提取溫度對烏魚魚鱗明膠功能性質和結構特性的影響

黃麗金，聞怡凡，羅美玲，喬娟娟，蔣文麗，謝 歡，舒 圣，方 婷，涂宗財,3，沙小梅,4,*

（1.江西師范大學生命科學學院國家淡水魚加工技術研發專業中心，江西南昌 330022；2.希而思（長沙）科技研究院有限公司，湖南長沙 410000；3.南昌大學食品科學與資源挖掘全國重點實驗室，江西南昌 330047；4.江西德上醫藥研究院有限公司，江西樟樹 331208）

我國水域遼闊，水產資源豐富，是世界第一漁業大國[1]。烏魚又稱烏鱧、黑魚、生魚、蛇頭魚等，在我國除西部高原地區外，其他地區均有分布，是中國最重要的商業魚類之一[2]。烏魚肉味鮮美、營養豐富，具有較高的經濟價值與藥用價值。研究表明，烏魚的平均含肉率為68.24%，高于四大家魚和鯉、鯽、魴等魚種[3]。烏魚除鮮活銷售外，其加工模式主要集中于生魚肉和凍魚片。魚骨、魚皮、魚鱗等副產物常作為廢棄物，利用率低。如果不妥善處理，不僅會污染環境，還會浪費現有資源[4-5]。

明膠是最受歡迎的生物聚合物之一，因其有良好的凝膠性、起泡性、乳化性和成膜性而被廣泛應用于制藥、材料、化妝品、攝影和食品等領域[6]。近年來，全球對明膠的需求量一直在增長，世界上約98.5%的明膠是在哺乳動物身上提取出來的[7]。但由于宗教信仰，以及隨著瘋牛病和口蹄疫在世界范圍內的蔓延，尋找哺乳動物的明膠替代物受到了越來越多的關注[8]。魚鱗由蛋白質、礦物質等組成，蛋白質的量從41%至84%[9]，可作為提取明膠的良好材料。

常用的明膠提取方法有熱水提取、稀酸提取、酶法提取[10]。熱水法提取魚鱗明膠，對生產要求低，操作簡便，對設備要求低，無污染，有利于環境保護。近年關于魚鱗明膠的報道日益增多，對魚鱗明膠功能性質和結構特性進行了一些研究，如乳化活性[11]、起泡性[12]、凝膠強度[13]、流變性[14]、分子量分布[15]、二級結構[16]等。有研究報道表明，提高提取溫度，膠原蛋白中α鏈之間結合不穩定，三螺旋結構解旋，不利于凝膠強度，但會有更好的得率、起泡性和乳化活性[10]。迄今為止，未見系統研究溫度對烏魚魚鱗明膠功能性質和結構特性的報道。本研究采用不同的溫度提取烏魚魚鱗明膠，并探究溫度對魚鱗明膠得率、功能性質和結構特性的影響，為烏魚魚鱗的利用提供一條操作簡便、價格低廉的途徑，將有利于烏魚加工副產物的綜合利用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮烏魚魚鱗 江西省南昌市南昌縣長勝大市場；鹽酸 上海試劑一廠；十二烷基硫酸鈉 天津市大茂化學試劑廠；其他所用試劑均屬于分析純或更高的等級。

Bio Tek Synergy H1 全功能酶標儀 美國Bio Tek 儀器有限公司；T25 分散機 德國IKA 公司；LGJ-1 型冷凍干燥機 北京亞泰科隆儀器有限公司；HH-8 數顯恒溫水浴鍋 江蘇科析儀器有限公司；TA.XT Plus 質構儀 英國Stable Micro System 公司；Nicolet 5700 傅里葉變換紅外光譜儀 美國Thermo 公司；Bio-Rad 型電泳儀 美國Bio-Rad 公司；S-3400N 形掃描電子顯微鏡 日本株式會社日立高新技術那珂事務所；MCR 302 型剪切應力控制流變儀 奧地利Anton Paar 公司；XS-402 型實驗室生物顯微鏡 南京江南永新光學有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 熱水法提取烏魚魚鱗明膠 將烏魚魚鱗清洗3 遍以去除雜質，再置于組織搗碎機中搗碎5 min，水洗以去除魚鱗表面的銀白色物質。用0.50 mol/L 的鹽酸，以1:25（m/v）的料液比進行1 h 的脫鈣處理。水洗魚鱗至pH 為6～7 以去除殘留酸液，等份分成五組。將預處理后的魚鱗，根據料液比1:3（m/v）加去離子水，在60、70、80、90、100 ℃下分別加熱2 h提膠，提取得到的魚鱗明膠溶液pH 為5.00～5.50。抽濾除去魚鱗殘渣，濾液經冷凍干燥后制得魚鱗明膠，密封保存，備用。

1.2.2 顯微鏡觀察烏魚魚鱗表觀形貌的變化 分別取脫鈣前、脫鈣后的魚鱗以及各個提取溫度下的魚鱗殘渣制成臨時裝片，在光學顯微鏡下觀察魚鱗表面的紋路及破損情況。

1.2.3 魚鱗明膠得率 以稱重法來計算魚鱗明膠得率，將脫鈣后并去除水分的魚鱗和冷凍干燥后的魚鱗明膠進行稱重。按以下公式進行計算：

式中：R1表示魚鱗明膠得率，%；m0表示明膠干質量，g；m1表示脫鈣后魚鱗干質量，g。

1.2.4 烏魚魚鱗明膠凝膠強度的測定 根據GIMENEZ 等[17]的方法并適當修改，具體描述如下。在55 ℃水浴鍋中利用去離子水溶解明膠制備成66.70 mg/mL 的明膠溶液，置于小燒杯中使得樣品直徑33 mm、高度22 mm，于4 ℃條件下保存16～18 h后測定凝膠強度。采用TA.XT Plus 質構儀，選擇NO-P/0.5R 的平底圓柱形探頭，測試速率為1 mm/s，下壓高度為4 mm。凝膠強度即為魚鱗明膠樣品被壓縮4 mm 所需的最大應力g。

1.2.5 烏魚魚鱗明膠溫度掃描的測定 根據CHANDRA 等[18]的方法并適當修改，具體描述如下。采用流變儀進行測量，取17 mL 66.70 mg/mL 的明膠溶液置于PP50 圓筒中40 ℃保持3 min，溶液先從40 ℃降溫至5 ℃，5 ℃保持30 min，再從5 ℃升溫至40 ℃，速率均為0.50 ℃/min，應變力為0.50%，頻率為1 Hz。

1.2.6 烏魚魚鱗明膠起泡性的測定 運用T25 分散機以13500 r/min 分散20 mL 2 mg/mL 魚鱗明膠溶液2 min，再將起泡后的溶液倒入50 mL 的量筒中，立即記錄總的樣品體積，起泡能力計算公式如下：

式中：R2表示起泡能力，%；v0表示分散前的體積，mL；v1表示分散后的體積，mL。

1.2.7 烏魚魚鱗明膠乳化活性的測定 根據NAGARAJAN 等[19]的方法并適當修改，具體描述如下。取18 mL 濃度為1%（w/v）的魚鱗明膠溶液和6 mL大豆油混合，運用T25 分散機以9500 r/min 的速度均勻混合1 min。分散完后立即從燒杯底部取100 μL乳濁液，加入5 mL 0.10%（w/v）十二烷基硫酸鈉溶液，混勻10 s 后。立即采用酶標儀在500 nm 波長下測定吸光度（A），計算乳化活性指數，公式如下：

式中：DF 表示稀釋系數，50；ρ表示蛋白質量濃度，10000 g/m3；φ表示油占乳濁液的比例，0.25；I 表示溶液高度，m。

1.2.8 SDS-PAGE 的測定 根據LAEMMLI[20]的方法并適當修改，具體描述如下。使用質量分數為5%的濃縮膠和質量分數為7.50%的分離膠。制備5 mg/mL 的魚鱗明膠樣品，沸水浴10 min，取10 μL上清液上樣。采用直流恒流電源，電壓80 V，電泳時間約2 h。電泳結束后，用考馬斯亮藍R-250 染色30 min，不定時更換脫色液，直至成像清晰，再使用凝膠成像系統對脫色的凝膠進行紫外透射拍照。

1.2.9 FTIR 光譜的測定 根據MUYONGA 等[21]的方法并適當地進行修改，具體描述如下。使用研缽將干燥的魚鱗明膠樣品和光譜級的溴化鉀研磨成粉末混合均勻，裝入壓片模具，抽氣加壓，壓力約為600 kg/cm2，維持3～5 min，得透明樣品片。使用紅外光譜儀的波數在范圍為4000～500 cm-1，數據采集速率為2 cm-1每個點，將獲得的數據以吸光度為y 軸，波數為x 軸繪制成圖。

1.2.10 SEM 的測定 將66.70 mg/mL 的明膠溶液置于4 ℃冰箱保存16～18 h，取出明膠樣品，將不同的樣品切成厚度2～3 mm 的薄片，用2.5%（w/v）戊二醛溶液（pH7.2 的磷酸鹽緩沖液稀釋）固定。將固定好的不同樣品切成方塊，放入-80 ℃冰箱冷凍。將樣品置于樣品盤導電膠上，鍍金。使用掃描電子顯微鏡在低真空模式下放大500 倍拍攝魚鱗明膠的微觀結構。

1.3 數據處理

樣品做3 次平行實驗，結果取平均值，實驗數據通過SPSS 軟件進行分析，選取Duncan’s test 用于顯著性分析，P＜0.05 表示差異顯著；利用Orign 2019進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 提取溫度對烏魚魚鱗表面形貌的影響

脫鈣前后烏魚魚鱗表面形貌見圖1，脫鈣前魚鱗呈粗糙致密狀，這是由于魚鱗表面被羥基磷灰石等無機礦物質所覆蓋。經過脫鈣處理魚鱗表面清晰突出規則排列的紋路，這是由于魚鱗表面鈣質被鹽酸溶出，暴露出了原有的生物結構，且表面結構變得疏松有利于后續明膠的提取[22]。由魚鱗表面形貌顯微圖片可知，魚鱗在不同的溫度下提取，原本規則排列的紋路被破壞，表面出現縱橫交錯的裂痕。60 ℃提取的魚鱗跟脫鈣后的魚鱗相比，魚鱗表面都可以看到清晰的紋理結構，但60 ℃提取的魚鱗表面小部分有裂痕的出現。隨著溫度的提升，魚鱗表面的裂痕進一步加重，規整的條紋結構逐漸破碎呈網狀，到100 ℃提取時，魚鱗表面基本全是裂痕，且裂痕的交錯程度更加密集。

圖1 不同提取溫度下的烏魚魚鱗臨時裝片（100×）Fig.1 Temporary filleting of mullet scales at different extraction temperatures (100×)

2.2 提取溫度對烏魚魚鱗明膠得率的影響

明膠得率是制備明膠的一項重要指標。不同溫度提取對明膠得率的影響見圖2，明膠得率隨溫度的升高而增加，這與黃雯等[23]采用響應面法得到的結果一致。當提取溫度為60 ℃時，明膠得率為31.72%，當提取溫度為100 ℃時其得率升至50.97%。這是因為溫度的升高提供了更多的能量來破壞結合穩定的膠原結構，使原本規整的三螺旋結構彼此松開，肽鏈內部的共價鍵斷裂，更有利于明膠的提取[24]。因此隨著提取溫度的升高，膠原蛋白分子內及分子間的化學鍵斷裂的更多、更徹底，明膠溶出更多，得率升高。

圖2 提取溫度對烏魚魚鱗明膠得率的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on yield of mullet scale gelation

2.3 提取溫度對烏魚魚鱗明膠凝膠強度的影響

凝膠強度是評判魚鱗明膠品質的一個重要指標，與明膠的類型和提取工藝條件有關[25]。不同提取溫度對烏魚魚鱗明膠凝膠強度的影響見圖3，由圖3 可知，提取溫度對明膠凝膠強度有顯著的影響（P＜0.05），隨著提取溫度的升高，凝膠強度呈現明顯的下降趨勢。其中，60 ℃提取的魚鱗明膠凝膠強度最大可達677.82 g，而100 ℃提取的魚鱗明膠凝膠強度僅為372.91 g。明膠的凝膠強度主要取決于α、β肽鏈的含量[26]。因此，明膠凝膠強度的減小可能是由于明膠分子中的α和β肽鏈在加熱過程中逐漸降解。明膠分子與水分子發生氫鍵等非共價相互作用，溫度降低后，明膠溶液形成具有一定網狀結構的膠凝體。明膠分子鏈越長，網狀結構越堅固，相應的膠凝體凝膠強度更大。在高溫下，明膠分子發生降解，分解成更小的短鏈，導致凝膠內部的作用力減弱，結構變得更為疏松，凝膠強度下降[27]。

圖3 提取溫度對烏魚魚鱗明膠凝膠強度的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on gel strength of mullet scale gelation

2.4 提取溫度對烏魚魚鱗明膠流變特性的影響

圖4 展示了不同提取溫度對降溫過程和升溫過程中魚鱗明膠的凝膠以及膠融溫度的影響，其中儲能模量代表的是彈性變化（G'），損耗模量代表的是黏性變化（G''）。圖4A～D 表明，不同提取溫度的G'及G''都呈現出相同的變化趨勢。G'和G''在加熱過程中均減小，在冷卻過程中均增大。隨著溫度的降低，G'和G''曲線變得更陡。特別是G'迅速增加，可能是因為液態單鏈的明膠分子在低溫下逐漸轉化為有序的三螺旋結構形成凝膠[28]。升溫階段則是降溫階段的逆過程，明膠由固態轉化為液態，可以看出魚明膠有很好的溫度可逆性。在圖4A～D 中也可以看出G'和G''都隨著提取溫度的提高而降低，這種變化可能對應于明膠從三股螺旋向單螺旋的轉變，三螺旋結構減弱[29]。

圖4 烏魚魚鱗明膠從40 ℃冷卻至5 ℃的儲能模量（A）和損耗模量（B）及從5 ℃加熱至40 ℃時的儲能模量（C）和損耗模量（D）Fig.4 Storage modulus (A) and loss modulus (B) of mullet scale gelatin upon cooling from 40 ℃ to 5 ℃ and storage modulus (C) and loss modulus (D) of mullet scale gelatin upon heating from 5 ℃ to 40 ℃

此外，在降溫和升溫曲線中G'和G''的交點被定義為凝膠溫度和膠融溫度。60～100 ℃提取溫度下的凝膠溫度分別為20.80、20.70、19.50、18.20、15.80 ℃，膠融溫度分別為28.70、28.30、27.30、25.90、23.90 ℃。隨著提取溫度的升高，明膠的凝膠溫度和膠融溫度也隨之下降且膠融溫度大于凝膠溫度。這可能是高溫使明膠分子形成了更多的短肽，而這些短肽只能在更低的溫度下才能形成凝膠。

2.5 提取溫度對烏魚魚鱗明膠起泡性的影響

泡沫是由分散在液態相中的氣態相組成的，常見的形式是空氣-水界面，這種界面在熱力學上是不穩定的。而在這個界面上擴散、吸附和排列的蛋白質可以作為表面活性劑，蛋白質通過在這個界面形成立體屏障阻止氣泡相互接近，并且降低其表面張力使其在動力學上穩定下來[30-31]。如圖5 所示，不同溫度提取魚鱗明膠的方式顯著地改善了明膠的起泡能力（P＜0.05），60、100 ℃提取溫度下烏魚魚鱗明膠起泡能力分別為23.33%、73.33%，即隨著溫度的升高，魚鱗明膠起泡能力呈現增加的趨勢。這可能是由于在熱力作用下，膠原蛋白之間的化學鍵和肽鍵發生斷裂，形成的膠原蛋白降解片段因疏水作用在氣泡周圍形成更穩定的蛋白質膜[32]。除此之外，隨著提取溫度的升高會導致明膠分子的水解。水解時，疏水基團和可電離基團的釋放會加速蛋白質在空氣-水界面的擴散和吸附[33]。

圖5 提取溫度對烏魚魚鱗明膠起泡能力的影響Fig.5 Effect of extraction temperature on the foaming capacity of mullet scale gelation

2.6 提取溫度對烏魚魚鱗明膠乳化活性的影響

由于蛋白質具有疏水基團和親水基團以及成膜能力，在油-水界面時，蛋白質可以重新排列，分別將表面疏水基團和親水基團定位在油相和水相，形成一層粘彈性薄膜，使油均勻分散在水中形成乳狀液[34]。根據圖6 可知，隨著提取溫度的上升，魚鱗明膠的乳化活性指數普遍呈現增加的趨勢。這可能是隨著提取溫度的升高，蛋白質在受熱過程中會經歷構象的改變，產生大量的肽段，這些肽段能夠快速遷移到油-水界面，并迅速吸附在油滴周圍，顯示出更強的乳化能力[35]。除此之外，溫度的升高，膠原蛋白受熱水解程度也相應增加，水解可以提高蛋白質的溶解度，暴露隱藏的疏水基團，增加其表面疏水性，從而更好地吸附至油-水界面[36]。

圖6 提取溫度對烏魚魚鱗明膠乳化活性的影響Fig.6 Effect of extraction temperature on the emulsifying activity of mullet scale gelation

2.7 提取溫度對烏魚魚鱗明膠分子量分布的影響

由圖7 可知，所有明膠樣品均含三條特征條帶，分別是245 kDa 附近的β鏈，100～135 kDa 之間的α1與α2鏈。在較低溫度下，這三條帶十分明顯，但隨著溫度的升高，這三條帶逐漸模糊。從80 ℃起，這三條帶變得不再清晰，且100 kDa 以下的短肽逐漸增多，可能是較高的溫度導致了明膠分子的降解。有研究表明，明膠凝膠強度與其分子量的分布和氨基酸組成有關，一般高分子量的組分所占比例越大，凝膠強度也越強[37]。本文的SDS-PAGE 結果也證明了為何在80 ℃下制備得到的烏魚魚鱗明膠凝膠強度會大幅下降。此外，70 ℃的凝膠強度也比60 ℃有所降低，圖7 表明，70 ℃的小分子組分有所增加。

圖7 不同提取溫度下的烏魚魚鱗明膠 SDS-PAGE 電泳圖Fig.7 SDS-PAGE electrophoresis pattern of mullet scale gelation at various extraction temperatures

2.8 提取溫度對魚鱗明膠二級結構的影響

由圖8 可知，不同溫度下提取的烏魚魚鱗明膠在4000～500 cm-1范圍內的FTIR 光譜均呈現出相似的光譜形狀和四個酰胺帶吸收峰（酰胺A、酰胺I、酰胺II、和酰胺III）。60、70、80、90、100 ℃提取溫度下的烏魚魚鱗明膠的酰胺A 帶吸收峰波數分別為3436.52、3448.10、3444.24、3434.60、3423.02 cm-1，即整體趨勢是波數先升高后降低。酰胺A 帶（3500～3400 cm-1）是由N-H 基團的伸縮振動所產生的。當N-H 基團參與氫鍵時，吸收峰波數會降低，氫鍵越強，波數越低[38]。隨著溫度的升高，熱力作用會進一步導致明膠分子水解，進一步斷裂為更小的分子[39]，這可能成為增強氫鍵的重要原因。

圖8 不同提取溫度下的烏魚魚鱗明膠FTIR 圖Fig.8 FTIR spectra of mullet scale gelatin at various extraction temperatures

酰胺I 帶出峰位置都在1648.84 cm-1左右，符合酰胺I 帶常見頻率范圍（1700～1600 cm-1），該帶主要是由反對稱羧基或C=O 振動所引起的，是明膠分子具有二級結構的重要因素。在60、70、80、90、100 ℃提取溫度下，烏魚魚鱗明膠的酰胺II 帶吸收峰波數分別為1544.70、1542.77、1540.85、1540.85、1542.77 cm-1。酰胺II 帶（1560～1540 cm-1）主要是由C-N 伸縮和N-H 彎曲振動的耦合[40]。酰胺III 帶（1250～1230 cm-1）是酰胺鍵的CN 伸縮振動和NH變形的組合峰，是由甘氨酸主鏈和脯氨酸側鏈的CH2基團的擺動振動引起的，與膠原蛋白的三螺旋結構完整性有關[41]。60、70、80、90、100 ℃提取溫度下的烏魚魚鱗明膠的酰胺III 帶吸收峰波數均為1240.00 cm-1。

2.9 提取溫度對魚鱗明膠微觀結構的影響

圖9 展示了烏魚魚鱗明膠的微觀結構。一般來說，凝膠基質中蛋白質的構象和鏈長直接影響了明膠的凝膠強度[42]。在60 ℃下提取的明膠，微觀結構比較平整，顯示出非常小的空隙和最精細的凝膠網絡。70 ℃的樣品微觀結構開始存在一些空隙，蜂窩狀的網格更多也更明顯，但彼此間并不相連。80 ℃以及更高溫度下提取樣品的微觀結構，發現了較大的空隙，網格也開始變得不清晰、不平整。低溫下提取的明膠具有較高分子量的鏈，可以更大程度地交聯，凝膠結構更精細，空隙更小，表明水在精細有序的凝膠基質中均勻分布[43]。隨著提取溫度的提高，明膠受熱降解，分子量逐漸下降，小分子量肽段更容易填充于凝膠網絡的孔隙中，形成的網狀鏈更大。因此，這種類型的凝膠無法抵抗施加的力，導致凝膠強度降低。

圖9 不同提取溫度下的烏魚魚鱗明膠微觀結構圖（500×）Fig.9 SEM micrographs of mullet scale gelation at various extraction temperatures (500×)

3 結論

提取溫度能顯著影響烏魚魚鱗明膠的功能性質和結構特性。隨著提取溫度的升高，明膠的得率、乳化活性以及起泡能力逐漸升高，而其凝膠強度、凝膠溫度和膠融溫度逐漸下降。當提取溫度為100 ℃時，烏魚魚鱗明膠得率、乳化活性、起泡能力最好，分別為50.97%、17.27 m2/g、77.33%。但提取溫度為60 ℃時，烏魚魚鱗明膠的凝膠強度、凝膠溫度、膠融溫度最佳，分別為677.82 g、20.80 ℃、28.70 ℃。此外，隨著提取溫度的升高，烏魚魚鱗表面的破損程度逐漸擴大，制得的烏魚魚鱗明膠α1、α2、β鏈三條特征帶逐漸模糊，紅外光譜圖均呈現出相似的四個酰胺帶吸收峰，酰胺A 帶吸收峰波數先升高后降低，掃描電鏡圖中明膠網絡結構的緊密程度降低。高溫破壞了明膠分子的結構，尤其是對特征鏈內共價鍵的破壞，這直接導致了大量小分子肽的產生，而更高比例的小分子肽也正是造成不同提取溫度下明膠功能性質不同的原因。上述實驗結果表明，烏魚魚鱗是一種很有前途的明膠來源，可根據其應用需求采用特定的提取溫度，以提高其市場潛力。本文可為烏魚魚鱗的高值化利用提供理論和技術依據，后續可針對烏魚魚鱗明膠的實際應用進一步開展研究，以提升其應用價值和產業化進程。

? The Author(s) 2024.This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License (https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).