桂林米粉腐敗菌分離鑒定及其抑菌劑篩選

嚴婉嘉，梁韋武，陸佳慧，黃春霞，李 霞,2，董新紅，李 靜,*

（1.桂林理工大學化學與生物工程學院，廣西桂林 541006；2.廣西電磁化學功能物質重點實驗室，廣西桂林 541006）

米粉是廣泛流行于我國南方地區(qū)的傳統(tǒng)主食，因其食用簡便、口感爽滑勁道、營養(yǎng)豐富而廣受人們歡迎。鮮濕米粉是一種以大米或糙米為原料，經(jīng)過清洗、浸泡、磨漿、糊化成型及冷卻等一系列工序制成的扁寬形或細條形的米制品[1]。

鮮濕米粉水分含量較高，一般為60%～80%，室溫下通常只能保存24 h 左右，且當環(huán)境溫度較高時，微生物生長繁殖速度加快，其儲藏期更短[2]。由于制作米粉原料、輔料的不同和儀器設備的不同，導致制作出來的鮮濕米粉的質量良莠不齊[3]。研究表明原料大米的品種、陳放時間、理化特性及其淀粉凝膠結構特性等因素對鮮濕米粉品質有較大影響[4-8]；鮮濕米粉的保鮮技術主要包括保鮮劑處理、酸浸洗絲、微波、水浴或復合處理[9-14]。

鮮濕米粉營養(yǎng)豐富且含水量高，有利于微生物的生長繁殖，而微生物繁殖過程中可產(chǎn)生許多致使食品腐敗變質的代謝產(chǎn)物及毒素，是引起米粉腐敗變質的主要生物因素[15]。因此深入研究鮮濕米粉的腐敗菌及其生產(chǎn)工藝對米粉腐敗的影響等問題，或有利于發(fā)現(xiàn)鮮濕米粉腐敗變質的機理，為鮮濕米粉抑菌劑篩選、品質改善、貨架期延長等提供依據(jù)。目前關于鮮濕米粉腐敗菌方面的研究偏少。前人研究表明，γ-氨基丁酸、抗壞血酸、檸檬酸、乳糖酸和海藻酸鈉作為廉價易得、安全性高且無色無味的食品添加劑，能夠保持食品本身色香味不被破壞的基礎上表現(xiàn)出良好的抗氧化、抗菌抑菌等性能，從而被廣泛用于冷鮮肉、菠菜、甜櫻桃和水蜜桃等多種食品防腐保鮮研究[16-20]，但還未見在米粉上的應用。桂林米粉作為鮮濕米粉的一種，具有較高的營養(yǎng)價值和濃郁的地方特色。因此，本研究以桂林米粉為研究對象，分離鑒定其主要腐敗菌并從γ-氨基丁酸、抗壞血酸、檸檬酸、乳糖酸和海藻酸鈉這幾種食品添加劑中篩選桂林米粉腐敗菌的有效抑菌劑，旨在為桂林米粉貯藏保鮮提供一定依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮桂林米粉 桂林三養(yǎng)膠麥生態(tài)食療產(chǎn)業(yè)有限責任公司；LB 肉湯培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、瓊脂粉 青島海博生物技術有限公司；異丙醇分析純，天津市富宇精細化工有限公司；巰基乙醇分析純，上海吉至生化科技有限公司；γ-氨基丁酸、抗壞血酸、乳糖酸 食品級，河北玖宇生物科技有限公司；檸檬酸、海藻酸鈉 食品級，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；細菌基因組DNA 快速抽提試劑盒、真菌基因組DNA 快速抽提試劑盒、通用引物（（ITS1/ITS4）和（27F/1492R））、瓊脂糖、0.5×TAE 緩沖液、2X San Taq PCR Mix（含藍染料） 上海生工生物工程股份有限公司；液氮 桂林鑫宏益氣體有限責任公司。

ZHJH-C112C 超凈工作臺 上海智城分析儀器制造有限公司；BXM-30R 立式壓力蒸汽滅菌器 上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；2720 thermal cycler 聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction，PCR）儀 沐滕實驗設備（上海）有限公司；JY5000 電泳儀 北京六一生物科技有限公司；Tanon-1600 全自動凝膠圖像分析儀 廣州譽維生物科技有限公司；VIS-7220N 可見分光光度計 北京瑞麗分析儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品稀釋 參考王歡等[21]的方法并略作修改，稱取貯存1～3 d 的濕米粉各5 g，在無菌操作環(huán)境下置于已滅菌的研缽中，加入45 mL 無菌水充分研磨，制得稀釋度為10-1的米粉勻漿。吸取1 mL 上述米粉勻漿于新的已滅菌離心管中并加入9 mL 無菌水，制得稀釋度為10-2的米粉勻漿，依此類推進行10 倍梯度稀釋制得稀釋度為10-3～10-7的米粉勻漿。

1.2.2 腐敗菌分離純化 采用稀釋涂布平板法。用移液槍分別移取50 μL 稀釋度為10-3～10-7的米粉勻漿于LB 肉湯瓊脂培養(yǎng)基和馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）上，用涂布器均勻涂開，每個稀釋梯度設置3 次平行試驗并設置空白對照。涂布完成后，細菌置于37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，真菌置于28 ℃恒溫培養(yǎng)3～5 d[22]。培養(yǎng)完成后，用接種環(huán)挑取形態(tài)不同的菌落分別進行劃線純化培養(yǎng)，并將純化后的菌接種在斜面培養(yǎng)基上保存。

1.2.3 主要腐敗菌反證試驗 參考陳志瑜[23]的方法并略作修改，從每種菌的斜面培養(yǎng)基上挑取一環(huán)置于10 mL 無菌水中制成菌懸液備用。將新鮮買回的鮮濕米粉每袋20 g 分裝于透明密封袋中，分裝好的鮮濕米粉開袋置于無菌操作臺上紫外滅菌30 min。滅菌完成后用1 mL 菌懸液污染無菌鮮濕米粉，以1 mL 無菌水代替菌懸液作空白對照。將密封袋封口并存放于25 ℃恒溫箱中，分別在1 d 和2 d 后觀察袋中米粉的變化，確定出導致米粉腐敗變質的優(yōu)勢菌株。

1.2.4 腐敗菌的鑒定

1.2.4.1 常規(guī)鑒定 首先用光學顯微鏡對從桂林米粉中篩選得到的腐敗菌進行形態(tài)觀察，描述其菌落形態(tài)，包括大小、顏色、質地及邊緣、表面情況等，并對腐敗菌進行革蘭氏染色和芽孢染色后觀察。然后參考《內(nèi)生菌研究方法》[24]及《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[25]，通過V-P 實驗、葡萄糖氧化發(fā)酵實驗、淀粉水解實驗、明膠液化、硝酸鹽還原、接觸酶實驗對主要腐敗菌進行生理生化鑒定。結合菌株形態(tài)特征及生理生化特征對腐敗菌種類進行初步判定。

1.2.4.2 分子生物學鑒定 采用細菌基因組DNA 快速抽提試劑盒對細菌基因組DNA 進行提取。得到模板DNA 后進行PCR 擴增反應，反應體系包括：模板DNA 10 μL，2X SanTaq PCR Mix（含藍染料）25 μL，引 物 27F（5'-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）各2 μL，最后用ddH2O 補至50 μL。PCR 反應條件為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，35 個循環(huán)；72 ℃終延伸10 min；4 ℃保存。

將擴增完成的PCR 產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，電泳條件為80 V 電壓下1.5 h,在凝膠成像儀下獲得電泳圖。將擴增成功的樣品送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行基因測序。得到的序列上傳至NCBI 數(shù)據(jù)庫中進行Blast 同源性比對，下載相似性較高的菌株序列，使用MEGA 11.0 軟件中鄰接（Neighbor-Joining，NJ）法構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.5 抑菌劑離體篩選 參照γ-氨基丁酸、抗壞血酸、檸檬酸、乳糖酸和海藻酸鈉五種試劑用于食品保鮮技術的相關研究[26-28]，分別配制成濃度均為50 mg/mL 的五種抑菌劑。采用打孔法，以等量無菌生理鹽水代替抑菌劑作對照組，考察抑菌劑對桂林米粉主要腐敗菌的抑制作用。

確定出有效抑菌劑后，參考夏飛等[29]的方法并略作修改，設置有效抑菌劑濃度梯度為30、60、90、120 和150 mg/mL，每種有效抑菌劑的各濃度分別對20 g 鮮濕桂林米粉作浸泡5 min 后撈出瀝干處理。處理后的米粉打成勻漿，分別移取1 mL 勻漿注入150 mL 的LB 液體培養(yǎng)基中，以1 mL 無菌水代替米粉勻漿作空白對照，于37 ℃培養(yǎng)箱搖床培養(yǎng)22 h。培養(yǎng)過程中每隔2 h 取樣一次，以不加任何試劑的空白培養(yǎng)基作參比，測定600 nm 處的OD 值來表征米粉中菌群濃度變化，確定有效抑菌劑的最佳濃度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組試驗重復三次，試驗數(shù)據(jù)采用IBM SPSS Statistics 25 進行分析處理，采用鄧肯（DunCan）檢驗法進行事后多重比較，采用Origin 2023 進行統(tǒng)計及繪圖。

2 結果與分析

2.1 主要腐敗菌的分離篩選

通過初步的分離篩選，從鮮濕桂林米粉中一共分離純化出13 種腐敗菌，均為細菌，將這些細菌分別命名為MF1、MF2、MF3、MF4、MF5、MF6、MF7、MF8、MF9、MF10、MF11、MF12 和MF13。在桂林米粉貯藏過程中，適宜溫度下細菌繁殖速度快，能消耗較多米粉中的營養(yǎng)物質從而成為優(yōu)勢菌，在一定程度上抑制了真菌的生長，與Gram 等[15]得到的結果大致相符。

鮮濕米粉的感官評定指標主要是條形、色澤、氣味及口感等，當貯藏環(huán)境溫度高于20 ℃時米粉老化程度減小，同時會因微生物繁殖引起酸敗變質問題[30]。陳志瑜[23]用菌懸液污染無菌米粉并常溫貯藏1 d 后根據(jù)米粉外觀及氣味變化確定了引起鮮濕米粉腐敗變質的污染菌。祝紅等[31]發(fā)現(xiàn)在25 ℃下米粉的各項感官指標隨時間延長而得分降低且18 h 后米粉呈現(xiàn)變黏、變黃、發(fā)臭等明顯腐敗變質的現(xiàn)象。由此可見感官評定雖易受主觀因素與環(huán)境影響，但對只考察微生物因素的反證試驗而言是較為直觀簡便的方法。因此本實驗將從篩選出的13 種細菌進行反證實驗，記錄分別接種13 個菌株的米粉放置2 d 后的結果。結果見表1。

表1 桂林米粉主要腐敗菌反證試驗結果Table 1 Guilin rice noodles main spoilage bacteria disproof experimental results

由表1 可知，接種MF1、MF2、MF3、MF4、MF6、MF12 鮮濕米粉出現(xiàn)了變色、糊條、粘條的現(xiàn)象，且密封袋中的米粉有產(chǎn)生明顯酸臭味，隨著時間的增加，米粉的顏色會逐漸加深，米粉糊條、粘條更加嚴重。相比之下其他組別的米粉變化不明顯，因此可以判定MF1、MF2、MF3、MF4、MF6、MF12 是引起桂林米粉變質的主要腐敗菌。

2.2 桂林米粉腐敗菌鑒定

2.2.1 腐敗菌常規(guī)鑒定 經(jīng)反證試驗篩選得到的6 株主要腐敗菌常規(guī)鑒定結果如下所示，菌株形態(tài)鑒定結果見表2，生理生化鑒定結果見表3。根據(jù)常規(guī)鑒定結果，結合《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[25]可以得出，菌株MF1、MF2、MF3、MF12 為革蘭氏陽性菌，產(chǎn)芽孢，產(chǎn)接觸酶、明膠酶，初步鑒定為芽孢桿菌屬（Bacillus）的細菌；菌株MF4 為革蘭氏陰性菌，產(chǎn)接觸酶，不產(chǎn)芽孢，不產(chǎn)明膠酶，可發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，初步鑒定為檸檬酸桿菌屬（Citrobacter）的細菌；菌株MF6 為革蘭氏陽性菌，產(chǎn)接觸酶，不產(chǎn)芽孢，不產(chǎn)明膠酶，初步鑒定為微小桿菌屬（Exiguobacterium）的細菌。

表2 主要腐敗菌形態(tài)鑒定Table 2 Morphological identification of main spoilage bacteria

表3 主要腐敗菌生理生化特性鑒定Table 3 Identification of physiological and biochemical characteristics of main spoilage bacteria

主要腐敗菌的致腐性與其生理生化特征有一定關系。有研究表明，貝萊斯芽孢桿菌在生長繁殖過程中會產(chǎn)生乙酸和丁酸等揮發(fā)性脂肪酸[32]；檸檬酸桿菌屬是腸桿菌科中的一種腸道病菌，其發(fā)酵產(chǎn)物為混合酸，這些代謝產(chǎn)物均會加速桂林米粉的酸敗變質。蠟樣芽孢桿菌可利用食品中的糖類及蛋白質，并經(jīng)代謝產(chǎn)生大量伯醇和酯類物質，還會分解硫和支鏈氨基酸而使食品產(chǎn)生異味[33]。此外在細菌生長代謝過程中，蘇云金芽孢桿菌會產(chǎn)生內(nèi)毒素，蠟樣芽孢桿菌會產(chǎn)生腸毒素，這都是導致桂林米粉變質甚至引起食品安全問題的重要因素[34-35]。

2.2.2 主要腐敗菌分子生物學鑒定 對篩選出的6種主要腐敗菌進行PCR 擴增并送檢，6 株細菌PCR電泳圖顯示其堿基對均在1500 bp 附近，擴增結果如圖1 所示。

圖1 菌株PCR 產(chǎn)物電泳圖Fig.1 PCR product electrophoresis map of strain

將測得的基因序列結果經(jīng)NCBI 網(wǎng)站Blast 比對，在MEGA 11.0 上進行同源性分析及構建系統(tǒng)發(fā)育樹，見圖2。菌株MF1 與蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）聚于一支，親緣關系最近；菌株MF2 與蠟樣芽孢桿菌（B.cereus）聚于一支，親緣關系最近；菌株MF3 與貝萊斯芽孢桿菌（B.velezensis）親緣關系相近；菌株MF4 與檸檬酸桿菌屬（Citrobactersp.）聚于一支，親緣關系最近；菌株MF6 與乙酰微小桿菌（Exiguobacterium acetylicum）聚與一支，親緣關系最近；菌株MF12 與蠟樣芽孢桿菌（B.cereus）聚于一支，親緣關系最近。

圖2 菌株MF1、MF2、MF3、MF4、MF6 及MF12 基于16S rRNA 基因序列構建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree based on the 16S rRNA gene sequence of strain MF1,MF2,MF3,MF4,MF6 and MF12

綜合鑒定結果，最終確定菌株MF1 為蘇云金芽孢桿菌（B.thuringiensis），菌株MF2、MF12 為蠟樣芽孢桿菌（B.cereus），菌株MF3 為貝萊斯芽孢桿菌（B.velezensis），菌株MF4 為檸檬酸桿菌屬（Citrobactersp.），菌株MF6 為乙酰微小桿菌（Exiguobacterium acetylicum）。

2.3 有效抑菌劑及抑菌濃度篩選

采用打孔法得到的抑菌圈結果如圖3 所示。其中，編號1～6 分別對應檸檬酸、抗壞血酸、γ-氨基丁酸、海藻酸鈉、乳糖酸和無菌生理鹽水。從圖中可以看出，編號1 和編號2 的抑菌圈較大，且對6 種細菌均有一定的抑制作用，說明檸檬酸和抗壞血酸的抑菌效果較好。因此，可將抗壞血酸和檸檬酸作為桂林米粉腐敗菌的有效抑菌劑。

圖3 打孔法抑菌圈效果圖Fig.3 Punching method bacteriostatic circle effect diagram

進一步研究不同濃度檸檬酸和抗壞血酸對米粉主要腐敗菌的抑制作用，結果分別如圖4 和圖5 所示，由圖可見處理組在細菌生長的對數(shù)期菌群濃度均有下降。由圖4 可以得出，與清水組相比，抗壞血酸濃度為30、60 mg/mL 時，微生物的生長仍然較快。而另外三組濃度較高的抗壞血酸中微生物生長均相對較慢。培養(yǎng)22 h 時，90 mg/mL 的抗壞血酸處理的米粉中菌體濃度最低，綜合考慮，90 mg/mL 為抗壞血酸的最佳抑菌濃度。由圖5 可得出，與清水組相比，檸檬酸濃度≤90 mg/mL 時，微生物仍有較快的生長速度，抑菌效果不明顯。當檸檬酸濃度達120、150 mg/mL 時，微生物的生長整體呈緩慢趨勢，但兩者之間無顯著性差異（P＞0.05）。考慮經(jīng)濟成本與綠色環(huán)保因素，確定檸檬酸的最佳抑菌濃度為120 mg/mL。

圖4 抗壞血酸處理對腐敗菌濃度的影響Fig.4 Effect of ascorbic acid treatment on the concentration of spoilage bacteria

圖5 檸檬酸處理對腐敗菌濃度的影響Fig.5 Effect of citric acid treatment on the concentration of spoilage bacteria

有研究表明，酸浸可作為鮮濕米粉的有效滅菌方式，工業(yè)生產(chǎn)上常用有機酸與弱酸鹽復配成緩沖液后用于米粉滅菌處理，且比單一酸浸方式更能保持米粉的蒸煮品質[36]。此外，酸浸滅菌較熱力、微波等滅菌方式更簡單易行且更節(jié)省時間及能耗，故實際生產(chǎn)上常將酸浸與其他滅菌處理相結合以達到經(jīng)濟環(huán)保的目的。鄒仙果等[37]研究發(fā)現(xiàn)酸浸與蒸煮相結合可使鮮米粉貨架期延長一倍，衛(wèi)攀杰等[38]對比了鮮濕米粉不同滅菌處理的品質變化，發(fā)現(xiàn)酸浸與水浴相結合處理米粉可促進淀粉糊化，增強其凝膠結構從而改善米粉品質。本實驗基于微生物層面為開發(fā)桂林米粉保鮮劑及高效保鮮方式提供一定數(shù)據(jù)支撐，后續(xù)尚可從酸處理時間及方式優(yōu)化、篩選復配弱酸鹽及濃度進行深入研究，以期在高效滅菌的基礎上最大限度保持桂林米粉口感和品質。

3 結論

本研究從室溫貯藏1～3 d 的桂林米粉中分離純化得到13 株腐敗菌，均為細菌，再通過反證試驗確定MF1、MF2、MF3、MF4、MF6 和MF12 為主要腐敗菌，這6 株細菌能使桂林米粉在貯藏過程中會出現(xiàn)色澤變黃、斷條、粘條、糊條及產(chǎn)生酸臭味等腐敗變質現(xiàn)象。通過形態(tài)、生理生化等常規(guī)鑒定結合分子生物學鑒定，確定這6 株腐敗細菌為蘇云金芽孢桿菌（B.thuringiensis）、蠟樣芽孢桿菌（B.cereus）、貝萊斯芽孢桿菌（B.velezensis）、檸檬酸桿菌屬（Citrobactersp.）和乙酰微小桿菌（Exiguobacterium acetylicum）。通過平板培養(yǎng)從五種食品添加劑中篩選有效抑制上述6 種腐敗細菌的抑菌劑，發(fā)現(xiàn)抗壞血酸和檸檬酸有良好的抑菌效果；進一步通過測定菌密度的方法確定兩者的最適抑菌濃度分別為90 和120 mg/mL。結果表明，一定濃度的抗壞血酸和檸檬酸對桂林米粉具有良好的殺菌防腐作用，為兩者在桂林米粉貯藏保鮮上的應用提供了一定的參考。

? The Author(s) 2024.This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License (https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).