微濾聯合大孔樹脂純化藍莓果脯糖漿中花色苷的工藝優化

朱成成，隋世有，魏文毅,2，賈 建，劉 偉，田 偉，孟令偉，金麗梅,3,4,*，李志江,3

（1.黑龍江八一農墾大學食品學院，黑龍江大慶 163319；2.黑龍江省農產品加工工程技術研究中心，黑龍江大慶 163319；3.黑龍江省雜糧加工及質量安全工程技術研究中心，黑龍江大慶 163319；4.國家雜糧工程技術中心，黑龍江大慶 163319）

花色苷具有清除自由基[1]的生理功能，在提高人體免疫力[2]、預防心血管疾病[3]、抗炎抗癌[4]等方面具有重要作用。藍莓果脯加工過程產生大量的果脯糖漿，目前主要應用于果醬[5]、飲料[6]、凝固型酸奶[7]等產品中。藍莓果脯糖漿除含有糖類之外，還富含花色苷等物質[8]。因此，從藍莓果脯糖漿中回收花色苷，對于擴大藍莓花色苷的來源，實現資源的有效利用，加快高附加值產品的開發等具有重要意義。

大孔樹脂是目前最有效的花色苷純化技術之一[9-10]，其原理是利用樹脂對花色苷分子的吸附和解吸特性實現純化目的[11]。大孔樹脂的類型常根據花色苷的極性強弱不同來篩選，例如胥萍等[12]在血橙花色苷純化過程中，優化出D101 大孔樹脂進行純化，得到花色苷的色價為48.4，純化效果明顯。夏錦錦等[13]以AB-8 對黑寶石李果實花色苷粗提液純化，使得花色苷純度提高了2.10 倍。韓蕈澤[14]同樣采用弱極性AB-8 大孔樹脂聯合高速逆流色譜對藍靛果花色苷粗提液進行純化，花色苷純度達到93.81%。當原料中雜質較多時，若未對其進行前處理而直接進樣，勢必對大孔樹脂的多孔結構造成堵塞[15]，同時帶來花色苷回收率少、純度較低等問題[16]。特別是藍莓果脯的成分較復雜，使用大孔樹脂分離時，有必要對原料液進行預處理，以提高后續樹脂純化花色苷的效果。

膜技術具有低溫操作、分離效率高等優點，在果汁澄清及花色苷純化方面具有極大的優勢。陳虹吉[17]以0.22 μm 聚醚砜微濾膜、100 kDa 超濾膜對楊梅果汁進行澄清時，果汁的混濁度有效降低，花色苷的穩定性也得到保持。Vladisavljevi?等[18]以0.2 μm 陶瓷微濾膜對紅覆盆子果汁進行澄清，結果表明透過液中花色苷的損失最小。Chaparro 等[19]采用微濾技術對西瓜汁進行分離純化，實現了花色苷和蛋白質、糖等雜質之間的顯著分離。膜技術除了直接用于花色苷提取物的純化分離之外[20]，還常用作大孔樹脂純化花色苷預處理方法，以利于提高花色苷的分離純化效果[21]。如張亞紅等[22]運用切割分子量（MWCO）6 kDa 的超濾膜與D101 大孔樹脂聯合技術對藍莓花色苷進行純化，花色苷純度可達35%。蘇鶴等[23]利用截留分子量10 kDa 超濾膜結合大孔樹脂對紫薯花色苷進行純化，花色苷色價由1.59 提升至32.89。然而目前針對藍莓果脯糖漿中花色苷分離純化研究未見相關文獻報道。

因此，本文擬采取微濾聯合大孔樹脂對藍莓果脯糖漿花色苷進行分離純化研究，確定微濾分離及大孔樹脂純化的最佳工藝參數條件，研究成果為進一步實現從藍莓果脯糖漿中回收花色苷提供科學理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

藍莓果脯糖漿 黑龍江伊春九鑫食品經銷有限公司；無水乙醇、苯酚、葡萄糖、濃硫酸 分析純（AR），遼寧全瑞試劑有限公司；考馬斯亮藍-250 分析純（AR），上海金穗生物科技有限公司；大孔樹脂AB-8、D101、HPD600 鄭州和成新材料科技有限公司；微濾膜為聚乙烯醇纖維膜（孔徑0.22 μm） 上海摩速科學器材有限公司。

UV-1500 分光光度計 上海美析儀器有限公司；FA2004 分析天平 沈陽拓宇衡器有限公司；XFUF07601 杯式過濾器 美國Millipore 公司；HL-2S 恒流泵 上海青浦滬西儀器廠；RE2000B 旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 技術路線 藍莓果脯糖漿→抽濾→微濾分離→大孔樹脂篩選→靜態試驗→動態試驗→旋轉蒸發→花色苷濃縮液。

1.2.2 藍莓果脯糖漿的微濾處理 參考課題組前期優化得到的工藝參數進行微濾試驗，即首先使用去離子水對藍莓果脯糖漿進行2 倍稀釋，經抽濾去除雜質，取上述抽濾液150 mL 倒入已安裝好微濾膜（孔徑0.22 μm）的杯式過濾器中，控制操作壓力0.08 MPa，濃縮倍數為5 倍，膜面轉速為418.6 r/min，收集微濾透過液，測定花色苷、總糖、蛋白質和可溶性固形物含量，并將其進一步用于大孔樹脂的分離純化。

1.2.3 大孔樹脂的篩選

1.2.3.1 大孔樹脂預處理 通過大孔樹脂靜態試驗對AB-8、D101、HDP600 進行篩選。首先對其進行預處理，即分別將AB-8、D101、HDP600 大孔樹脂與無水乙醇按照1:4（g:mL），密封浸泡24 h 充分溶脹后，用去離子水清洗樹脂，直至無醇味，去離子水浸泡大孔樹脂備用。

1.2.3.2 靜態吸附解吸試驗 參考余亞選等[24]研究方法，首先分別稱取3 g 上述三種預處理的樹脂置于錐形瓶，加入藍莓果脯糖漿花色苷微濾液30 mL，在25 ℃、110 r/min 水浴條件下振蕩24 h 至吸附平衡后過濾，于520 nm 處測定濾液中花色苷吸光度，按公式（1）計算樹脂靜態吸附率。

向上述吸附平衡后的樹脂中加入70%乙醇30 mL（鹽酸調pH3.0），在25 ℃、110 r/min 條件下振蕩24 h 后過濾，于520 nm 測定濾液中花色苷吸光度，按公式（2）計算樹脂靜態解吸率。以上試驗重復3 次取平均值。

1.2.4 動態吸附解析試驗

1.2.4.1 單因素實驗 參考劉敬華等[25]的方法，將上述篩選出的大孔樹脂經預處理后濕法裝入Ф2.4×45 cm 玻璃柱中，柱高30 cm，精確量取20 mL 微濾透過液經恒流泵通入大孔樹脂，控制上樣流速分別為1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL/min，吸附完成后用4 倍柱體積的酸化乙醇（1 mol/L HCl 調至pH 3.0）進行洗脫，乙醇濃度分別50%、60%、70%、80%、90%，洗脫流速為分別為1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL/min，收集洗脫液并考察各單因素對花色苷回收率、總糖去除率的影響。每一次吸附解吸試驗完成后，均使用去離子水對大孔樹脂進行清洗至無醇味。

上述單因素實驗中，當研究上樣流速的影響時，固定乙醇濃度70%和洗脫流速2.0 mL/min；當研究乙醇濃度的影響時，固定上樣流速2.0 mL/min 和洗脫流速2.0 mL/min；當研究洗脫流速的影響時，固定上樣流速2.0 mL/min 和乙醇濃度70%。

1.2.4.2 響應面優化試驗 根據以上單因素實驗，采用Box-Behnken 設計，以藍莓果脯糖漿中花色苷的回收率為響應值R1，以A 上樣流速、B 乙醇濃度、C 洗脫流速為自變量，通過響應面分析對藍莓果脯糖漿花色苷大孔樹脂純化條件進行優化，因素水平及編碼見表1。

表1 響應面試驗因素水平Table 1 Responsive surface experimental factors and levels

1.2.5 旋轉蒸發濃縮 將大孔樹脂純化花色苷的收集洗脫液，置于旋轉蒸發瓶中，控制操作壓力0.1 MPa，水浴溫度50 ℃，旋轉速度60 r/min。為便于與純化前后花色苷濃度相比較，控制旋轉蒸發濃縮至4 倍，并對濃縮液中的花色苷、總糖、蛋白質含量進行測定。

1.3 指標測定

1.3.1 花色苷含量測定 參考李安等[26]采用pH 示差法測定花色苷。移取1 mL 樣液，分別用pH 1.0、pH 4.5 緩沖溶液定容至25 mL，于40 ℃水浴平衡1 h 后在520 nm 下測其吸光度，按公式（3）計算花色苷含量，平行測定三次。

式中，C 為花色苷質量濃度mg/100 mL；A 為pH1.0 時樣液在520 nm 處的吸光度與pH4.5 時樣液在520 nm 處吸光度的差值；Mw為矢車菊素-3-葡萄糖苷分子量，449.2 g/mol；Df為稀釋倍數；ε為矢車菊素-3-葡萄糖苷摩爾消光系數，29600 L/（mol·cm）。

1.3.2 總糖含量測定 參考王彥平等[27]采用苯酚-濃硫酸法測定。移取樣液1 mL，稀釋10 倍后，取1 mL稀釋樣液，加入5%苯酚，5 mL 濃硫酸，沸水浴15 min 后，取出冷卻至室溫，加水定容至25 mL，混勻后在490 nm 測吸光度并計算，平行測定三次。

1.3.3 蛋白質含量測定 參考王艾平等[28]采用考馬斯亮藍法測定。移取樣液1 mL，加入5 mL 考馬斯亮藍溶液，混勻后在600 nm 測吸光度并計算，平行測定三次。

1.3.4 可溶性固形物測定 參考NY/T 2637-2014折射儀法，取適量樣液滴在折射儀觀測鏡片上進行讀數[29]。

1.3.5 pH 測定 按照GB 5009.239-2016。取適量樣液使用pH 計測定pH[30]。

1.3.6 花色苷回收率

式中，X 為花色苷回收率，%；C1為純化后花色苷濃度，mg/100 mL；V1為純化后花色苷體積，mL；C2為純化前花色苷濃度，mg/100 mL；V2為純化前花色苷體積，mL。

式中，Y 為總糖去除率，%；C3為純化后總糖濃度，mg/100 mL；V3為純化后總糖溶液體積，mL；C2為純化前總糖濃度，mg/100 mL；V2為純化前總糖溶液體積，mL。

1.3.8 色價的測定 參考欒浩等[31]方法并略作修改，取1 mL 樣品溶液加入氯化鉀-鹽酸緩沖液（pH 1.0）定容至25 mL，于1 cm 比色皿中在520 nm 處測定吸光度并計算色價。

1.4 數據處理

本文采用Origin 2020 進行數據統計與處理，采用SPSS 26.0 對數據進行分析，并采用Design-Expert 12 進行響應面試驗設計及分析。

2 結果與分析

2.1 微濾預處理藍莓果脯糖漿

藍莓果脯糖漿經微濾前后料液的主要成分如表2 所示。由表2 可見，藍莓果脯糖漿原料和微濾透過液中總糖含量分別為129.32 和31.76 mg/mL，可溶性固形物含量由52.18%下降到14.32%，蛋白質含量接近0。原料和透過液中花色苷濃度分別為18.40 和6.84 mg/100 mL，這是由于原料液中糖類、果膠等物質在外加壓力的作用下，容易在濾膜表面形成膜污染，從而使花色苷也受到部分截留[20]，因此透過液中的花色苷含量也大幅降低。另外，由于藍莓果實中有機酸的累積[32]，使藍莓果脯糖漿pH 為2.55，表現出較強酸性。因此，在大孔樹脂純化花色苷前，采取微濾分離可有效去除原料中的部分蛋白質、糖類及果膠等雜質，減輕樹脂吸附柱污染的同時，也利于樹脂有效純化回收中的花色苷。

表2 藍莓果脯糖漿原液及微濾透過液成分分析Table 2 Composition analysis of the composition of blueberry candied fruit syrup and microfiltration solution

2.2 大孔樹脂純化工藝

2.2.1 靜態吸附解吸試驗 大孔樹脂是主要以范德華力和氫鍵作用力對花色苷分子進行吸附[33]。因此，不同種類樹脂根據比表面積、孔徑大小的不同對目標分離物具有一定的選擇性[34]。三種大孔樹脂對花色苷的吸附和解吸情況如表3 所示。不同種類的樹脂對花色苷的吸附程度不同，與D101、HDP600 樹脂相比，AB-8 大孔樹脂對微濾液中花色苷的吸附率最高，其值為91.26%，遠高于D101（80.34%）、HDP 600（78.45%），且三種樹脂解吸性能大小為AB-8＞D101＞HDP600，其解吸率分別為95.05%、78.12%、73.52%。AB-8 樹脂吸附、解吸率高的可能原因為樹脂比表面積孔徑較適于花色苷分子自由進入[13]，且微濾處理后中雜質的減少，利于提高樹脂對花色苷吸附解吸效率[23]。因此確定使用AB-8 大孔樹脂進行花色苷純化。

表3 不同型號樹脂對花色苷的吸附和解吸性能比較Table 3 Comparison of the adsorption and desorption performance of different types of resins for anthocyanins

2.2.2 動態吸附解吸試驗單因素實驗結果

此外，安徽六國公司還因地制宜地開展好綠化美化工作。如今，粉刷一新的車間裝置樓，被矮牽牛和萬壽菊簇擁著、還有彩虹不時造訪的弘毅樓廣場，扮靚著工廠，美了員工的心情，更給客戶留下了好印象。

2.2.2.1 上樣流速的影響 上樣流速對果脯糖漿純化效果的影響如圖1 所示。由圖1 可知，隨上樣流速的增加，洗脫液中花色苷回收率與總糖去除率均呈先逐漸增加再降低的趨勢。當上樣流速為2.0 mL/min時，花色苷回收率為82.42%，總糖去除率為76.46%，這是由于花色苷分子受樹脂范德華力吸引被吸附在樹脂多孔結構內，使得花色苷減少損失，回收率達到較高值[35]。與此同時，樣液中糖類物質未與樹脂顆粒表面長時接觸，糖類物質便隨溶液流出，因此取得了較好的純化效果。當流速高于2.0 mL/min 時，花色苷回收率、總糖去除率均為逐漸降低，可能是上樣流速的增加，花色苷分子未被樹脂吸附便流動出去，造成損失使回收率降低[36]。當上樣流速增加到3.0 mL/min時，受樣液中糖類物質粘性于樹脂表面及顆粒之間間隙的阻礙，導致部分花色苷未被樹脂有效吸附，花色苷損失持續增加[37]。因此，確定上樣流速為2.0 mL/min。

圖1 上樣流速對果脯糖漿花色苷純化的影響Fig.1 Effect of feed flow rate on the purification of anthocyanins from candied fruit syrup

2.2.2.2 乙醇濃度的影響 乙醇濃度對果脯糖漿純化效果的影響如圖2 所示。由圖2 可知，隨洗脫劑乙醇濃度的增加，花色苷回收率、總糖去除率呈先增大后略微減小趨勢。當乙醇濃度為80%時，AB-8 大孔樹脂對花色苷回收率達82.51%、總糖去除率達80.64%，可能是乙醇溶液的極性性質較輕易斷開樹脂吸附的花色苷分子，使花色苷溶解于乙醇溶液被洗脫出來，使得花色苷純化效果明顯[16]。繼續增加乙醇濃度，大孔樹脂對花色苷回收率有所降低，這是由于乙醇濃度增大為90%時，會造成樹脂的醇溶現象，即樹脂內部多孔結構處于充分溶脹狀態，不利于吸附花色苷，降低了花色苷純化效果[38]。因此，確定80%乙醇為洗脫溶劑。

圖2 乙醇濃度對果脯糖漿花色苷純化的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on the purification of anthocyanin from candied fruit syrup

2.2.2.3 洗脫流速的影響 洗脫流速對果脯糖漿純化效果的影響如圖3 所示。由圖3 可知，洗脫流速由1.0 mL/min 增大到3.0 mL/min 過程中，花色苷回收率趨勢為先逐漸增大后減小，總糖去除率呈緩慢增加后減少再略有增加的趨勢。這是由于洗脫液流速過快導致樹脂吸附的花色苷未被完全解吸，且糖類物質吸附在樹脂表面，使樹脂間隙變小，花色苷未溶于洗脫劑并分離流出，從而降低花色苷回收效率[11]；洗脫劑流速過慢時，會導致花色苷解吸時間過長，且藍莓果脯糖漿中糖物質具有一定粘性，易造成樹脂損耗增加的同時，不利于花色苷的集中分離[39]。因此，綜合考慮后選擇洗脫液流速2.0 mL/min。

圖3 洗脫流速對果脯糖漿花色苷純化的影響Fig.3 Effect of elution flow rate on the purification of anthocyanin from candied fruit syrup

2.2.3 動態吸附解吸試驗響應面優化試驗結果 通過響應面動態優化試驗，上樣流速、乙醇濃度、洗脫流速三個因素對于大孔樹脂花色苷回收率的影響結果見表4。

表4 Box-Behnken 響應面試驗結果Table 4 Box-Behnken response surface experimental results

2.2.4 回歸模型建立及方差分析 對表4 試驗結果數據進行回歸分析，得到響應自變量（上樣流速、乙醇濃度和洗脫流速）與響應值（花色苷回收率）之間的二次多項回歸方程：

R=84.56+0.68A+0.84B-1.32C+2.83AB-0.41AC+0.20BC-6.20A2-2.09B2-4.79C2，二次回歸模型顯著性檢驗與方差分析結果見表5。

表5 回歸模型方差分析Table 5 Regression model analysis of variance

從表5 可以看出，此模型的P＜0.01，響應面回歸模型達到極顯著水平。決定系數R2=0.9623，表明預測值與實驗值有較好的相關性。影響花色苷純化回收率的因素主次順序為C 洗脫流速＞B 乙醇濃度＞A 上樣流速。模型中A2對花色苷回收率的影響高度顯著（P＜0.0001），AB、C2對花色苷回收率的影響極顯著（P＜0.01），C、B2對花色苷回收率的影響顯著（P＜0.05），失擬項各項數據分析表明該模型失擬不顯著（P=0.2420＞0.05），說明此模型與試驗實際擬合度良好，因此可用該回歸方程替代試驗真實點來進行結果分析。

2.2.5 各因素交互作用分析 由圖4 可看出，乙醇濃度向峰值方向移動，等高線的密度明顯低于上樣流速方向，等高線形狀呈橢圓形，由此可說明，乙醇濃度與上樣流速對于藍莓果脯花色苷的回收率為顯著影響。兩個因素交互作用圖也可得知，在乙醇濃度因素方向，響應面曲線較為陡峭，說明乙醇濃度對花色苷的回收率影響較大，隨著洗脫劑乙醇濃度的提高，花色苷回收率先升高后降低。乙醇濃度對花色苷回收率的影響顯著。同時沿上樣濃度方向變化稍微明顯，響應面曲線略陡峭，說明上樣流速與乙醇濃度對花色苷回收率的影響差別小。

圖4 上樣流速和乙醇濃度交互作用及等高線圖Fig.4 Interaction and contour plots of up-sampling flow rate and ethanol concentration

由圖5 可看出，沿著洗脫流速朝峰值方向移動的等高線密度也相對低于沿上樣流速方向。由兩者交互作用圖可看出，在上樣流速因素方向響應面曲線坡度較為陡峭；但洗脫流速因素方向的響應曲面坡度較緩，表明上樣流速與洗脫流速的交互作用對花色苷回收率的影響較小。隨上樣流速的增加，上樣流速對花色苷回收率影響并不顯著。由此可見，洗脫流速對花色苷回收的影響明顯高于上樣流速。

圖5 上樣流速和洗脫流速交互作用及等高線圖Fig.5 Interaction and contour plots of up-sampling flow rate and elution flow rate

由圖6 可看出，乙醇濃度和洗脫流速沿峰值方向的等高線密度較為稀疏，交互作用三維圖中響應面線的坡度較為平緩；說明當上樣流速一定時，乙醇濃度及洗脫流速的交互作用對花色苷回收率的影響不顯著。

圖6 乙醇濃度和洗脫流速交互作用及等高線圖Fig.6 Interaction and contour plots of ethanol concentration and elution flow rat

2.2.6 驗證試驗 使用AB-8 大孔樹脂對藍莓果脯糖漿花色苷的純化過程中，在各因素水平范圍內，洗脫流速顯著高于上樣流速和乙醇濃度對花色苷回收率的影響。由回歸模型分析得到，AB-8 大孔樹脂對花色苷回收率最佳工藝參數為上樣流速2.06 mL/min、乙醇濃度82.80%、洗脫流速1.93 mL/min。考慮到實際操作因素，對試驗條件參數進行調整，調整后的工藝參數為上樣流速2.0 mL/min、乙醇濃度83%、洗脫流速2.0 mL/min，在此條件下純化回收藍莓果脯糖漿中的花色苷，重復三次，實際測得的花色苷回收率為86.68%±1.06%，接近預測值88.46%±1.25%，且總糖去除率為84.13%±2.24%。表明響應面優化該純化方法具備一定的實際應用價值。

2.3 大孔樹脂洗脫液濃縮后指標分析

由于前期對大孔樹脂進料液進行4 倍稀釋，現將洗脫液濃縮4 倍以便于與原料液的組成進行對比。花色苷洗脫液經旋轉蒸發濃縮至相同進液體積后，其組成含量如表6 所示。由表6 可知，大孔樹脂花色苷質量濃度為5.56 mg/100 mL，總糖濃度質量為5.24 mg/mL，與表1 中微濾透過液中花色苷和總糖的含量6.84 mg/100 mL、31.76 mg/mL 相比，花色苷的回收率約為81.30%，總糖的去除率約為83.50%，蛋白質完全去除。且經微濾聯合大孔樹脂純化后的果脯糖漿中花色苷色價為31.43，約為原液中花色苷色價6.14 的5 倍，與欒浩等[31]研究結果相似。表明AB-8 大孔樹脂對于藍莓果脯糖漿廢液中花色苷的回收效果較為明顯。

表6 大孔樹脂洗脫濃縮液指標分析Table 6 Index analysis of macroporous resin eluent concentrate

3 結論

本文采用了微濾聯合大孔樹脂對藍莓果脯糖漿花色苷進行分離純化。優化了AB-8 樹脂對藍莓果脯中花色苷的純化工藝，通過響應面分析得最佳條件為：上樣流速2.0 mL/min、乙醇濃度83%、洗脫流速2.0 mL/min，此條件下所得花色苷回收率為86.68%，總糖去除率為84.13%。將花色苷解吸液濃縮后，經微濾聯合大孔樹脂純化后的藍莓果脯糖漿中花色苷色價為31.43，約為原液中花色苷色價6.14 的5 倍。本研究開發的微濾與大孔樹脂聯合技術，對于從藍莓果脯糖漿中有效回收花色苷提供一定的技術參考。

? The Author(s) 2024.This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License (https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).