類。以期為培育不同花色的玫瑰品種提供理論依據，從而促進玫瑰在園林綠化中的應用。

1 材料與方法

1.1 材料采集和處理

試驗樣品為紫紅色‘苦水玫瑰’（‘Rosa rugosa×Rosa sertata’，KSMG）、紅色‘墨紅玫瑰’（‘Rosa Crimson Glory’，MHMG）和白色‘保加利亞白玫瑰’（‘Rosa alba’，BMG）3個栽培玫瑰。花瓣材料采自甘肅省永登縣玫瑰研究所玫瑰種質資源基地。每種試材均選擇生長勢一致、無病害、管理統一的玫瑰植株3株。于2022年5月20日和6月5日采集盛開期的花瓣樣品（圖1）。采集標本時，從4個方向分別抽取不同的花瓣樣本，然后進行混合，每一品種分別進行3次生物學重復測定。取樣后將花瓣樣品裝入具有編號的密封袋內，將其放入冰盒中以防其凋謝，隨后放置于-80℃的冰箱中保存用于后續代謝組學分析（王峰等，2017）。

1.2 方法

1.2.1 花色表型測定 花色利用國際照明委員會制定的CIE L^*a^*b^*表色系法（王峰等，2017；李辛雷等，2019a）進行測定。采集新鮮花瓣，用WR18精密色差儀（深圳市威福光電科技有限公司）測定玫瑰花瓣的明度（L^*）、紅度（a^*）和黃度（b^*），彩度（C^*）和色調角（h^。）實現花色的數字化（張玲，2015）。在光源C/2^。下，將集光孔對準花瓣上表皮中央部位進行測量，每樣品分別測量3朵花的花色參數，取平均值（Wang et al.，2004; Wan et al.， 2019）。

1.2.2 類黃酮提取 將新鮮花瓣進行-80℃冷凍干燥后，將其粉碎（60 Hz，30 s）為粉末狀，將100 mg的試樣加入5 mL離心管中，加入提取液（75%甲醇含1%乙酸）3 000 μL，渦旋30 s，40 Hz勻漿4 min，于冰水浴中超聲30 min；4℃，12 000 r·min^-1 ［離心力13 800（×g），半徑8.6 cm］離心15 min；取2 500 μL的上清液，然后用氮氣吹干，再用1 500 μL提取液B（50%甲醇含0.1%甲酸，含內標）復溶；渦旋1 min后于冰水浴中超聲15 min，4℃，12 000 r·min^-1 ［離心力13 800（×g），半徑8.6 cm］離心15 min；上清液通過0.22 μm濾膜過濾后，取于2 mL進樣瓶中，各樣品均勻混合，制作質量控制（QC）樣品，上機檢測與分析（王方方等，2017；Daneshpajooh et al.，2019；張培月等，2022）。

1.2.3 類黃酮的定性和定量分析 利用UPLC-Q-TOF-MS聯用技術對花瓣中類黃酮進行定性與定量分析。ACQUITYTM UPLC I-Class超高效液相色譜系統（Waters Corporation，Milford，MA，USA），Xevo G2-XSQTof MS質譜系統（Waters Corporation，Manchester，UK），UNIFI 1.8軟件系統。UPLC BEH C₁₈色譜柱（Waters，1.7 μm， 2.1 mm×150 mm）。以0.1%甲酸水溶液（A）和乙腈（B）為液相色譜流動相，流速0.3 mL·min^-1；洗脫程序為0.00～0.50 min，10% B；0.50～15.00 min，10%～60% B；15.00～16.01 min，60%～98% B；16.01～18.00 min，98% B；18.00～18.01 min，98%～10% B；18.01～20.00 min，10% B。40℃的柱溫箱、8℃的自動進樣器和2 μL的進樣量。數據采集以多反應監測（MRM）模式進行質譜分析（趙君等，2021）。

1.3 數據分析

本研究通過色差儀測定玫瑰花瓣的明度（L^*）、紅度（a^*）和黃度（b^*），計算出彩度（C^*）和色調角（h^。），公式如下：C^*=（a^*2+b^*2）^1/2；h^。=arctan（a^*/b^*）。使用SPSS 22.0軟件對花色與關鍵代謝物進行相關性分析。使用上海百趣生物醫學科技有限公司UPLC-MS/MS檢測平臺測定不同花色玫瑰中類黃酮代謝物。采用Metabo Analyst 5.0軟件對所有樣本中的待測物進行定性定量分析。用無監督模式對各組樣本之間的代謝物進行多元統計分析，并且挑選出Plt;0.05且VIP≥1的顯著差異代謝產物。利用KEGG數據庫、MB ROLE 2.0網站和微生信網站進行通路富集分析。

2 結果與分析

2.1 3個玫瑰品種的花色特征

花色在CIE L^*a^*b^*表色系統坐標軸的分布上，明度（L^*）為明暗度變化，L^*越大，花瓣的亮度越高。由表1可知，相比于‘墨紅玫瑰’和‘苦水玫瑰’的L^*，‘保加利亞白玫瑰’的L^*最高（78.41），花色更偏向于白色。紅度（a^*）由正值到負值，是紅色到綠色的變化程度，‘墨紅玫瑰’的a^*比‘保加利亞白玫瑰’的高106.46，‘墨紅玫瑰’的花色偏向于紅色。黃度（b^*）由正值到負值，是黃色到藍色的變化程度，‘保加利亞白玫瑰’的b^*介于兩者之間，花色為白色且帶黃暈。彩度（C^*）值越大，顏色越鮮明，‘墨紅玫瑰’的C^*最大，為110.37，顏色偏向于深紅色，其次是‘苦水玫瑰’的C^*為71.60，花色偏向紫紅色。色調角（h^。）是對7種顏色紅、橙、黃、綠、青、藍、紫的色調描述，紅色區域分布于0°附近，在90°左右是黃色區域，270°～360°是經過紫色區域變成了紅色區域。‘墨紅玫瑰’和‘保加利亞白玫瑰’的h^。處于0°～90°之間，屬于紅色至黃色范圍；而‘苦水玫瑰’的h^。處于270°～360°之間，經過了紫色區域。

2.2 3個玫瑰品種花瓣中類黃酮的種類和含量

由圖2可知，在3種玫瑰樣品中共檢測到類黃酮類代謝物58種，其中24種黃酮類（約占18.85%）、9種黃酮醇類（約占31.89%）、1種花青素類（約占30.45%）、8種黃烷醇類（約占14.49%）、6種二氫黃酮類（約占0.08%）、3種異黃酮類、2種查爾酮（約占0.09%）和5種其他及多酚類物質（約占4.15%）。通過檢測花瓣樣品及代謝物進行聚類分析發現，3種玫瑰花瓣中的類黃酮積累模式存在顯著差異。

2.3 差異代謝物篩選分析

根據Plt;0.05且VIP≥1篩選各組間的差異類黃酮類代謝物，差異倍數（fold_change）表示不同顏色花瓣樣品間代謝物表達量的比值。如圖3：A-C所示，‘墨紅玫瑰’與‘保加利亞白玫瑰’間存在的差異類黃酮類代謝物有45種，其中，顯著上調的代謝物有22種，顯著下調的代謝物有10種；‘保加利亞白玫瑰’與‘苦水玫瑰’間存在的差異類黃酮類代謝物有41種，其中，顯著上調的代謝物有8種，顯著下調的代謝物有22種；‘墨紅玫瑰’與‘苦水玫瑰’間存在的差異類黃酮類代謝物有41種，其中顯著上調的代謝物有11種，顯著下調的代謝物有14種。

研究不同色系玫瑰類黃酮代謝物相對含量的變化趨勢，對所有差異代謝物相對含量的平均值進行z-score標準化，然后再進行K均值（K-means）聚類分析。花色由白色至紫紅色至深紅色（表2），呈升高趨勢的差異代謝物有33種；呈降低趨勢的差異代謝物有8種。在花瓣顏色由白色至紫紅色至深紅色變化中，黃酮類和黃酮醇類物質含量有的升高有的降低，而花青素類的矢車菊-3-O葡萄糖苷含量呈升高趨勢，推測矢車菊-3-O葡萄糖苷是玫瑰花瓣呈紅色的主要色素成分。

2.4 差異代謝物的KEGG功能注釋及富集分析

在K-means聚類分析中，通過所得的呈上升趨勢和下降趨勢類黃酮類代謝物進行富集分析，發現共有12種關鍵代謝產物成功注釋上KEGG代謝通路，并且關鍵差異代謝物不止參與1條代謝通路，有可能2條甚至多條代謝通路（表3）。在3種材料中相對含量呈上升趨勢的33種代謝物中有9種代謝物被注釋上，其中牡荊素、喬松素參與了類黃酮生物合成；圣草酚和（-）-表沒食子兒茶素參與了類黃酮生物合成和次生代謝物生物合成；楊梅素（楊梅黃酮）參與了類黃酮生物合成、黃酮和黃酮醇生物合成、次生代謝物的生物合成。柚皮素、兒茶素和柚皮素查爾酮參與了類黃酮生物合成、次生代謝物的生物合成、苯丙烷生物合成和代謝途徑4條代謝通路。芹菜素類黃酮生物合成、黃酮和黃酮醇生物合成、次生代謝物的生物合成、苯丙烷的生物合成和代謝途徑5條代謝通路。然而8種呈下降趨勢的代謝物中只有3種被注釋上，其中槲皮素、山萘酚和木犀草素均參與了類黃酮生物合成、黃酮和黃酮醇生物合成、次生代謝物的生物合成和代謝途徑4條代謝。

2.5 3個玫瑰品種玫瑰花瓣表型與關鍵代謝物含量的關系

玫瑰花色由白到紫紅到深紅變化中，相對含量變化呈升高趨勢（9種）和降低趨勢（3種）的代謝物成功注釋上類黃酮代謝通路。利用花色表型值與這12種關鍵代謝物含量進行相關性分析，由表4可知，不同品種玫瑰花之間明度（L^*）與紅度（a^*）和彩度（C^*）均呈極顯著負相關（Plt;0.01），隨著花瓣明度的增加，花瓣表面逐漸變亮，花瓣越偏向白色。喬松素和楊梅黃酮與L^*呈顯著負相關（Plt;0.01，Plt;0.05），喬松素與a^*和C^*呈顯著正相關（Plt;0.01），說明喬松素和楊梅黃酮含量的積累顯著增強花色鮮艷程度，降低花瓣表面的亮度。圣草酚、木犀草素和山萘酚與L^*顯著正相關（Plt;0.01），與a^*和C^*呈顯著負相關（Plt;0.01），說明其含量的積累顯著增強花瓣表面的亮度，花瓣偏向白色。木犀草素與黃度（b^*）呈正相關，與色調角（h^。）呈負相關，其含量積累越多，花色越接近黃色。h^。與a^*和C^*呈顯著負相關（Plt;0.01），隨著紅度的增加，花瓣的h^。降低，花色就越接近紅色。可見，喬松素和楊梅黃酮是影響玫瑰花瓣呈現紅色的主要物質，其含量的增加導致花色變紅，并且降低了花瓣的明度；圣草酚、木犀草素和山萘酚是影響玫瑰花瓣呈現白色的主要物質，其含量的增加導致花色變白，其中木犀草素與b^*呈正相關，決定了玫瑰花瓣呈現黃色的主要物質，這與‘保加利亞白玫瑰’花瓣的黃暈呈顯著正相關。

3 討論與結論

類黃酮化合物是參與花色形成的主要色素成分之一，其中花色苷是類黃酮化合物的重要組成成分，花色苷含量差異直接影響植物的花色（鐘培星，2012）。Khoo等（2017）研究發現矢車菊素及其衍生物廣泛作用于植物紅色花瓣中；李辛雷等（2019b）研究發現紅色山茶花瓣中主要的花色苷成分是矢車菊素-3-O-葡萄糖苷；Du等（2016）研究發現30種不同花色的杜鵑花中紅色品種中矢車菊素的含量最高。由此可見，矢車菊素是植物花瓣呈紅色的主要色素成分，這與本研究的研究結果一致。金晶等（2019）研究發現矢車菊素是‘墨紅玫瑰’的主要類黃酮成分，并且其含量要顯著高于其他物質；李文絮（1997）和鞏慧玲等（2019）研究發現‘苦水玫瑰’紅色素的主要成分為矢車菊-3-葡萄糖。本研究通過檢測3種玫瑰花瓣中類黃酮化合物，共得到58種類黃酮代謝物，其中只檢測出1種花色苷為矢車菊-3-O葡萄糖苷，約占玫瑰類黃酮總量的30.45%。‘墨紅玫瑰’和‘苦水玫瑰’的矢車菊-3-O葡萄糖苷分別占其類黃酮總量的47.75%和15.55%，遠高于‘保加利亞白玫瑰’的0.04%，表明矢車菊素在紅色花瓣呈色中起到重要作用，可以推斷出矢車菊-3-O葡萄糖苷是‘苦水玫瑰’和‘墨紅玫瑰’呈紅色的主要物質。

為進一步探究玫瑰花不同花色形成的差異代謝物，大量研究結果表明，植物的花色形成受到色素種類和含量的影響（施蕊等，2020；Han et al.，2020）。‘白紫枝’玫瑰花瓣中僅含有黃酮類化合物，開粉色花的‘粉紫枝’玫瑰和紫色花的‘紫枝’玫瑰中含有黃酮和花青素（張玲，2015）；白色山茶品種‘銀白查理斯’和‘白鳳’中含量最高的黃酮類化合物是木犀草素和槲皮素-3-O葡萄糖苷（李辛雷等，2019b）；白薔薇花和白菊花中只含有淺黃色或接近無色的黃酮和黃酮醇等色素（周琳等，2009），上述結論和本研究的結果相類似。本研究通過Plt;0.05且VIP≥1篩選到12種關鍵代謝產物，分別有6種黃酮類、 2種黃烷醇類、2種黃酮醇類、1種二氫黃酮類、1種查爾酮類。其中黃酮類喬松素和楊梅黃酮的含量積累會影響植物的明度（L^*）、紅度（a^*）和彩度（C^*），其含量越高則花色越鮮艷，花瓣更偏向紅色；而黃酮類木犀草素、二氫黃酮類圣草酚和黃酮醇類山萘酚的含量積累也會影響植物的L^*、a^*和C^*，其含量越高則花色越明亮，花瓣更偏向于白色，其中木犀草素與黃度（b^*）呈正相關，其含量的增加導致花色偏向黃色，是決定玫瑰花瓣呈現黃色的主要成分，這與‘保加利亞白玫瑰’花瓣的黃暈呈顯著正相關。因此，喬松素、楊梅黃酮、木犀草素、圣草酚和山奈酚均是影響玫瑰花呈色的關鍵代謝物。

綜上可見，在‘苦水玫瑰’‘墨紅玫瑰’和‘保加利亞白玫瑰’3種不同花色的玫瑰中檢測到類黃酮代謝物的種類和含量存在顯著差異，這對玫瑰花色有很大的影響。結果表明，在3種不同花色玫瑰樣品中共檢測到58種類黃酮類代謝物，其中矢車菊-3-O葡萄糖苷、喬松素和楊梅黃酮是影響‘苦水玫瑰’和‘墨紅玫瑰’呈紅色的主要色素成分，圣草酚、木犀草素和山萘酚是影響‘保加利亞白玫瑰’呈白色的主要色素成分。

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（責任編輯 鄧斯麗）