梔子苷調節PI3K/AKT/mTOR信號通路在動脈粥樣硬化形成過程中對Th17/Treg功能的影響

吳佳 吳進 肖凱 凌超

摘要 目的：觀察梔子苷對載脂蛋白E缺乏（ApoE-/-）小鼠Th17/調節性T（Treg）細胞失衡的影響及其作用機制。方法：將50只純合子ApoE-/-雌性小鼠隨機分為對照組、模型組和梔子苷低劑量組、梔子苷中劑量組、梔子苷高劑量組。對照組小鼠喂養普通飼料，模型組和梔子苷組小鼠喂養高脂飼料。從第8周開始，梔子苷各劑量組每日灌胃梔子苷（25、50、100 mg/kg），連續8周。試驗結束時，采用油紅O染色評估主動脈及其根部動脈粥樣硬化（AS）病變面積比。采用定量逆轉錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR）分析主動脈組織腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素（IL）-6、IL-17A和IL-10 mRNA表達；采用流式細胞儀分析脾臟中Th17和Treg細胞百分比；蛋白免疫印跡法（Western Blot）檢測主動脈組織磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號通路相關蛋白表達。結果：油紅O染色病變顯示，梔子苷中劑量組、梔子苷高劑量組病變百分比低于模型組（P＜0.05）。與對照組比較，模型組主動脈TNF-α、IL-6和IL-17A mRNA表達水平升高（P＜0.05）；梔子苷各劑量組主動脈TNF-α、IL-6和IL-17A mRNA表達水平降低（P＜0.05）。與對照組比較，模型組主動脈抗炎細胞因子IL-10 mRNA表達水平降低（P＜0.05）；梔子苷各劑量組主動脈抗炎細胞因子IL-10 mRNA表達水平升高（P＜0.05）。與對照組比較，模型組小鼠脾臟中Th17細胞百分比升高，Treg細胞百分比降低（P＜0.05）。梔子苷處理恢復了AS小鼠Th17和Treg細胞的平衡。梔子苷抑制PI3K的表達及AKT和mTOR的磷酸化，MHY1485（mTOR活化劑）減弱了梔子苷對T細胞分化的影響。結論：梔子苷抗AS作用機制可能與抑制PI3K/AKT/mTOR信號引起的Treg細胞增多和Th17細胞減少有關。

關鍵詞 動脈粥樣硬化；梔子苷；載脂蛋白E缺乏；Th17/調節性T細胞；磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號通路；小鼠；實驗研究

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2024.05.008

Effect of Geniposide Regulating PI3K/AKT/mTOR Signaling Pathway on Th17/Treg Function during Atherogenesis

WU Jia， WU Jin， XIAO Kai， LING Chao

Hunan Provincial Maternal and Child Health Care Hospital， Changsha 410008， Hunan， China

Corresponding Author WU Jin， E-mail： wujinwujin@163.com

Abstract Objective：To observe the effect of Geniposide on Th17/ regulatory T（Treg） cell imbalance in apolipoprotein E deficient（ApoE-/-） mice and its mechanism.Methods：Fifty female homozygous ApoE-/- mice were randomly divided into control group，model group，geniposide low-dose group，geniposide medium-dose group and geniposide high-dose group.From the 8th week，each dose group was given daily gavage of geniposide（25，50，100 mg/kg） for 8 weeks respectively.At the end of the experiment，the lesion area ratio of atherosclerosis（AS） in the aorta and its roots was assessed by oil red O staining.Quantitative reverse transcription polymerase chain reaction（RT-PCR） was used to detect the mRNA expression of tumor necrosis factor-α（TNF-α），interleukin-6（IL-6），IL-17A and IL-10 in aortic tissue.The percentage of Th17 and Treg cells in spleen was analyzed by flow cytometry.Western Blot was used to detect phosphatidylinositol 3-kinase（PI3K）/protein kinase B（AKT）/mammalian target of rapamycin（mTOR） signals in aortic tissue.Results：Oil red O staining showed that pathological percentage in the geniposide medium-dose group and geniposide high-dose group was lower than that in the model group（P＜0.05）.Compared with the control group，the mRNA expressions of TNF-α，IL-6，and IL-17A in aorta of the model group increased（P＜0.05），and the mRNA expressions of TNF-α，IL-6 ，and IL-17A in aorta of geniposide dose groups decreased（P＜0.05）.Compared with the control group，the percentage of Th17 cells increased and the percentage of Treg cells decreased in the spleens of the model group（P＜0.05）.Geniposide restored the balance of Th17 and Treg cells in AS mice.Geniposide inhibited the expression of PI3K and the phosphorylation of AKT and mTOR，and MHY1485（mTOR activator） attenuated the effect of geniposide on T cell differentiation.Conclusion：The mechanism of anti-AS action of geniposide might be related to the increase of Treg cells and the decrease of Th17 cells induced by inhibition of PI3K/AKT/mTOR signaling pathway.

Keywords atherogenesis; Geniposide; apolipoprotein E deficient; Th17/ regulatory T cell; phosphatidylinositol 3-kinase（PI3K）/protein kinase B（AKT）/mammalian target of rapamycin（mTOR） signaling pathway; mice; experimental study

基金項目 湖南省衛生健康委科研項目（No.20200083）

作者單位 湖南省婦幼保健院（長沙? 410008）

通訊作者 吳進，E-mail：wujinwujin@163.com

引用信息 吳佳，吳進，肖凱，等.梔子苷調節PI3K/AKT/mTOR信號通路在動脈粥樣硬化形成過程中對Th17/Treg功能的影響［J］.中西醫結合心腦血管病雜志，2024，22（5）：817-822.

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是一種由先天性和適應性免疫反應及白細胞浸潤引起的進行性慢性炎癥性疾?。?-2］。相關研究表明，Th17和CD4＋CD25＋調節性T（Treg）細胞的平衡在炎癥和自身免疫性疾病的發展中十分重要［3］。在AS動物模型和急性冠脈綜合征病人的局部AS病變和循環淋巴細胞中發現Th17細胞反應性上調，且Treg細胞/Th17細胞失衡與AS

發展、斑塊破裂有關［4-5］。梔子苷（Geniposide）是從梔子中分離得到的一種環烯醚萜苷化合物，具有廣泛的抗炎和抗氧化作用［6］。有研究顯示，梔子苷可抑制巨噬細胞中炎癥介質釋放［7］。目前，關于梔子苷的抗炎作用是否有助于改善AS中的Th17/Treg細胞失衡尚未明確。本研究觀察梔子苷對載脂蛋白E缺乏（apolipoprotein-E deficient，ApoE-/-）小鼠Th17/Treg細胞失衡的影響及其作用機制，旨在為梔子苷防治AS提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

50只7周齡純合子ApoE-/-雌性小鼠購自南京大學模式動物遺傳研究中心。將小鼠飼養在聚碳酸酯籠中，每籠5只，在無病原體溫度（25 ℃）環境中進行嚴格的12 h光照/黑暗循環飼養，自由進食、飲水。將小鼠隨機分為對照組、模型組、梔子苷低劑量組、梔子苷中劑量組、梔子苷高劑量組，每組10只。對照組小鼠喂養普通飼料，模型組和梔子苷各劑量組小鼠喂養高脂飼料（18%脂肪和1.2%膽固醇）。從第8周開始，梔子苷各劑量組每日灌胃梔子苷（25、50、100 mg/kg），連續8周。對照組、模型組給予等量生理鹽水灌胃。第16周，使用0.5%戊巴比妥鈉（美國Sigma公司）腹膜內麻醉小鼠。通過心臟穿刺收集血液，解剖并保存主動脈和脾臟組織以備進一步研究。

1.2 主動脈粥樣斑塊分析

將主動脈及其根部在磷酸緩沖鹽溶液（PBS）、4%甲醛、30%蔗糖中固定過夜，之后將其固定在OCT包埋劑（美國Sakura公司）中并在－70 ℃下冷凍。將冷凍切片（10 mm）用油紅O染色。從每只小鼠的5個切片中分別獲取病變面積百分比以定量分析AS情況。采用Olympus BX51成像系統（日本Olympus公司）捕獲切片圖像，使用Image-Pro Plus 6.0測量斑塊面積。

1.3 血脂與脂蛋白譜分析

采用7060型自動分析儀（日本日立公司）酶法測定血清血脂［三酰甘油（TG）、總膽固醇（TC）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）］和脂蛋白譜。

1.4 定量逆轉錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR）分析

使用TRIzol試劑（日本TaKaRa公司）從小鼠主動脈組織中提取總RNA。使用RNA PCR試劑盒（日本Takara Biotechnology公司）將1 μg總RNA反轉錄為cDNA，并將cDNA作為模板，使用StepOnePlus實時熒光定量PCR系統（美國Applied Biosystems公司）進行實時PCR。管家基因磷酸苷油酸脫氫酶（GAPDH）作為PCR的內部對照。PCR反應混合物使用SYBR Green I（日本Takara Biotechnology公司）、cDNA和引物。使用常規2－△△Ct方法計算目的基因的表達。引物序列：腫瘤壞死因子-α（TNF-α），正向引物5′-CGCCTCACCTGACCTACC-3′，反向引物5′-TTGCCTCGTTCTGGACTATAC-3′；白細胞介素（IL）-6，正向引物5′-CACCTATGCCACCCTTATCC-3′，反向引物5′-CGAACATGCGAGTAAACCAA-3′；IL-17A，正向引物5′-GCTGACCCCTAAGAAACCCC-3′，反向引物5′-GAAGCAGTTTGGGACCCCTT-3′；IL-10，正向引物5′-ATGCTGCCTGCTCTTACTGACTG-3′，反向引物5′-CCCAAGTAACCCTTAAAGTCCTGC-3′；GAPDH，正向引物5′-AGCAATGCCTCCTGCACCACCAAC-3′，反向引物5′-CCGGAGGGGCCATCCACAGTCT-3′。

1.5 細胞制備與流式細胞儀

參照文獻［8］中方法制備脾細胞懸液。使用無菌針在冷的PBS中擠壓小鼠新鮮脾臟，使其通過70 μm的細胞過濾器，制備單個核細胞懸液。通過Ficoll-Hypaque分離脾淋巴細胞，并重懸于完全培養基：RPMI-1640（美國Gibco公司）中，使用臺盼藍染色檢測的細胞存活率＞95%。采用流式細胞儀分析Th17和Treg細胞。將細胞等分至試管中，并在PBS中洗滌1次，之后重懸至106個細胞/mL。使用異硫氰酸熒光素（FITC）結合CD4（1∶200）或PE結合CD4（1∶200）在4 ℃下持續孵育20 min。通過細胞內固定和滲透試劑盒在細胞內用PE-cy7-結合的IL-17A（1∶100）進行細胞內染色或使用叉頭框蛋白p3（Foxp3）/轉錄因子染色緩沖試劑盒在核內用PE-cy7-結合的Foxp3（1∶100）（抗體和試劑盒均購自美國eBioscience公司）進行染色。給予同型對照以實現正確的補償并確認抗體特異性。在BD-FACS-Calibur流式細胞儀（美國BD-Biosciences公司）進行流式細胞術分析。使用Flow Jo軟件（美國Ashland公司）分析數據。

為了分析哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）對Treg細胞的影響，將脾臟單個核細胞培養于RPMI 1640完全培養基中，用抗CD3、抗CD28抗體（1 μg、1×106個/細胞）刺激，加用或不加用梔子苷（5 μmol/L）和MHY1485（mTOR活化劑，2 μmol/L）處理72 h。使用流式細胞儀對細胞樣品中Th17和Treg細胞進行定量測定。

1.6 蛋白免疫印跡法（Western Blot）分析

采用RIPA緩沖液（北京索萊寶科技有限公司）裂解主動脈組織標本提取總蛋白。通過二喹啉甲酸（BCA）試劑盒評估蛋白質含量。采用10%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）將蛋白質轉移到聚偏氟乙烯（PVDF）膜上（美國Invitrogen公司）。將膜用5%脫脂牛奶封閉1 h，之后在4 ℃條件下，以一抗封閉過夜：磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）（1∶1 000）、蛋白激酶B（AKT，1∶1000）、磷酸化AKT（p-AKT，1∶1000）、mTOR（1∶1500）、磷酸化mTOR（p-mTOR，1∶1 000）和GAPDH（1∶1 000），均購自英國Abcam公司。將PVDF膜與二抗在室溫下孵育1 h。使用蛋白免疫印跡法檢測化學發光試劑盒觀察目標條帶。

1.7 統計學處理

采用SPSS 25.0統計軟件進行數據分析，符合正態分布的定量資料以均數±標準差（x±s）表示，采用雙尾t檢驗或單因素方差分析和Bonferroni-Dunn事后檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 梔子苷對ApoE-/-小鼠AS發展的影響

與對照組比較，模型組和梔子苷各劑量組實驗結束后TC和LDL-C升高（P＜0.05）。詳見表1。對整個主動脈的油紅O染色病變量化結果顯示，梔子苷中劑量組、梔子苷高劑量組病變百分比低于模型組（P＜0.05）。詳見圖1A、圖1B。測量主動脈根部的橫截面積時，梔子苷治療以劑量依賴的方式降低了病變百分比（P＜0.05）。詳見圖1C、圖1D。

2.2 梔子苷調節TNF-α、IL-6和IL-17A、IL-10 mRNA及Th17和Treg細胞的平衡

與對照組比較，模型組主動脈TNF-α、IL-6和IL-17A mRNA表達水平升高；與模型組比較，梔子苷各劑量組主動脈TNF-α、IL-6和IL-17A mRNA表達水平降低，且梔子苷組呈劑量依賴性降低，差異有統計學意義（P＜0.05）。與對照組比較，模型組主動脈中抗炎細胞因子IL-10 mRNA表達水平降低；與模型組比較，梔子苷各劑量組主動脈IL-10 mRNA表達水平升高，且梔子苷組呈劑量依賴性升高，差異有統計學意義（P＜0.05）。詳見圖2A。進一步行流式細胞術分析結果顯示，與對照組比較，模型組脾臟中CD4＋IL-17A＋細胞百分比升高，CD4＋Foxp3＋細胞百分比降低；與模型組比較，梔子苷各劑量組脾臟中CD4＋IL-17A＋細胞百分比降低，CD4＋Foxp3＋細胞百分比升高，且梔子苷組呈劑量依賴性變化，差異有統計學意義（P＜0.05）。詳見圖2B～圖2D。

2.3 梔子苷抑制PI3K/AKT/mTOR信號的激活

與模型組比較，梔子苷各劑量組主動脈PI3K表達及AKT和mTOR的磷酸化表達水平降低，且梔子苷各組呈劑量依賴性降低，差異有統計學意義（P＜0.05）。詳見圖3A、圖3B。當用MHY1485（mTOR活化劑）/梔子苷/MHY1485＋梔子苷處理從ApoE-/-小鼠脾臟分離的單核細胞，結果顯示，與對照組比較，MHY組CD4＋IL-17A＋細胞百分比增加，CD4＋Foxp3＋細胞百分比降低，差異有統計學意義（P＜0.05）。與MHY組相比，梔子苷組CD4＋IL-17A＋細胞百分比顯著降低，CD4＋Foxp3＋細胞百分比增加，差異有統計學意義（P＜0.05）。與梔子苷組比較，梔子苷＋MHY組CD4＋IL-17A＋細胞百分比增加，CD4＋Foxp3＋細胞的百分比降低，差異有統計學意義（P＜0.05）。詳見圖4～圖6。

3 討 論

AS是一種慢性炎癥性疾病，在病變形成過程中，免疫細胞發揮著重要作用［9-11］。CD4＋T細胞被認為是最早進入人類病變的免疫細胞之一［12］。嚴重免疫缺陷突變（SCID）小鼠與ApoE-/-小鼠雜交時由于缺乏成熟的T細胞和B細胞，其后代AS斑塊減少［13］。將CD4＋T細胞轉移到ApoE-/-的SCID小鼠體內可加重AS發展［14］。近年來，多種抗炎治療AS的方法被研發出來，證實是有效的［15］。CANTOS研究顯示，IL-1β的單克隆抗體（canakinumab）可降低復發性心血管事件發生率，降低與血脂水平無關［16］。本研究結果顯示，ApoE-/-小鼠AS發展是Th17/Treg失衡的結果；與對照組比較，模型組小鼠Th17細胞百分比和IL-17A、IL-6和TNF-α mRNA水平明顯升高。有研究表明，Th17細胞在AS形成中發揮著重要作用，不穩定型心絞痛和急性心肌梗死病人血漿IL-17A升高［17］。IL-17A可誘導巨噬細胞產生基質金屬蛋白酶（MMP）-9，與易損斑塊有關［18］。相關研究顯示，在高脂血癥小鼠模型和人類研究中，Th17細胞和Tregs與AS進展呈負相關［4］。本研究結果顯示，模型組小鼠Treg細胞及IL-10水平降低。因此，在高脂血癥ApoE-/-小鼠AS形成過程中存在Th17/Treg功能失衡，其可能在AS斑塊負荷和穩定性中發揮作用。

梔子苷是從梔子中提取的環烯醚萜苷，是梔子中的主要活性成分。有研究表明，梔子苷可降低TNF-α、IL-1、IL-6和IL-1β含量，具有顯著的抗AS作用［19］。相關研究顯示，梔子苷對炎癥反應的抑制作用涉及絲裂原活化蛋白激酶途徑的抑制［20］。本研究結果顯示，梔子苷以劑量依賴方式減弱了喂飼高脂飼料的ApoE-/-小鼠體內AS病變發展，且梔子苷處理顯著降低了ApoE-/-小鼠主動脈中促炎細胞因子（包括TNF-α、IL-6和IL-17A）水平，提高了抗炎細胞因子IL-10水平，提示梔子苷可能通過降低IL-17A和提高IL-10在主動脈中的表達抑制AS發展。IL-17A/IL-10主要由Th17和Treg細胞產生，這兩種類型的T細胞可能受到梔子苷影響；進一步流式細胞術分析結果顯示，梔子苷處理恢復了AS小鼠Th17和Treg細胞的平衡。上述結果表明梔子苷改善AS發展的機制可能與Th17和Treg細胞的調節有關。

梔子苷如何調節T細胞分化尚未明確。相關研究發現，mTOR在啟動效應CD4＋T細胞分化中發揮重要作用，缺乏mTOR的T細胞未分化為Th1、Th2或Th17效應細胞，而是分化為Foxp3＋調節性T細胞［9］。本研究結果顯示，梔子苷抑制了高脂血癥ApoE-/-小鼠脾臟中PI3K/AKT/mTOR信號的激活，mTOR信號的激活增加了Th17細胞百分比，降低了Treg細胞百分比；同時mTOR的激活減弱了梔子苷對T細胞分化的影響。因此，梔子苷可能通過抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路調節CD4＋T細胞分化。

綜上所述，梔子苷改善了AS的發展，有助于降低促炎細胞因子，提高抗炎細胞因子水平。梔子苷抗AS作用機制可能與抑制PI3K/AKT/mTOR信號引起的Treg細胞增多、Th17細胞減少有關。本研究對梔子苷抗AS發展提供了新方向。

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（收稿日期：2022-06-29）

（本文編輯薛妮）