連云港地區野生靈芝生物學特性及基因組特征分析

摘要：野生靈芝資源在連云港境內有著廣泛的分布，本研究使用全基因組重測序技術對具有不同形態特征和生境特點的靈芝基因組進行測序及分析，以期解析連云港地區野生靈芝的生物學特性及基因組特征。結果表明，從不同區域采集的野生靈芝種質資源菌絲具有鎖狀聯合，具備形成子實體的條件，生物學特性存在較大差異；通過主成分分析將12株野生靈芝菌株種質資源聚為3類，其中第Ⅲ類具有更豐富的遺傳多樣性；比較單核苷酸多態性（SNP）、插入或者缺失（InDel）在12株靈芝菌株基因組中的分布情況發現，第1條染色體中的SNP最多，占比為46.07%，SNP中轉換顛換比（Ts/Tv）為2.03，說明變異以轉換為主，插入或缺失導致的基因差異在第1條染色體上最多，占總InDel數的44.31%。研究結果說明，連云港地區靈芝具有豐富的遺傳多樣性，可以用于進一步挖掘更多的功能基因和進行品種選育。

關鍵詞：靈芝；生物學特性；全基因組重測序；主成分分析

中圖分類號：S567.3+1文獻標識碼：A文章編號：1000-4440（2024）02-0223-10

Analysis of biological characteristics and genomic characteristics of wild Ganoderma lucidum in Lianyungang

JI Wei1，2，SU Wen-ying1，LIU Xiao-mei1 ，REN Li-kai1，HU Shu-yun3，SUN Xiao-xiao3，CHEN Ke-long2

（1.Lianyungang Academy of Agricultural Sciences， Lianyungang 222000， China;2.Qinghai Normal University， Xining 810000， China;3.Lianyungang Gardening Vegetable Guidance Station， Lianyungang 222000， China）

Abstract：Wild Ganoderma lucidum resources are extensively found in Lianyungang. In this study， we utilized whole-genome resequencing technology to examine and analyze the genomes of Ganoderma lucidum with different morphological and habitat characteristics. The purpose of this study was to unveil the biological and genomic characteristics of wild Ganoderma lucidum in Lianyungang. The results showed that the mycelium of wild Ganoderma lucidum germplasm resources collected from different regions had clamp connection， and had the conditions to form fruiting bodies， and the biological characteristics were quite different. Through principal component analysis， 12 wild Ganoderma lucidum germplasm resources were grouped into three categories， and the third category had more abundant genetic diversity. Analyzing the distribution of single nucleotide polymorphism （SNP） and insertion or deletion （InDel） in the genome of 12 strains of Ganoderma lucidum， it was found that the number of SNP on chromosome 1 was the largest， accounting for 46.07%， and the conversion and inversion ratio （Ts/Tv） in the SNP was 2.03， indicating that the variation was mainly conversion. The genetic difference caused by insertion or deletion was the highest on chromosome 1， accounting for 44.31% of the total InDel number. These results showed that Ganoderma lucidum in Lianyungang had rich genetic diversity， which could be used to further explore more functional genes and breed varieties.

Key words：Ganoderma lucidum;biological characteristics;whole genome resequencing;principal component analysis

靈芝是一種大型藥食兩用真菌[1]，是馳名中外的珍稀中藥材之一[2]，其藥理成分豐富，且無毒副作用，有效成分包括靈芝多糖[3]、多肽[4]、三萜類[5]及16種氨基酸[6]等。靈芝能降低中樞神經系統的興奮性，有一定鎮痛作用[7]，此外還有解毒[8]、降血糖[9]、抗輻射[10]、提高免疫力[11]、治療哮喘[12]和抗腫瘤[13]等作用。靈芝還具有極高的文化觀賞價值[14]，可將之培育成外形美觀的觀賞盆景[15]。

連云港位于江蘇北部，境內山海齊觀，河湖、丘陵、灘涂、濕地、海島俱備[16]，具有豐富的生物多樣性，在菌物資源方面，連云港境內已報道的大型真菌資源有50余種[17]，其中野生靈芝資源豐富、類型多樣，當地村民多采集野生靈芝作為普通農產品或中藥材在市場上銷售，但相關研究甚少。本研究團隊近幾年對連云港地區野生靈芝資源開展了一系列育種研究，在采集、鑒定、馴化栽培、栽培條件優化及抗逆等方面做了一部分工作，探索并實踐了代料栽培、椴木栽培和近地保護方式的仿野生栽培，但沒有科學有效地從遺傳學角度選擇性地對這部分資源進行研究、開發和保護，對連云港地區不同區域采集的靈芝資源的生物學特性、基因組特征和遺傳多樣性尚不清楚。因此，本研究擬選取具有代表性的野生靈芝菌株進行分離、鑒定，對不同菌株間菌落生長速度、液體發酵生物量、液體發酵pH值和人工栽培吃料速度等生物學特性進行研究，首次采用全基因組重測序方法對不同靈芝菌株之間基因組特征及遺傳多樣性進行分析，以期明確其在分子水平上的遺傳多態性與親緣關系，為后期通過分子標注技術與靈芝生物學特性、表型性狀評價相結合創造優質種質資源及挖掘關鍵功能基因提供理論基礎。

1材料與方法

1.1試驗材料

本項目組于2022年6-9月在江蘇省連云港市范圍內采集獲得野生靈芝標本，根據形態特征、生境特點選取具有代表性的標本12個，野生靈芝標本信息如表1所示。將采集的野生靈芝進行組織分離得到菌株，保存于連云港市農業科學院的食用菌菌種庫中。

試驗試劑：馬鈴薯葡萄糖水培養基，購自青島海博生物公司；馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養基，購自北京陸橋技術股份有限公司；蛋白胨，購自生工生物工程（上海）股份有限公司；酵母浸粉、瓊脂粉，購自北京奧博星生物技術有限責任公司。

試驗儀器：CX43顯微鏡，購自日本Olympus公司；超凈工作臺，購自德國Airtech公司；PCR儀、MD-550離心機，購自德國Eppendorf公司。

1.2試驗方法

1.2.1靈芝菌株基因組的提取及分子鑒定采用真菌基因組DNA快速提取試劑盒提取基因組DNA，采用真菌通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）進行PCR擴增。擴增條件如下：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，60 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個循環；72 ℃延伸10 min。對PCR產物進行測序，用MEGA 7.0對所測內轉錄間隔區（ITS）序列進行比對，用鄰接（Neighbor joining）法構建系統發育樹[18]。

1.2.2靈芝菌株生物學特性比較分析

1.2.2.1菌絲體干質量的測定量取50 ml靈芝發酵液倒入離心管中，10 000 r/min離心5 min，將離心后獲得的菌絲體轉移到已干燥且確保恒質量的稱量瓶中，80 ℃烘干，稱量，計算菌絲體干質量。每個試驗設2個重復。

1.2.2.2pH值的測定在超凈臺中，無菌操作取15 ml發酵液于50 ml燒杯中，用pH計進行測定，測定前pH計需要校準，每個試驗設2個重復。

1.2.2.3菌落直徑及菌落生長速率的測定用打孔器定量，將各菌株接種于直徑90 mm的培養皿中，用馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養基在25 ℃避光培養5 d，測量菌落直徑。菌落生長速率=菌落直徑/培養天數。每個試驗設2個重復。

1.2.2.4菌絲吃料長度及吃料速率的測定將各菌株接種于直徑為12 cm的菌棒中，于25 ℃避光培養13 d，測量吃料長度。吃料速率=吃料長度/培養天數。每個試驗設3個重復。

1.2.3靈芝全基因組重測序分析全基因組重測序試驗流程包括DNA樣品檢測、文庫構建、文庫質控和上機測序等。

1.2.3.1樣品檢測為保證文庫構建質量，對基因組DNA進行檢測，待樣品合格后進行文庫構建。檢測標準如下：瓊脂糖凝膠電泳檢測結果顯示基因組DNA主帶完整清晰，且無降解或RNA污染；Nanodrop檢測所得OD260/OD280值為1.8～2.2，無蛋白質或肉眼可見的雜質污染；Qubit 3.0檢測DNA樣品質量濃度大于40 ng/μl，DNA總量大于2 μg。

1.2.3.2文庫的構建樣品基因組DNA檢測合格后，嚴格按照NEBNextUltraTMⅡDNA Library Prep Kit for Illumina中提供的標準流程進行文庫構建，主要試驗步驟如下：將基因組DNA用bioruptorUCD-200處理成200～500 bp的片段；對片段化的DNA進行末端修復并加A尾巴，然后連接測序接頭；根據預期的文庫選擇特定比例的AMPure XP Beads進行目標片段選擇，純化去除接頭污染；通過PCR富集目標DNA片段并用AMPure XP Beads進行純化，即完成測序文庫的構建。

1.2.3.3文庫質控文庫構建完成后，對其進行質量檢測，檢測結果達到要求后方可進行上機測序，檢測方法如下：用Qubit 3.0進行初步定量；用Agilent 2100對文庫的插入片段大?。↖nsert size）進行檢測，Insert size符合預期且無接頭污染才可進行下一步試驗；用德國 ANALYTIKJENA（耶拿）QTOWER實時熒光定量PCR儀對文庫的有效濃度進行準確定量，即有效濃度＞2 nmol/L為合格文庫。

1.2.3.4上機測序按照目標下機數據量對文庫進行Pooling（集中），用Illumina HiSeq平臺對DNA分子兩端分別測序150 bp。

1.2.4統計方法用SPSS、Excel 軟件對數據進行處理分析，用Duncan’s新復極差法對組間差異顯著性進行分析，Plt;0.05表示差異具有統計學意義，用Photoshop軟件處理圖片，用Origin 9.1軟件對所得數據作圖，用MEGA 7.0對內轉錄間隔區序列構建系統發育樹，用SIMCA 14.1軟件進行主成分分析。

2結果與分析

2.1野生靈芝菌株的分離及保存

本研究采集的野生靈芝詳見圖1，生境植被為麻櫟、板栗等闊葉樹種，幼嫩靈芝子實體呈近球形或近半圓形，已形成菌蓋的靈芝厚度不一，菌蓋上輪紋明顯，大部分幼嫩子實體為淡黃色，菌蓋邊緣為淡黃色，本研究分離到1株白肉靈芝和1株樹舌靈芝，詳見圖1B、圖1H。

經分離獲得靈芝菌株12株（圖2A至圖2L），在馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養基中，菌落近圓形，菌落周邊菌絲表面平整，菌絲色澤為淡黃色或白色，菌絲均勻、濃密，無氣生菌絲。通過奧林帕斯顯微鏡觀察發現菌絲分支密度不高（圖2M），且菌絲粗壯（圖2O），有隔膜，可見鎖狀聯合（圖2N），無雜菌。孢子呈球形（圖2P），直徑為4.51～13.52 μm。將分離獲得的菌株用試管斜面保存于4 ℃冰箱。

2.2靈芝菌株基因組DNA的提取及分子鑒定

使用真菌基因組DNA快速提取試劑盒分別提取分離獲得的12株靈芝菌株基因組DNA，基因組DNA的電泳結果見圖3A。將提取的基因組DNA低溫保存，用于ITS分子鑒定和全基因組重測序；通過ITS測序，使用鄰接法構建系統發育樹（圖3B）。從進化樹可以看出，12株野生靈芝被聚成3大類，其中第Ⅰ類有4株，占總株數的33.3%，第Ⅱ類有3株，占總株數的25.0%，第Ⅲ類有5株，占總株數的41.7%。由分支情況可知，每個分類的近交程度較低，其中第Ⅲ類表征遺傳多樣性的參數都高于其他2類（Ⅰ、Ⅱ），表明其遺傳性更豐富。

2.3靈芝菌株生物學特性的比較分析

對12株靈芝菌株進行生物學特性測試，由圖4可知，不同菌株之間的菌落直徑、菌落生長速率呈現較明顯的分化，其中菌株lynk002的菌落直徑、菌落生長速率最高，分別為8.39 cm、1.68 cm/d，其次是菌株lynk010，其菌落直徑、菌落生長速率均顯著高于菌株lynk005、lynk006、lynk007和lynk008（P＜0.05），菌株lynk007的菌落直徑、菌落生長速率最低。對不同菌株液體發酵生物量進行統計發現，菌株lynk010的菌絲體干質量最高，為13.12 g/L，其次為菌株lynk002，菌株lynk003的菌絲體干質量最低，菌株lynk010的菌絲體干質量顯著高于菌株lynk001、lynk003、lynk004、lynk005、lynk006、lynk007、lynk008、lynk011和lynk012（P＜0.05）。對不同菌株液體發酵的pH值進行統計發現，菌株lynk005的pH值最高，為5.29，其次為菌株lynk007，pH值為5.27，菌株lynk002的pH值最低，為4.45，菌株lynk005的pH值顯著高于菌株lynk002、lynk008、lynk009、lynk010和lynk012（P＜0.05）。對不同菌株菌絲的吃料長度、吃料速率進行統計發現，菌株lynk010菌絲的吃料長度、吃料速率分別為7.27 cm、0.56 cm/d，其次是菌株lynk002，菌株lynk010菌絲的吃料長度、吃料速率顯著高于菌株lynk005、lynk006、lynk007和lynk008菌絲（P＜0.05）。

2.4測序數據統計分析

用Illumina HiSeq平臺對有效數據進行測序，結果顯示，高質量的有效讀取數總計為263 448 358條，總堿基數為79 034 507 400 bp，平均每條測序有效讀取長度為300 bp，有效讀取數、總堿基數最多的是菌株lynk009，最少的是菌株lynk008，測序G+C含量為48.04%～58.45%，質量數大于20的堿基所占比例（Q20）、質量數大于30的堿基所占比例（Q30）的平均值分別為94.55%、88.95%，說明測序出錯率低，質量符合要求，建庫成功，可用于后續SNP標記挖掘，詳細數據統計結果見表2。

2.5比對率統計分析

以Liu等[19]報道的靈芝單核菌株DH-8的全基因組為參考基因組進行比對，由表3可以看出，在唯一位點比對率方面，菌株lynk002、lynk003和lynk008對應的測序數據唯一位點比對率較低，其他菌株的唯一位點比對率為20.67%～33.40%，平均唯一位點比對率為22.63%；多位點比對率為0.81%～5.68%，平均比對率為3.68%。本研究采集的靈芝菌株與已報道的靈芝菌株DH-8基因組的比對率較低，說明本研究中的菌株與已報道的菌株之間的遺傳距離較遠。

2.6覆蓋度、覆蓋深度的統計分析

由圖5可以看出，在覆蓋率方面，菌株lynk002、lynk008較低，其他菌株的覆蓋率較接近，覆蓋率為34.23%～36.78%，平均覆蓋率為30.40%。在覆蓋深度方面，菌株lynk002、lynk003的覆蓋深度相對較低，分別為18.80、19.04，菌株lynk009的覆蓋深度最高，為84.49，平均覆蓋深度為50.68。

2.7變異類型分析

單核苷酸多態性（SNP）的類型及插入缺失標記（InDel）長度統計結果詳見圖6。在本研究中，共獲得了705 742個變異位點，其中598 864個為SNP，106 878個為InDel。SNP數量統計結果顯示，401 001個SNP是轉換類型（A/G和C/T，為嘌呤之間或嘧啶之間的交換），197 863個SNP是顛換類型（A/C、A/T、C/G和G/T，為嘌呤和嘧啶之間的交換），轉換顛換比（Ts/Tv）為2.03。InDel數量統計結果顯示，長度小于或等于10 bp的InDel占比達到97.97%，長度大于10 bp的InDel占比為2.03%，長度為2 bp的InDel數量最多，為35 104個。

2.8變異在基因組上的分布

如表4所示，5條染色體中SNP總數量為598 864個，在染色體Chr01中，SNP最多，數量為275 900個，占比為46.07%，同時染色體Chr01對應的SNP密度也最高；插入或缺失導致的基因差異在染色體Chr01上表現得較明顯，InDel數量為47 355個，占總InDel數量的44.31%，同時對應的InDel密度也最高。

2.9主成分分析

為總體分析靈芝菌株之間的遺傳關系，對測序數據進行主成分分析。如圖7所示，貢獻度排前2位的主成分1、主成分2的特征值分別為58.4%、28.2%，合計貢獻率為86.6%。根據菌株分布情況，大致可以分為3簇（或3類），第Ⅰ簇位于第1象限，共3個菌株，為lynk002、lynk003和lynk008，其中lynk002和lynk008分布得更集中；第Ⅱ簇位于第3象限，共3個菌株，為lynk007、lynk010和lynk012，其中lynk007和lynk010分布得相對較近；第Ⅲ簇位于第2象限和第4象限交匯處，共6個菌株，為lynk001、lynk004、lynk005、lynk006、lynk009和lynk011。

3討論

有研究發現，除金針菇、黑木耳等少數單核菌絲可以形成子實體外，多數食用菌只有雙核菌絲才能形成子實體，雙核菌絲體與單核菌絲體相比，具有分支快、菌絲健壯和穩定性好等優勢，因此在食用菌生產中，菌株大多選擇雙核菌絲[20]。本研究分離的靈芝菌株具有鎖狀聯合，而鎖狀聯合是雙核菌絲的鑒定標準，因此本研究采集的菌株具備形成子實體的條件。菌落生長速率、液體發酵菌絲體干質量和菌絲吃料速率等參數反映了菌絲的活力，而且呈正相關，菌株活力也關系著菌株優劣、后續出菇好壞、栽培時間和子實體產量等[21]。韓鵬等[22]以羊肚菌菌絲生長速度、長勢作為菌株優劣的評價標準，董玉蘭等[23-24]分別結合菌絲萌發活力、生物量對白靈菇、桑黃菌株的活力進行評價。本研究結果顯示，在連云港不同區域采集的野生靈芝種質資源，菌株之間的生物學特性存在較大差異，菌落生長速率、液體發酵菌絲體干質量和菌絲吃料速率最高值分別是最低值的1.49倍、1.77倍和1.40倍，差異程度達到顯著水平（P＜0.05），三者之間呈正相關趨勢，而與發酵液的pH值呈負相關趨勢。

Brown等[25]對32個花生品種進行了全基因組重測序，對品種間基于系譜和基于SNP的遺傳相似性進行對比，發現基于全基因組重測序數據獲得的結果更加準確，具有高度相關性的品種緊密地聚在一起，可見重測序在探索品種的遺傳多樣性、鑒定未知來源材料方面具有不可比擬的優越性。郭敏杰等[26]發現，基因型數據更能準確地反映品種內在遺傳基礎。本研究通過ITS聚類分析，將12株野生靈芝種質資源聚成3大類，通過主成分分析，根據菌株在坐標上的分布情況，同樣將這12個菌株分為3類，其中聚類分析的第2類與主成分分析的第Ⅱ簇完全吻合，而聚類分析的第Ⅰ、Ⅲ類與主成分分析的第Ⅰ、Ⅲ簇存在一定出入，聚類分析中第Ⅰ類中的lynk006、lynk009在主成分分析中聚為第Ⅲ簇，聚類分析中第Ⅲ類中的lynk002在主成分分析中聚為第Ⅰ簇，由于主成分分析數據基于全基因組重測序數據，該方法更可靠，上述2種分析方法的第Ⅲ類表征遺傳多樣性的參數都高于其他2類（Ⅰ、Ⅱ），說明第Ⅲ類具有更豐富的遺傳多樣性。

目前基于二代測序的全基因組重測序技術已作為主流方法應用于很多物種SNP標記的開發[27]。Shen等[28]揭示了四倍體棉花的SNP和InDel多樣性，Zhang等[29]確定了辣椒第1花節的候選基因，但靈芝這方面的研究還未見相關報道。本研究所測序列的Q20、Q30占比較高，說明測序出錯率很低，GC分布正常，數據量達到預期目標，本研究采集的靈芝菌株與已報道的靈芝菌株DH-8的基因組比對率較低，說明本研究中的菌株與已報道的菌株之間遺傳距離較遠。12株靈芝中的SNP數量為598 864個，InDel數量為106 878個，在第1條染色體中SNP最多，占比46.07%，SNP中轉換顛換比（Ts/Tv）為 2.03，說明變異以轉換為主，插入或缺失導致的基因差異在第1條染色體上表現得較為明顯，占總InDel數的44.31%，表明可能有更多的功能基因在第1條染色體上，第1條染色體可以用于進一步挖掘更多功能基因。

4結論

本研究對連云港范圍內野生靈芝生物學特性進行分析，使用全基因組重測序技術對靈芝基因組進行測序，并進行序列特征分析和主成分分析。結果表明，從不同區域采集的野生靈芝種質資源在菌落生長速率、液體發酵液生物量和菌絲吃料速率等生物特性方面展現出較大差異；通過主成分分析將12株野生靈芝種質資源聚為3類，其中第Ⅲ類具有更豐富的遺傳多樣性。在12株靈芝基因組中，第1條染色體的SNP最多，變異以轉換為主，插入或缺失導致的基因差異在第1條染色體上表現得明顯，說明可能有更多功能基因在第1條染色體上，第1條染色體可以用于進一步挖掘更多的功能基因。本研究結果可為后期分子標注技術與靈芝生物學特性、表型性狀評價相結合，創造優質種質資源和挖掘優質基因提供科學的理論基礎。

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（責任編輯：徐艷）