拮抗菌防治葡萄采后病害研究進展

張苗苗，張雨晨，楊怡中，范盈盈，何偉忠，王 成，黃 偉，劉峰娟,*

（1.新疆農業科學院農業質量標準與檢測技術研究所，農業農村部荒漠綠洲生態區特色農產品功能營養與健康重點實驗室（部省共建），農業農村部農產品質量安全風險評估實驗室（烏魯木齊），新疆農產品質量安全實驗室，新疆烏魯木齊 830091；2.新疆農業大學食品科學與藥學學院，新疆烏魯木齊 830052；3.新疆農業科學院微生物應用研究所，新疆烏魯木齊 830000）

葡萄是一種木質藤本植物、隸屬于葡萄科，具有非常高的營養價值，其富含氨基酸、糖、有機酸、維生素等多種營養元素，受到廣大消費者的青睞[1]。中國是全球最大的鮮食葡萄產區，也是大多數地方農業經濟中的支柱產業[2-3]。在采摘、儲藏和出售過程中，因葡萄水分多、皮薄肉軟，含糖量高，極易受到損傷，為病原菌侵染打開通道[4-5]，導致灰霉病、青腐病、葡萄曲霉腐爛病等病害發生[6-7]，造成葡萄采后減產39%左右，經濟價值損失約30%[8]。因此，研究人員開展了大量葡萄采后病害防治的研究，也取得了較好的效果。目前，國內外葡萄貯藏中應用最廣泛的化學殺菌劑以二氧化硫及含硫化合物為主[9]。我國從20 世紀90 年代開始大范圍使用熏硫技術[10]。王鳳超[11]采用200 μL/L 的二氧化硫熏蒸處理無核白葡萄30 min，葡萄未出現漂白損害，且能有效降低果實腐爛率，并能有效控制二氧化硫殘留。但熏硫處理也存在極大的隱患，過剩的二氧化硫氣體揮發到空氣中會引發酸雨、硫酸霧、土壤酸化等環境問題[12]，且食用殘留亞硫化合物的葡萄更會危害人體健康。因此，葡萄采后保鮮急需更環保安全的方法。近年來，生物防治已成為一項綠色的采后水果保鮮技術，它可以有效地抑制病原菌，不會對環境造成污染[13-14]。由此，本文對葡萄采后侵染性病害及癥狀、拮抗菌的來源及應用現狀、作用機制及聯合其他方法結合使用增強生防效果等內容進行綜述，闡述了拮抗菌在應用方面存在的問題并提出未來研究中應該考慮的解決措施，以期為拮抗菌在葡萄采后病害控制中的進一步開發與應用提供借鑒。

1 葡萄采后侵染病害種類及發病癥狀

近年來，葡萄采后侵染性病害的常見病原菌種類繁多，其中包括數十種，如灰葡萄孢菌、黑曲霉、青霉菌、根霉、鏈格孢霉、擬莖點霉等（表1）。低溫條件下優勢菌為灰葡萄孢（重要的低溫致病菌）、青霉；而常溫條件下優勢菌為黑曲霉和根霉[15]；灰葡萄孢、鏈格孢和擬莖點霉能引起各種葡萄發生病害，黑曲霉和青霉常見于巨峰和馬奶子葡萄[16]，根霉腐爛病常見于早中熟葡萄的貯藏。大多數病害初期癥狀表現為葡萄表皮生長白色菌絲，并伴有水漬狀[17-19]，一旦發現此癥狀，提示我們需要采取措施進行控制，如氣調、預冷后轉入低溫環境等。

表1 葡萄采后主要侵染性病害及其癥狀Table 1 Main postharvest infectious diseases and symptoms of grapes

2 拮抗菌的來源

2.1 拮抗酵母菌

葡萄采后病害拮抗酵母菌大多來自葡萄果實和葡萄園土壤（表2），其中以葡萄果實表面來源居多，葡萄表皮的環境適宜酵母菌生長，一些酵母菌對病原菌具有較好的抑菌能力[26]。從葡萄表面分離得到的解脂亞羅酵母Y-2 對根霉腐爛病有顯著抑制作用，腐爛直徑比對照降低了23.8%[27]。葡萄園土壤中含有豐富的營養元素，從而為有益微生物提供了良好的繁殖條件，畢赤酵母屬是葡萄園土壤中的優勢酵母，也是拮抗酵母中的優勢菌屬[28]，對葡萄青霉病有較好的抑菌作用[29]。此外，從其他水果上也篩選到了拮抗酵母，對葡萄采后病害具有明顯的拮抗效果，從蘋果表面篩到的羅倫隱球酵母能有效抑制葡萄采后灰霉病的自然發病率，抑制率高達90%[30]。

表2 防治葡萄果實采后病害主要的拮抗酵母菌Table 2 Main antagonistic yeast for the prevention and control of postharvest diseases of grape fruits

2.2 拮抗細菌

目前文獻中對葡萄灰霉病的拮抗細菌研究較多，來源相對廣泛[37]，葡萄果實以及與葡萄相關的葡萄植株、葉片及葡萄園土壤環境均有所涉及（表3）。葡萄果皮和葉面附生微生物區系中含有大量的微生物，其中細菌的種類和數量在不同生育期均高于真菌和酵母菌數量[38]，而篩選到的拮抗細菌大多數為芽孢桿菌，從葡萄果穗中篩選到了兩株拮抗芽孢桿菌B5和B12，對葡萄灰霉病的防治效果均達到了50%以上[39]。葡萄園根際土壤中芽孢桿菌屬（Bacillusspp.）是優勢細菌屬[36]，從新疆的葡萄園土壤中分離出了暹羅芽孢桿菌，能有效防治葡萄曲霉腐爛病[40]。此外，從其他植株根系也篩選到了拮抗細菌，在橄欖樹根系中分離得到的貝式芽孢桿菌Bvel1 對葡萄灰霉病具有顯著的抑制作用，發病率比對照降低了64.77%[41]。

表3 防治葡萄果實采后病害主要的拮抗細菌Table 3 Main antagonist bacteria for the prevention and control of postharvest diseases of grape fruits

3 拮抗菌在葡萄病害防治中的應用效果

3.1 拮抗酵母菌在葡萄病害防治中的應用效果

3.1.1 單一拮抗酵母菌在葡萄病害防治中的應用效果 拮抗酵母在葡萄主要病害防治中應用越來越多（表4），研究表明拮抗酵母對不同品種葡萄的拮抗效果不同，使用濃度為1×108cells/mL 的解脂亞羅酵母Y-2 分別接種處理夏黑、巨峰和紅提葡萄，與對照相比，三種葡萄的病斑直徑分別降低了28.7%，19.7%和18.5%[27]。對夏黑的自然發病率防治效果更好，夏黑葡萄屬于早熟葡萄，說明解脂亞羅酵母Y-2 更適合早熟品種葡萄的采后病害防治。一般來說，酵母濃度越大，生防效果越好。以1×108cells/mL 濃度的拮抗酵母菌YT-2 處理紅提葡萄，與對照相比，其對黑曲霉的抑制率高達100%[32]，但擬粉紅鎖擲孢酵母Y16 在不同濃度（1×108cells/mL 和1×109cells/mL）下分別處理鮮食葡萄，1×108cells/mL 濃度下果實腐爛率更低（P＜0.05），生防效果更好[46]?？赡苁菨舛仍酱?，酵母所占空間越多，反而不利于酵母的生長?，F有文獻中拮抗酵母的濃度大多采用1×108cells/mL，因此該濃度是拮抗酵母在葡萄體內防治實驗的推薦濃度。

表4 單一拮抗酵母菌在葡萄病害防治中的應用效果Table 4 Application effect of single antagonistic yeast in grape disease control

灰霉病是在低溫環境下更容易產生的病害，低溫下經卡利比克邁耶氏酵母G31887 處理的葡萄灰霉病腐爛率比常溫時降低了24%，表明卡利比克邁耶氏酵母G31887 可以應用于低溫環境下葡萄的保鮮[15]。但是單獨使用拮抗酵母的生物防治效果不穩定，且無法達到與化學殺菌劑相當的水平。與使用0.1%的富馬酸二甲酯相比，單獨使用1×108CFU/mL濃度的季也蒙畢赤酵母菌處理葡萄，自然腐敗率提高了40%左右（P＜0.05），化學防腐劑對酵母和病原菌均有較大抑制作用，拮抗酵母的防腐效力沒有得到發揮[15]。研究人員在評估酵母的拮抗效果時，需要將拮抗酵母的濃度、葡萄的品種、貯藏條件等因素設計于實驗中，考慮到目前鮮食葡萄采用的技術為冷鏈低溫貯運，為了保證酵母在低溫條件下發揮抑菌效果，一方面可以從低溫環境中篩選酵母，另一方面可以采用與助劑復配組成制劑的方法提高其生防效力，延長葡萄采后保鮮的貯藏期。

3.1.2 拮抗酵母菌與其他方法聯合在葡萄病害防治中的應用效果 單一使用拮抗酵母菌防治葡萄采后腐爛效果通常有限，而化學殺菌劑作為葡萄保鮮最主要的方式，長期使用多菌靈、嘧霉胺、唑菌胺酯+啶酰菌胺等又會使灰葡萄孢產生不同程度的抗性[49]。因此，在尋找新的高效拮抗酵母菌株之際，可以使用組合的方式增強拮抗酵母的生物防治效果[50]。

目前文獻中使用化學物質誘導拮抗酵母來提高其抑菌效果的研究較多。使用4 mg/mL 的γ-氨基丁酸（GABA）誘導擬粉紅鎖擲孢酵母Y16（Sporidiobolus pararoseusY16）24 h 后，對葡萄果實進行處理，曲霉腐爛病發病率比對照降低了36.11%，病斑直徑縮小了1.49 mm；采后葡萄在20 ℃貯藏9 d 后，GABA 誘導培養的S.pararoseusY16 的葡萄自然腐爛率為5.56%，顯著低于單一酵母處理組的12.5%[31]。說明經GABA 誘導培養的S.pararoseusY16 不僅可以防治曲霉腐爛病也可以防治葡萄采后其他病害。Esa 等[51]研究表明當用1%殼聚糖預處理24 h后，與對照組相比，葡萄青霉病的發病率降低了10%、病斑直徑縮小了3.4 mm；在低溫和常溫下貯藏9 d后，均能夠顯著提高異常畢赤酵母對于葡萄青霉病的生物防治效果。但有些化學物質卻不宜與拮抗酵母配合使用，如添加焦亞硫酸鈉和甲基托布津會抑制酵母的生長，抑制率接近100%[15]。因此拮抗酵母只有與它本身不產生有毒作用或者影響較小的物質結合使用，才能達到增效的目的。

3.2 拮抗細菌在葡萄病害防治中的應用效果

3.2.1 單一拮抗細菌在葡萄病害防治中的應用效果目前文獻中拮抗細菌對葡萄采后灰霉病的研究較多，葡萄品種以紅地球葡萄和玫瑰香葡萄居多（表5）。假單胞桿菌BHG13 菌株對紅地球葡萄采后灰霉病的防治效果最好，高達68.59%[52]。而伯克霍爾德氏菌B-1 和洋蔥霍爾德氏菌則對玫瑰香葡萄采后灰霉病的抑制效果最好，果梗和果肉的腐爛率分別都下降了69.58%和63.93%[42,54]。同時紅地球葡萄和玫瑰香葡萄都屬于果皮較厚的品種，表明大多拮抗細菌更適合厚皮葡萄的采后病害防治。當貝式芽孢桿菌Bvel1 的使用濃度為1×108CFU/mL 時，對紅地球葡萄采后灰霉病的防治率為64.77%[41]，比使用濃度為1×106CFU/mL 高出9%（P＜0.05）。隨著拮抗細菌濃度的升高，防治效果也隨之增強。

表5 單一拮抗細菌在葡萄病害防治中的應用效果Table 5 Application effect of single antagonistic bacteria in grape disease control

雖然利用拮抗細菌防治葡萄采后灰霉病取得了一定的效果，但在后續實際生產應用仍具有較大的挑戰，尤其是制劑加工及其對葡萄采后的抑菌效果。枯草芽孢桿菌BS2 粉劑發酵7 d 后，芽孢桿菌的含量不再變化，保持在1.56×1011個孢子/g，但保存6 個月后含量降低到0.53×1011個孢子/g[53]，對葡萄灰霉病防治效果不穩定且在實際生防應用中并不持久。枯草芽孢桿菌B579 粉制劑的有效活菌數為3.0×1011CFU/g，有效期可以達到7.2 個月[38]。說明制劑劑型會顯著影響其抗菌效果，在做相關研究時，應該測試不同助劑對拮抗菌劑的影響，既要延長保存時間，又要維持較高的拮抗效果。

3.2.2 拮抗細菌與其他方法聯合在葡萄病害防治中的應用效果 針對單一拮抗細菌在抑菌方面的局限性，采用兩種及兩種以上的拮抗細菌復合處理，可以達到在功能上相互補充，同時防治多種病害，效果持久協同控制的目的[57]。當使用內生熒光假單胞菌CT2 與聚群泛球菌AF2 兩菌株聯合處理葡萄時，對灰霉病的抑制率最高，發病率降低約93%[58]。離體條件下，菌株GLB191 和GLB197 的發酵原液聯合使用處理葡萄，腐爛抑制率比單一處理組分別提高了15.41%和17.98%；在葡萄果實成熟期和采收期，兩菌株發酵液聯合處理的防效為55.02%和70.20%，與化學藥劑的防效相當，藥劑組防效為48.57%和71.78%[47]。由此提示可以在采前使用復合拮抗細菌處理葡萄，從而提高葡萄采后抑菌能力。此外，與某些化學物質結合也可提高拮抗細菌對于葡萄采后病害的防治效率，當芽孢桿菌QST713 和普魯蘭芽孢桿菌DSM14940 與殺菌劑氟吡蟲啉交替混合使用，對葡萄灰霉病的防治效果可達96%[50]。

鹽城地區三麥面積常年穩定在550-600萬畝，根據農業區劃，分屬里下河農業區（含射陽河上游平原區、中部低洼圩區、串場河西平田區和射陽河蕩田區四個二級區）、沿海農業區（含射陽河下游平田區、沿海墾區和堤東平田區三個二級區）和徐淮農業區（包含沙土平田區和淤土平田區兩個二級區）。

雖然采用拮抗細菌組合的方法防治葡萄采后病害被認為是一種更實際、有效的生物防治策略，但此方法在使用上也存在一定局限性?；旌鲜褂玫膬删曛g互作關系若是親和的，則混合使用可以達到增效的目的[59]，反之則相反，假單胞菌屬、歐文氏菌屬、短小桿菌屬三種細菌的混合液對黃瓜枯萎病的生防效果較差，是陽性對照藥劑的50%左右[60]。因此研究者需要通過體外實驗確定拮抗細菌之間無寄生、競爭和溶解互斥關系，并在體內測試中觀察到與體外實驗一致的結果。

4 拮抗菌防治葡萄采后病害的主要機理

通過對拮抗菌作用機理的深入研究，可為其制定預防藥物、使用方法和定向改造策略提供理論基礎。在外部環境條件的影響下，拮抗菌、病原菌和寄主三個方面之間的相互作用，形成了多種機制的綜合效應，從而導致了每種拮抗菌拮抗效果的產生。Wisniewski 等[61]通過圖表展示了這種相互作用的關系。經對比分析，果蔬采后病害生物防治主要采用的拮抗作用機理為：抗生作用、競爭作用、重寄生作用和抗性誘導。

4.1 抗生作用

用于生物防治的眾多拮抗菌都能產生抑制病原菌生長的抗生素，而用于采后病害生物防治的拮抗菌主要是以分泌抗菌素的方式發揮作用。Nifokas 等[41]的實驗結果表明菌株Bvel1 含有13 個抗菌生物合成基因簇，包括伊藤素A、表面活性素、桿菌素、膽小霉素等，菌株Bvel1 能有效抑制受損葡萄體內灰霉病的侵染和擴散，其在受傷葡萄中表現出足夠的定殖效率。Li 等[62]體外實驗結果表明，枯草芽孢桿菌K1 能顯著抑制灰霉病菌菌絲的生長，抑制率達到78.42%±1.23%。同時基因分析顯示，枯草芽孢桿菌K1 染色體含有許多已知的生物合成基因簇，如編碼枯草菌素、硅藻烯、芽孢桿菌素和風霉素等。陰溝腸桿菌S6 存在不同的次生代謝產物基因簇，包括芽孢桿菌素、風霉素、表面素和桿菌素，以及非核糖體肽合成酶和細菌素[45]，其能夠限制病原菌的發展，對灰霉病菌菌絲生長的抑制率達到37%左右，并顯著減少與灰葡萄孢屬相關的壞死。

紅酵母能夠分泌抑制霉菌的酵母酸，酵母酸能鰲合鐵離子，使病原菌缺少鐵元素而死亡。陳瑩瑩等[63]研究表明灰葡萄孢菌被C4H10O2、C4H8O2和C5H10O2等揮發性物質熏蒸48 h 時，菌絲生長勢明顯受阻，抑制率高達72.41%，其產孢量始終低于空白組（P＜0.05）。李貞景等[64]研究發現6.0 g TD-1 菌株麥麩培養物產生的二甲基異冰片和1,4-二甲基金剛烷等揮發性物質對灰霉孢菌的抑菌率為66.67%，灰霉孢菌的產孢量（3.9×106個/cm2）較空白組（5.9×107個/cm2）顯著降低（P＜0.01）。張迪[65]檢測到異常威克漢姆酵母產生的Styrene 對于葡萄灰霉病菌菌絲有明顯抑菌作用，導致灰霉病菌菌絲體的扭曲和畸形。采用雙板法檢測表明枯草芽孢桿菌K1 的揮發性物質鄰苯二甲酸二丁酯顯著抑制了灰葡萄球菌的生長，抑制率達到83.32%±1.84%[43]。高全等[66]發現草果揮發油中桉油醇對葡萄灰霉病菌的抑菌活性最顯著，EC50值為235.30 mg/L，且活體試驗證明，當質量濃度為500 mg/L 時，草果揮發油對葡萄灰霉病的防治效果為76.51%。

4.2 競爭作用

許多酵母菌和類酵母菌都通過相互抵消對方的營養來保護它們免受侵害。酵母菌的一個顯著的優勢在于它們能夠迅速地增加它們的數量，從而獲得更多的營養來滿足它們的生存需求[67]。拮抗酵母菌可在短時間內快速利用果實皮孔、傷口處的低營養物質，迅速繁殖，最終占領全部生長空間。康萍芝等[68]明確了木霉菌主要是通過快速繁殖與病菌競爭營養和生存空間以及重寄生作用達到抑菌效果，尤其是康氏木霉表現出了很強的競爭優勢，抑菌率達61.8%～77.6%。Lucia 等[69]的研究證明對鐵的競爭以及形成生物膜和定殖果實傷口的能力是異常威克漢姆酵母（M.pulcherrima）的主要作用機制。當細胞懸浮液濃度為3×108CFU/mL 時，異常威克漢姆酵母對灰霉病菌有顯著抑制作用，抑制效果最佳[65]。實驗結果表明Y.lipolytica接種于葡萄果實傷口處，在20 ℃或4 ℃中存放4 d 后，該酵母菌能夠快速利用葡萄傷口處的營養物質，長時間在傷口處定殖和大量繁殖，保持較高酵母菌數量[34]。有研究發現用芽孢桿菌Bvel1 細胞培養處理受損葡萄果實時，菌落數量迅速增加從1.09 lg CFU/創面增加到2.91 lg CFU/創面，接種4 d 后達到最大種群數為3.50 lg CFU/葡萄，表現出了足夠的定殖效率，可有效控制灰霉病在體內的侵入和蔓延[41]。無論是接種還是浸泡處理，熒光假單胞菌都能在葡萄果實上快速生長定殖，消耗營養，搶占生態位點，從而抑制B.cinerea的生長[70]。

4.3 重寄生作用

4.4 抗性誘導

有些拮抗菌可誘導果蔬合成與抗性提高有關的物質。如添加假絲酵母（Candida oleophila）細胞懸浮液的葡萄果皮組織能夠更多的合成乙烯，積累苯丙氨酸氨基裂解酶，從而誘導宿主產生抗性[34]。酵母菌誘導寄主提高超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）等抗性相關酶類的活性，增強寄主對病蟲害、高溫的抵抗能力[74]。肖金瑋[31]的研究表明在以γ-氨基丁酸（GABA）為激發子誘導培養的S.pararoseusY16 相比S.pararoseusY16 單獨處理對葡萄采后黑粉病具有更好的控制效果。Li 等[62]實驗表明在接種芽孢桿菌K1 后，葡萄中誘導了更高水平的防御相關酶，包括POD、PPO 和苯丙氨酸解氨酶（PAL）。Qiao 等[46]通過基因水平驗證經S.pararoseusY16 處理提高了鮮食葡萄PPO、CAT、PAL 和抗壞血酸過氧化物酶（APX）的活性。經洋蔥霍爾德氏菌處理可提高葡萄果實PAL、POD、SOD 和PPO 的活性，促進過氧化氫（H2O2）含量積累，延緩CAT 活性峰值出現的時間[52]。Zhou 等[55]發現淀粉芽孢桿菌NCPSJ7 誘導的GLU 活性（136.04 U/g FW）高于CK 組（128.58 U/g FW），高于單獨接種病原菌組（127.18 U/g FW），表明拮抗細菌NCPSJ7 可以誘導果實對病原菌產生抗性。Esa 等[51]發現單用畢赤酵母或用1% w/v 的殼聚糖誘導食用葡萄采后處理，可提高葡萄果實中PPO、POD、PAL、CAT 的活性和總酚的含量。Wu等[35]發現PulcherrimaT-2 處理后顯著提高POD、CAT、PAL 等抗氧化酶活性，同時總酚和黃酮類化合物含量及代謝途徑關鍵酶基因的表達水平均有所升高。

5 總結與展望

利用拮抗菌進行生物防治，有望取代傳統的化學殺菌劑，成為應對葡萄采后病害的一種綠色環保的方法。盡管目前已經成功地篩選分離出多種有效防治葡萄采后病害的拮抗細菌和酵母，但較難達到與化學保鮮劑相當的防效，在應用方面也存在一些問題：一是研究中大多使用從葡萄生長相關的自然環境中篩選獲得的拮抗菌來防治葡萄采后病害，防治效果有限；二是拮抗菌制劑保存條件嚴格且抗菌活性不穩定；三是拮抗菌與其他方法聯合防治時，對拮抗菌耐受物理、化學及生物條件要求較高，加大了測試工作量；四是拮抗菌應用于葡萄時需要考慮其安全性，保障人體健康安全。

隨著我國葡萄產業的蓬勃發展，對葡萄采后保鮮技術的深入研究已成為當務之急，尤其是對于環保安全的生物防治技術的探索和研究，更是至關重要。未來對拮抗菌應用于葡萄貯藏保鮮方面的研究應考慮以下幾點：a.可從特殊環境（如冰川、沙漠、古樹林等）中篩選拮抗菌，一方面其產生的新的代謝產物可能會提高防治效果，另一方面也將提高其聯合防治的耐受力；b.開發新型的拮抗菌制劑加工技術，最大程度保留其活性抑菌成分，延長保存期，提高防治效果；c.可將拮抗菌與采后物理技術（如冷庫保存、熱處理、氣調保鮮等）間隔一定時間交替處理葡萄，避免同時處理降低拮抗菌的抗菌活性；d.需要將拮抗菌納入小鼠急毒性試驗，觀察是否對其生長存在不利現象，以此確定拮抗菌的安全性，用于后續開發并應用于葡萄采后病害防治。

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