大球蓋菇腐敗真菌的分離、鑒定及生長特性研究

劉鑫燕，李占峰，彭幫柱,

（1.華中農業大學食品科學技術學院，湖北武漢 430000；2.漯河微康生物科技有限公司，河南漯河 462300）

大球蓋菇（Stropharia rugosoannulata），又稱皺環球蓋菇和酒紅大球蓋菇，屬于擔子菌門，層菌綱，傘菌目，球蓋菇科，球蓋菇屬[1-2]，因其廣泛的藥用價值，被稱為“山中珍品”[3]。大球蓋菇作為我國食用菌產業的后起之秀，2010 年在我國產量為4.74 萬噸，到2020 年增長到了20.10 萬噸，2021 年產量約28.75萬噸[4]。

有研究表明，在杏鮑菇、平菇和香菇貯藏過程中均檢測到酵母菌和霉菌，且平均計數分別為3.2 和3.4 log CFU/g[5]。Santana 等[6]發現香菇在儲藏過程中的致腐微生物為霉菌、假單胞菌、嗜溫菌及酵母。姜天甲[7]發現平菇和金針菇易受霉菌和酵母菌的侵染腐敗而失去商品價值。朱曉玲[8]對二次培養后受霉菌污染的香菇菌塊進行分離純化，得到木霉屬、短密青霉（Penicillium brevicompactum）和總狀毛霉（Mucor racemosus）。馮智紅[9]和崔麗紅[10]在香菇和香菇菌棒上分離到不同種類的鐮刀菌、曲霉和根霉。蘭玉菲等[11]在罹病香菇菌棒中曾發現七種曲霉和米根霉（Rhizopus oryzae）。由此可見，不同種類的食用菌其優勢腐敗菌各不相同，霉菌占比較多。其中曲霉和根霉是食品發酵工業中常用的菌種，在腐敗變質的食用菌中也經常發現該菌[12]。此外，鐮刀菌也是一個龐大而復雜的屬，可引起多種植物疾病，產生單端孢霉烯族毒素類等真菌毒素，并日益被認為是一種重要的人類病原體[13]，易對人體健康造成危害。

目前國內外針對大球蓋菇腐敗菌的分離、鑒定研究較少。因此，為了解大球蓋菇在貯藏時的優勢腐敗真菌，預防和控制大球蓋菇在貯運過程中發生腐敗問題，本文將儲藏至腐敗的新鮮大球蓋菇用傳統培養方法與ITS 測序及分析方法對腐敗菌進行分離、純化和鑒定，篩選出優勢腐敗菌并研究其生長特性，以期為后續抑制腐敗菌的生長繁殖及大球蓋菇的貯藏保鮮提供一定的參考價值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大球蓋菇 湖北省武漢市蔡甸區蘑菇蜀黍食用菌基地和河南省洛陽市智慧食用菌產業園提供；馬鈴薯葡萄糖培養基（PDA）、馬鈴薯葡萄糖水培養（PDB） 青島高科技工業園海博生物技術有限公司；Tris-酚 上海鈺博生物科技有限公司；氯仿、75%酒精、異戊醇 分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

DEM 生物顯微鏡 上海萊卡顯微系統有限公司；ABI 2720 PCR 儀 上海普迪生物技術有限公司；HZQ-F160 生化培養箱 太倉市華美生化儀器廠；GYMJ-436 高壓滅菌鍋 上海東亞壓力容器制造有限公司；SCI-VS 漩渦混合器 寧波新芝生物科技股份有限公司；D1008E 小型離心機 大龍興創實驗儀器（北京）股份公司；96 孔核酸提取儀 武漢納磁生物科技有限公司；NanoDrop 8000 超微量分光光度計 賽默飛世爾科技公司；DYY-6C 電泳儀 北京六一生物科技有限公司；GelDocTMXR+紫外分析儀伯樂生命醫學產品（上海）有限公司；3730xl 測序儀 美國應用生物系統中國公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 大球蓋菇腐敗時間的確定 將兩批產地不同（湖北武漢、河南洛陽）的新鮮大球蓋菇同時放入消毒后的聚乙烯塑料保鮮盒中，于4 ℃條件下敞口保存，通過感官評價來確定大球蓋菇的腐敗時間點。感官評價小組針對大球蓋菇的氣味、色澤、菌蓋和菌柄形態打分，并對腐敗特征進行描述，最后計算平均分。當任一指標評分低于5 分為感官接受臨界點，低于5 分表示該樣品感官品質不可接受[14-15]。參考商立超[16]的方法，制定了感官指標評價標準表（表1）。

表1 大球蓋菇感官評定標準Table 1 Evaluation criteria for the sensual sense of S. rugosoannulata

1.2.2 大球蓋菇腐敗菌的分離與純化 參照牛耀星[17]的方法并略作修改。取大球蓋菇腐敗組織接種于PDA 培養基上，放入26 ℃培養箱中培養3～5 d。挑取具有代表性的菌落邊緣菌絲接種到新的PDA 培養基上培養，重復2～3 次以確保得到純化菌株。

1.2.3 大球蓋菇腐敗菌的鑒定

1.2.3.1 致腐性分析 參照王瑩[18]的方法并略作修改。按照柯赫準則進行返接試驗以驗證菌株的致腐能力。用直徑為5 mm 的打孔器取腐敗菌菌絲塊，分別在新鮮大球蓋菇的菌柄和菌蓋處接種，于26 ℃培養箱中培養，觀察接種處的變化。每組處理設3 個重復，另設不接種菌株的大球蓋菇作為對照。在培養5 d 后觀察每組大球蓋菇的腐敗情況、腐敗速度及腐敗癥狀，并按照1.2.2 的方法在子實體腐敗處分離純化腐敗菌，與所接種菌株進行比較，判斷接種菌株是否為大球蓋菇的優勢腐敗菌。

1.2.3.2 形態學鑒定 將優勢腐敗菌接種于PDA 平板上，于26 ℃下恒溫培養，待長出菌落后對菌落形態、質地、正反顏色等性狀進行觀察。在倒置顯微鏡下觀察菌絲、孢子梗、產孢結構、孢子的形態和大小，記錄觀察結果并拍照，根據《真菌鑒定手冊》[19]對真菌進行形態學鑒定。

1.2.3.3 分子生物學鑒定 將純化后的菌株送至武漢天一華煜基因科技有限公司，委托公司測序鑒定。主要操作步驟如下：a.DNA 提取：采用CTAB 方法提取菌絲DNA，電泳檢測合格后于-20 ℃冰箱中保存待用。b.PCR 擴增：分別使用真菌rDNA ITS 的通用引 物ITS1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’）、ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）對菌株進行PCR 擴增。PCR 反應體系及程序見表2。為確保PCR 擴增的特異性，將擴增完成后的PCR 產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測（1%濃度），通過帶型來判斷各樣本擴增產物的特異性。c.DNA 測序：將條帶符合標準的PCR 產物送Sanger 測序。處理后的序列 在NCBI 數據庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov.）中進行BLAST 分析，比較其同源性。d.系統發育樹的構建：將測得的ITS 序列與GenBank 數據庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank）中已有的ITS 序列進行比對，將同源性＞97%的物種名稱、基因登錄號和序列號保存。利用軟件MEGA5 中的鄰接法（Neighbor-joining）構建系統發育樹，通過自展法（Bootstrap）檢驗，重復次數為1000 次。

表2 PCR 反應體系和循環條件Table 2 PCR reaction system and cycling conditions

1.2.4 大球蓋菇腐敗菌的生長特性研究

1.2.4.1 腐敗菌生長曲線的繪制 采用干重法[20-21]測定腐敗菌的生長曲線。在無菌條件下制備優勢腐敗菌的孢子懸液，并將其濃度調為106CFU/mL。取1 mL 接種于200 mL PDB 培養液中，在26 ℃、180 r/min 恒溫箱中培養，于4 ℃，10000 r/min 下離心20 min，將沉淀放入105 ℃干燥箱中烘干至恒重，記錄菌絲干重。每種腐敗菌做3 個平行，每隔12 h測一次，直至達到腐敗菌的穩定期。

1.2.4.2 不同培養溫度對菌絲生長的影響 參照石浩[22]的方法并略作修改。將直徑為5 mm 的菌餅接種于PDA 培養基中，設置4、5、10、15、20、25、28、30、35 ℃不同溫度，于不同溫度下培養5 d，每個處理重復3 次。采用十字交叉法測量菌落直徑，記錄菌絲密集度并計算菌絲生長速率。

1.2.4.3 不同pH 對菌絲生長的影響 參照石浩[22]的方法并略作修改。分別將PDA 培養基的pH 調整為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0、13.0。將直徑為5 mm 的菌餅分別接種于PDA 培養基中，于26 ℃下培養5 d，每個處理重復3 次。采用十字交叉法測量菌落直徑，記錄菌絲密集度并計算菌絲生長速率。

1.2.4.4 腐敗菌致死溫度的測定 參照丁仁惠等[23]的方法并略作修改。將直徑為5 mm 的菌餅置于裝有5 mL 無菌水的離心管中并分別放入50～65 ℃（溫度梯度為5 ℃）的恒溫水浴鍋中處理30 min，迅速冷卻后接種在PDA 培養基中，以未經處理的菌絲塊接種于PDA 培養基中作為空白對照，于26 ℃下培養5 d，每個處理重復3 次。采用十字交叉法測量菌落直徑，記錄菌絲密集度并計算菌絲生長速率和菌絲抑制率（MGI）。菌絲生長速率及MGI 計算公式如下：

1.3 數據處理

所有試驗均做3 次平行，使用Microsoft excel 2019 整理數據，Origin 2021 軟件作圖，IBM SPSS Statistics 26 進行方差分析，Duncan’s 法進行顯著性分析，P＜0.05 為顯著性差異判別標準，實驗數據用“平均值±標準差”表示。

2 結果與分析

2.1 大球蓋菇腐敗時間的確定

大球蓋菇的感官評價如圖1 所示。貯藏于4 ℃的大球蓋菇在第8 d 時，除質地外，其他指標的感官評分均低于5，判斷腐敗時間為8 d。此時菌蓋開傘明顯，組織稍微軟化，表面略微發黏并產生輕微異味。譚志勇等[24]報道稱，貯藏于4 ℃冷庫的雞腿菇在第6 d 時各項指標正常，8 d 后菌蓋開始軟化、開裂，但無異味，12 d 后菌蓋頂部開始變黑并伴有明顯異味。姜紅波[25]研究發現茶樹菇在5 ℃下貯藏8 d后便出現腐敗現象。本研究結果與上述結果接近。

圖1 大球蓋菇的感官評價雷達圖Fig.1 Ragar map of S. rugosoannulata sensory evaluation

2.2 大球蓋菇腐敗菌的分離與鑒定

通過傳統培養對兩批產地不同（湖北武漢、河南洛陽）的大球蓋菇進行腐敗菌的分離，共得到75 個菌株。其中鐮刀菌屬16 株、曲霉屬14 株，根霉屬4 株。通過致腐性分析，取其中致腐性較強的菌株進行形態學鑒定和分子生物學鑒定。

2.2.1 致腐性分析結果

2.2.1.1 子實體回接 將得到的菌株回接至健康的大球蓋菇子實體上，其對大球蓋菇子實體的生長影響如圖2 所示。回接試驗結果表明，其中四種菌株對大球蓋菇具有較強的致腐性，分別命名為X、Q、C 和A。健康的大球蓋菇子實體接種X 后，菌蓋處會產生凹陷，菌柄和菌蓋均產生白色腐爛病斑，并呈現水漬狀，組織軟爛；接種Q 后，菌柄和菌蓋嚴重黑化，5 d 后子實體逐漸變黑，接種處出現明顯凹陷且表面變得濕潤，滲出黑色惡臭味汁液；接種C 后，菌蓋和菌柄表面均出現稠密的白色菌絲，5 d 后菌絲開始蔓延至整個菌蓋；接種A 后，菌蓋、菌柄處出現明顯的腐敗現象，菌蓋收縮并產生腐敗汁液，菌柄處產生淡黃色病斑。而對照組中的大球蓋菇除了菌體表面顏色稍微加深外，并無其他癥狀，菇體質地保持不變，無異味和汁液滲出。

圖2 健康子實體菌柄、菌蓋接種菌絲塊后的生長情況Fig.2 Growth of healthy fruiting body stalks and caps inoculated with mycelium block

2.2.1.2 回接后腐敗菌的分離與對比 回接前后腐敗菌菌落形態對比如圖3 所示。結果證實上述四種腐敗菌對大球蓋菇子實體均有強烈致腐性。經過形態學鑒定，發現由回接致腐的子實體中分離、純化得到的腐敗菌（圖3x、q、c、a）與回接前的腐敗菌（圖3X、Q、C、A）一致，確定上述四種腐敗菌為大球蓋菇的優勢腐敗菌。

圖3 回接前后分離腐敗菌菌落形態對比Fig.3 Comparison of colony morphology of spoilage fungi before and after re-inoculation

2.2.2 形態學鑒定結果 腐敗菌的菌落形態圖和顯微鏡觀察圖如圖4 和圖5 所示。菌株X 在PDA 培養基平板上培養5 d，菌落中央產生密集的白色棉絮狀氣生菌絲，呈放射狀蔓延至整個平板。菌落背面呈淡黃色。菌株多產生小型的無色分生孢子，多為卵形、橢圓形的單細胞，偶見雙胞；大型分生孢子多為3～5 分隔，兩端尖細彎曲，呈鐮刀形、紡錘形等。初步推測菌株X 屬于半知菌亞門，絲孢綱，瘤座孢目，瘤座孢科，鐮刀菌屬。

圖4 X，Q，C，A 四種腐敗菌菌落形態Fig.4 Colonial morphology of four spoilage fungi X,Q,C,A

圖5 X，Q，C，A 腐敗菌顯微形態觀察Fig.5 Microstructure morphology of spoilage fungi X,Q,C,A

菌株Q 在PDA 培養基平板上培養5 d，菌落生長迅速，出現青褐色菌叢，表面平滑或粗糙。菌落背面呈褐色。菌絲結構復雜，具有多個分枝，是一種具有隔膜的多核多細胞真菌。其厚實的足細胞形成的分生孢子梗頂端膨大，呈囊狀。雙層小梗從泡囊表面或頂部呈放射狀生出，其頂端分布有串狀或“菊花”狀的青褐色分生孢子。初步推測菌株Q 為半知菌亞門，絲孢綱，絲孢目，叢梗孢科，曲霉屬。

菌株C 在PDA 培養基平板上培養5 d 后，形成初為白灰色后為灰褐色的菌落。菌落可以快速覆蓋平板表面，呈“棉花糖”狀生長。菌落背面呈白色。菌絲體稠密，產生無色匍匐菌絲。假根分布錯綜復雜，較發達。孢囊梗略微彎曲，其頂端有時膨大為球形或橢圓形的泡囊，有時產生褐色分枝。孢子囊和胞囊孢子均呈球形或近球形，老后呈暗褐色。可見大量形狀、大小不一的厚垣孢子，無接合孢子。初步推測為接合菌亞門，接合菌綱，毛霉目，毛霉科，根霉屬。

菌株A 在PDA 培養基平板上培養5 d，菌落生長緩慢，一開始呈白色，慢慢變成綠色，且中間夾雜淡黃色菌叢。菌落背面呈橘黃色。菌落直徑為2～4 cm，表面粗糙，邊界呈圓弧狀，中間凸起。菌絲有橫隔，頂端產雙輪或單輪掃帚狀的分生孢子梗。菌株產生的分生孢子呈球形或卵形，直徑為2.5～3.5 μm。初步推測為子囊菌亞門，不整囊菌綱，散囊菌目，散囊菌科，青霉屬。

以上僅是根據形態學鑒定方法推測所得結果，無法準確判斷該菌的種類，故需進一步進行分子生物學鑒定。

2.2.3 分子生物學鑒定結果

2.2.3.1 PCR 擴增 從四種純化的腐敗菌中提取DNA 后，以真菌ITS 通用引物進行PCR 擴增，最終在2000 bp 附近檢測到單一且明亮的條帶，達到PCR 擴增預期結果。腐敗菌ITS 區的凝膠電泳結果如圖6 所示。

圖6 腐敗菌ITS 區的凝膠電泳圖Fig.6 Gel electrophoresis of the ITS from spoilage fungi

2.2.3.2 系統發育樹的構建 將已進行PCR 產物測序得到的腐敗菌基因序列與NCBI 數據庫中的脫氧核糖核酸序列進行比對，選擇與測序腐敗菌基因序列相似度最高（＞97%）的真菌，作為該菌株在分子生物學上的歸類，并記錄其基因登錄號。四種腐敗菌的比對結果如表3 所示，通過鄰接法構建系統發育樹如圖7 所示。結果進一步表明，腐敗菌株X 與鐮刀菌屬（Fusariumsp.）的親緣關系最近，Q 與曲霉屬（Aspergillussp.）的親緣關系最近，C 與根霉屬（Rhizopussp.）的親緣關系最近，腐敗菌株A 與藍狀菌屬（Tala-romycessp.）的親緣關系最近，結合其形態特征與ITS 序列鑒定的結果，確定菌株X 為假嗜花鐮刀菌（Fusarium pseudoanthophilum），菌株Q 為黑曲霉（Aspergillus niger），菌株C 為單孢根霉菌（Rhizopus azygosporus），菌株A 為產紫藍狀菌（Talaromyces purpureogenus）。

圖7 X，Q，C，A 的系統發育樹Fig.7 Phologenetic tree of X,Q,C,A

表3 真菌鑒定結果Table 3 Identification results of fungus

2.3 大球蓋菇腐敗菌的生長特性研究

2.3.1 腐敗菌的生長曲線 大球蓋菇腐敗菌的生長曲線如圖8 所示。其中X 假嗜花鐮刀菌、Q 黑曲霉和C 單孢根霉菌在0～12 h 內菌絲干重并無顯著差異（P＞0.05），處于生長遲緩期；24～120 h 的菌絲干重顯著上升（P＜0.05），為生長快速期；132 h 后的菌絲干重無顯著差異性（P＞0.05），進入生長停滯期。這是因為隨著菌體細胞的快速生長，培養基內營養物質被逐步消耗，菌體的生長速率與死亡速率達到動態平衡。而A 產紫藍狀菌生長緩慢，在0～36 h 內菌絲干重無顯著性差異（P＞0.05），處于生長遲緩期；36～84 h 呈顯著上升趨勢，生長速率快，菌絲干重從0.02 g 增至0.20 g，為生長快速期。隨著時間增加，菌絲干重開始下降但無顯著差異，菌體逐步進入生長停滯期。

圖8 大球蓋菇腐敗菌的生長曲線Fig.8 Growth curves of spoilage fungi in S.rugosoannulata

2.3.2 腐敗菌最適生長條件研究

2.3.2.1 不同培養溫度對菌絲生長的影響 不同培養溫度對大球蓋菇腐敗菌菌絲生長的影響如表4 所示。當溫度為4～10 ℃時，大球蓋菇四種腐敗菌生長緩慢，高于10 ℃后，腐敗菌菌絲生長速率逐漸增加。當溫度為28 ℃時，四種腐敗菌的生長速率達到最大，分別為11.33 mm/d（X 假嗜花鐮刀菌），11.27 mm/d（Q 黑曲霉），11.51 mm/d（C 單孢根霉菌）和11.49 mm/d（A 產紫藍狀菌）。繼續增大培養溫度，相較于28 ℃，四種腐敗菌的生長速率在30 ℃時略微下降，在35 ℃時下降明顯，分別下降60.48%（X 假嗜花鐮刀菌），13.89%（Q 黑曲霉），16.05%（C 單孢根霉菌）和13.74%（A 產紫藍狀菌）。四種腐敗菌的菌落直徑由28 ℃時的最大直徑（84.30、83.91、85.60 和85.45 mm）降至54.44、70.44、73.71和73.71 mm，分別下降35.12%（X 假嗜花鐮刀菌），17.71%（Q 黑曲霉），13.90%（C 單孢根霉菌）和13.74%（A 產紫藍狀菌）。表明在低溫4～10 ℃和高于35 ℃下會抑制腐敗菌的生長繁殖。

表4 不同培養溫度對大球蓋菇腐敗菌菌絲生長的影響Table 4 Effects of different temperatures on mycelial growth of S. rugosoannulata

2.3.2.2 不同pH 對菌絲生長的影響 不同pH 對大球蓋菇腐敗菌菌絲生長的影響如表5 所示。四種腐敗菌菌絲在pH 為5.0～12.0 的培養基上均可生長，當pH 增大到13.0 時生長則會受到抑制。這是因為強堿環境下，真菌細胞膜及其電荷狀態發生改變，抑制了真菌對營養物質的吸收[26]。X 假嗜花鐮刀菌在pH 為7.0～8.0 時生長最快，菌絲稠密，菌絲生長速率最高達到9.82 mm/d，菌落直徑最大達到73.75 mm。藍江林等[27]和秦涵淳等[28]的研究結果表明尖孢鐮刀菌菌落生長的適宜pH 范圍很寬，在5.0～8.0 范圍內均可以生長，pH 為7.0 時最適。該結論與本研究結果相似。A 產紫藍狀菌和Q 黑曲霉分別在pH 為6.0、7.0 時生長最快，生長速率最高分別達到9.19和11.45 mm/d，菌落直徑分別達到69.39 和85.15 mm。C 單孢根霉菌在pH 為8.0～9.0 時生長速度最快，生長速率最高達到11.48 mm/d，菌落直徑最大達到85.33 mm。而當pH 為13.0 時，四種腐敗菌幾乎不生長。綜上，大球蓋菇腐敗菌菌絲適合在中堿性環境尤其是pH 為7.0 左右時生長，而在強堿性環境下生長緩慢。

表5 不同pH 對大球蓋菇腐敗菌菌絲生長的影響Table 5 Effects of different pH on mycelial growth of S. rugosoannulata

2.3.2.3 致死溫度分析 該試驗使腐敗菌在較高溫度下保持一定時間后探究不同腐敗菌的致死溫度。由于大部分真菌菌種的致死溫度在50～100 ℃之間[21]，因此本試驗將起始溫度設定為50 ℃，以5 ℃為一個溫度梯度，共設置4 個梯度。不同致死溫度對腐敗菌的生長影響如表6 所示。當溫度為60 ℃時，四種腐敗菌均受到較大程度的抑制，其中C 單孢根霉菌的菌絲抑制率達到了95.98%，菌落直徑僅為6.65 mm。X 假嗜花鐮刀菌的菌絲抑制率達到了99.51%，菌落直徑僅為接種菌餅的5 mm。在65 ℃水浴處理30 min 后，四種菌均死亡。因此，可以確定大球蓋菇優勢腐敗菌的致死溫度為60～65 ℃。

表6 大球蓋菇腐敗菌的致死溫度Table 6 Lethal temperature of S. rugosoannulata

3 結論

本文對腐敗大球蓋菇采用傳統培養方法分離、純化腐敗菌，通過形態學結合分子生物學手段確定腐敗菌種類并對腐敗菌的生長特性進行研究。發現腐敗大球蓋菇經分離純化后共得到75 個腐敗菌株，其中鐮刀菌屬16 株、曲霉屬14 株，根霉屬4 株。通過致腐性分析，得到四種致腐性強的腐敗菌，經形態學和分子生物學鑒定其分別為假嗜花鐮刀菌（Fusarium pseudoanthophilum），黑曲霉（Aspergillus niger），單孢根霉菌（Rhizopus azygosporus）和產紫藍狀菌（Talaromyces purpureogenus）。四種腐敗菌的最適生長溫度為25～28 ℃，在4～10 ℃和高于35 ℃下會抑制腐敗菌的生長繁殖，在60～65 ℃時腐敗菌無法生長。此外，腐敗菌的最適生長pH 為7.0 左右，pH 為13.0 時腐敗菌無法生長。因此為了避免腐敗菌的生長繁殖導致大球蓋菇的腐敗變質，可將采后大球蓋菇存放于低溫和適當的堿性環境下貯藏，以期延長大球蓋菇的貨架期，并為進一步研究大球蓋菇的貯藏保鮮技術提供了理論依據。

? The Author(s) 2024.This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License (https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).