甜酒曲發酵小米酒精飲料工藝優化及其品質分析

張 瑞，劉敬科，劉俊利, ，常世敏

（1.河北省農林科學院生物技術與食品科學研究所，河北石家莊 050000；2.河北工程大學生命科學與食品工程學院，河北邯鄲 056038）

小米又稱谷子，是中國主要雜糧作物之一。它具有耐干旱、耐貧瘠的特點，能夠緩解農業用水壓力問題和解決干旱、半干旱土地資源利用問題[1]。《本草綱目》中記載，小米有“養腎氣，去脾胃中熱，益氣，陳者苦寒，治胃熱消渴，利小便”的功效[2]，且小米中的營養成分含量高于大米、小麥，并含有多種生物活性物質[3]，是很好的營養食品源。

在谷物飲料的生產中，微生物發酵是常用的一種加工方式[4]。谷物作為優良益生元，通過發酵可以增加谷物飲料中營養素的含量從而提高其營養價值，還可以提高谷物飲料的感官特性，使其產生特有的風味[5]。在國外，用小米發酵的飲料已有很長的歷史，像尼日利亞和印度地區的傳統本土飲料就是由小米發酵制作而成，這些飲料能夠讓人們在夏季保持涼爽并遠離疾病[6-7]。在我國，對小米液體發酵食品研究主要集中在小米黃酒和小米醋上，利用酒曲或醋酸菌，通過固態或液態發酵工藝生產制成，但對以小米發酵的飲料進行研究的報道很少。

本文利用甜酒曲發酵開發出一種小米酒精飲料，對其活性成分和抗氧化能力進行測定并對其風味進行分析。本研究可以拓寬小米加工產品并提高小米利用率，也為開發以小米為原料的功能性食品提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

小米 市售；甜酒曲 安琪酵母股份有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2,2'-聯氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）、沒食子酸、蕓香葉苷、3,5-二硝基水楊酸 上海易恩化學技術有限公司；氫氧化鈉 上海沃凱生物技術有限公司；酚酞天津市大茂化學試劑廠；其他化學試劑均為分析純。

AG285 電子天平 梅特勒-托利多上海儀器有限公司；WPL-125BE 電熱恒溫培養箱 天津市泰斯特儀器有限公司；LB32T 手持糖度折光儀 廣州市銘睿電子科技有限公司；Thermo Multifuge 3 Plus 高速臺式離心機 美國賽默飛世爾科技公司；Agilent 1290-6470 液相色譜儀質譜儀 美國Agilent 公司；PEN3 紫外分光光度計 德國AIRSENSE 公司；AGILENT7890-5975C 氣相色譜-質譜聯用儀 恩特斯分析儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 小米酒精飲料制作工藝流程 小米→浸泡→蒸煮→冷卻→拌曲→發酵→離心→灌裝→滅菌→成品

1.2.2 操作要點

1.2.2.1 原料浸泡 稱取篩選好無雜質的小米，浸泡8 h。撈出已浸泡好的小米，去掉多余水分。

1.2.2.2 蒸煮 沖洗好的小米按1:1.5 比例加水，蒸煮30 min。

1.2.2.3 拌曲 蒸熟的小米冷卻至室溫，置于密閉容器中，拌入1.0%安琪甜酒曲，拌勻壓實，搭成“倒V”形的凹窩，密封好，放入恒溫培養箱中進行發酵。

1.2.2.4 發酵 在30 ℃培養箱中培養3 d，使小米得到充分的發酵。

1.2.2.5 離心滅菌 將發酵好的小米培養物進行離心，轉速4500 r/min，時間20 min。取清液灌裝于玻璃瓶中，放入80 ℃的水浴鍋中恒溫滅菌30 min，密封裝罐，將成品放在4 ℃冰箱中方便備用。

1.2.3 單因素實驗設計

1.2.3.1 確定甜酒曲添加量 小米經浸泡沖洗后按1:1.5 比例加水蒸煮30 min，分別拌入0.4%、0.7%、1.0%、1.3%、1.6%甜酒曲，拌勻壓實，密封好。放入30 ℃恒溫培養箱中發酵3 d，以感官評分、可溶性固形物和總酸為指標，探究甜酒曲添加量對飲料的影響。

1.2.3.2 確定發酵時間 小米浸泡沖洗后按1:1.5比例加水蒸煮30 min，拌入1.0%甜酒曲，拌勻壓實，密封好。放入30 ℃恒溫培養箱中分別發酵2、3、4、5、6 d，以感官評分、可溶性固形物和總酸為指標，探究發酵時間對飲料的影響。

1.2.3.3 確定發酵溫度 小米浸泡沖洗后按1:1.5比例加水蒸煮30 min，拌入1.0%甜酒曲，拌勻壓實，密封好。分別放入28、30、32、34、36 ℃恒溫培養箱中分別發酵3 d，以感官評分、可溶性固形物和總酸為指標，探究發酵溫度對飲料的影響。

1.2.4 響應面優化試驗 在單因素實驗的基礎上，以甜酒曲添加量（A）、發酵時間（B）、發酵溫度（C）為自變量，以綜合評分為響應值，借助 Design Expert 10軟件進行響應面優化，試驗設計見表1。

表1 響應面試驗因素和水平Table 1 Factors and levels of the response surface test

1.2.5 小米酒精飲料感官評價 由10 名食品專業人員分別從色澤、氣味、味道和組織狀態4 個方面來進行評分，評分標準參考相關文獻[8]，結合產品自身情況進行修改，具體感官評分標準見表2。

表2 小米酒精飲料感官評分標準Table 2 Sensory scoring criteria for foxtail millet alcoholic beverages

1.2.6 多指標綜合法 以感官評分、總酸和可溶性固形物作為試驗優化指標，采用多指標加權綜合評分法對小米酒精飲料的加工品質進行綜合評價[9]。為讓指標有相同的貢獻，將感官評分（a）、總酸（t）和可溶性固形物（s）的權重系數均設計為0.1，綜合評分（Q）=感官評分×0.1+總酸×0.1+可溶性固形物×0.1。

1.2.7 基礎指標測定

1.2.7.1 總酸測定 按照GB12456-2021《食品安全國家標準 食品中總酸的測定》[10]。

1.2.7.2 可溶性固形物測定 按照GB/T 12143-2008《飲料通用分析方法》[11]。

1.2.7.3 酒精度測定 按照GB5009.225-2016《酒中乙醇濃度的測定》。

1.2.8 活性成分及體外抗氧化測定

1.2.8.1 礦物質測定 按照GB 5009.268-2016《食品安全國家標準 食品中多元素的測定》[12]。

1.2.8.2 B 族維生素測定 稱取樣品2 mL，加入8 mL 1 mol/L 鹽酸溶液，80 ℃水浴振蕩30 min，過0.22 μm微孔濾膜后上機測定。

色譜條件：色譜柱：Agilent C18（2.1 mm×100 mm，3 μm）；流速0.3 mL/min；流動相：A 為0.1%甲酸水溶液，B 為甲醇，洗脫比例：0 min 99:1、3.2 min 60:40、3.6 min 5:95、4.7 min 99:1；流速：0.3 mL/min；進樣量：5 μL；柱溫：35 ℃。

質譜條件：離子源（ESI）負離子電離模式；檢測方式：多反應監測（MRM）模式；離子噴霧電壓4000 V；離子源溫度350 ℃；氣體：氮氣。

定量分析：根據每個B 族維生素標準品的濃度和出峰面積，計算樣品含量。

1.2.8.3 黃酮含量測定 參考李若熙等[13]方法進行修改。取1 mL 樣品，用60%乙醇補至5 mL 后加入0.3 mL 的5% NaNO2溶液，搖勻靜置5 min。然后加0.3 mL 的10% Al（NO3）3溶液，靜置5 min。加入2 mL 4% NaOH 溶液，用60%乙醇定容至10 mL，靜置15 min 后在510 nm 波長處測定吸光度值，以蘆丁為標準品，求得線性回歸方程為Y=0.9779X+0.0017，R2=0.9991。

1.2.8.4 多酚含量測定 參考付依依等[14]方法進行修改。取0.5 mL 樣品，加入0.5 mL 福林酚顯色劑，搖勻后加入1.5 mL 的7.5% Na2CO3溶液，定容至10 mL，室溫避光1 h 后在765 nm 波長處測定吸光度值，以沒食子酸為標準品，求得線性回歸方程為Y=13.49X+0.025，R2=0.9956。

1.2.8.5 DPPH 自由基清除率測定 參考鮑玉花等[15]的方法進行修改，制備0.2 mmol/L DPPH 工作液，取樣品和DPPH 工作液各2 mL，混勻后避光靜置30 min，在517 nm 處測定其吸光度A1；用乙醇代替樣品測其吸光度為A2；用乙醇代替DPPH 工作液測其吸光度為A3。計算公式見公式（1）。

1.2.8.6 ABTS+自由基清除率測定 參考Huang等[16]的方法并進行修改，將7.4 mmol/L 的ABTS 溶液和2.6 mmol/L 過硫酸鉀溶液1:1 混合，避光反應12 h，用無水乙醇稀釋，其在734 nm 處吸光值0.70±0.02，為ABTS 工作液。取0.1 mL 樣品和4 mL ABTS工作液，混勻后避光靜置10 min，在734 nm 處測其吸光度B1；用乙醇代替樣品測其吸光度為B2。計算公式見公式（2）。

1.2.8.7 羥基自由基清除率測定 參考鮑玉花等[15]的方法，依次加入樣品、6 mmol/L 硫酸亞鐵溶液、6 mmol/L 過氧化氫溶液和6 mmol/L 水楊酸-乙醇溶液各2 mL，充分混勻后，37 ℃水浴30 min，于517 nm處測定吸光值為C1；用去離子水代替過氧化氫測其吸光值為C2；用去離子水代替樣品測其吸光值為C3。計算公式見公式（3）。

1.2.9 揮發性風味物質測定

1.2.9.1 SPME 萃取方法 取4 mL 樣品于萃取瓶中，加入10 μL 4-甲基-2-戊醇（2000 mg/L）內標。使用DVB/PDMS/PDMS 萃取頭，萃取溫度60 ℃，萃取時間40 min，于250 ℃解吸5 min[17]。

1.2.9.2 儀器條件 GC 條件：色譜柱：DB-5MS 毛細管氣相色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；進樣口溫度：250 ℃；程序升溫：初始溫度45 ℃保留2 min，再以4 ℃/min 升溫到220 ℃保留5 min。載氣為氦氣，流速1.0 mL/min，不分流。

MS 條件：接口溫度為250 ℃，電離方式為電子電離（Electron Ionization，EI），電子能量70 eV，燈絲發射電流為200 μA，離子源溫度為300 ℃，掃描質量范圍33～450 amu。

1.2.9.3 定性定量方法 定性分析：在相同GC 條件下分析C8～C20烷烴混合標準溶液，計算小米酒精飲料揮發性成分保留指數（Rentention Index，RI），通過與美國國家標準技術研究所（National Institute of Standards and Technology，NIST）譜庫的檢索保留正反匹配度800 以上的物質，對比揮發性成分RI，進行定性分析。

定量分析：采用加入內標法對飲料揮發性成分進行定量分析，化合物濃度=（化合物峰面積/內標峰面積）×內標濃度。

1.3 數據處理

每個指標均做3 次重復實驗，用Origin 2019 軟件處理所得數據，單因素結果方差和顯著性采用SPSS 20 軟件進行分析，并應用Design-Expert 10 統計軟件進行響應面優化處理。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 甜酒曲添加量對小米酒精飲料的影響 由圖1可知，小米酒精飲料的感官評分呈先上升后下降趨勢，在添加量為1.0%時達到最高，感官評分的最高分為87 分，此時飲料的色澤、形態、滋味和風味較好。從整體上看，可溶性固形物含量與總酸含量呈反比。當添加量＞1.0%時，感官評分逐漸下降，可能是因為甜酒曲添加過多，根霉菌生長過快而發生衰亡，使飲料的苦味較明顯[18]，可溶性固形物轉化成總酸的能力也隨之下降。從綜合評分上看，甜酒曲添加量在1.0%時分數最高。所以，綜合考慮，選擇甜酒曲的添加量為1.0%時作為響應面試驗的“0”水平。

圖1 甜酒曲添加量對小米酒精飲料的影響Fig.1 Effect of the addition amount of liqueur koji on the foxtail millet alcoholic beverages

2.1.2 發酵時間對小米酒精飲料的影響 由圖2 可以看出，隨著發酵時間的增加，總酸呈整體上升趨勢，而可溶性固形物含量在發酵過程中逐漸減少，在第3 d 時感官評分達到最大值，然后逐漸降低。可能是因為發酵時間越長，發酵越徹底。在發酵過程中，微生物生長繁殖迅速，利用飲料中的可溶性固形物，將其轉化成酒精、有機酸和其他風味物質[19]。同時，發酵時間的延長增強了發酵體系中產酸菌的活性，使飲料的酸味增加，甚至產生澀味和苦味，影響了飲料的整體風味。從綜合評分上看，發酵時間為3 d 時分數最高。因此，選擇發酵時間為3 d 時作為響應面試驗的“0”水平。

圖2 發酵時間對小米酒精飲料的影響Fig.2 Effect of the fermentation time on the foxtail millet alcoholic beverages

2.1.3 發酵溫度對小米酒精飲料的影響 由圖3 可知，發酵溫度在28～34 ℃時，可溶性固形物整體呈下降趨勢，總酸整體呈上升趨勢，當發酵溫度達到36 ℃時，可溶性固形物直線上升，而總酸直線下降，可能是因為米根霉的最適發酵溫度在30～35 ℃范圍內[20]，當根霉菌生長受到抑制后，可溶性固形物轉化成酸性物質的能力也會降低。從感官評分上可以看出，溫度在32 ℃時評分是最高的。從綜合評分上看，發酵溫度32 ℃時分數最高。綜合考慮，選擇發酵溫度為32 ℃時作為響應面試驗的“0”水平。

圖3 發酵溫度對小米酒精飲料的影響Fig.3 Effect of the fermentation temperature on the foxtail millet alcoholic beverages

2.2 響應面優化結果

在單因素實驗的基礎上，以綜合評分為指標，采用Design-Expert 10 軟件Box-Benhnken 法進行試驗設計，確定飲料的最佳工藝，試驗設計及結果見表3。

表3 響應面試驗設計及結果Table 3 Response surface experimental design and results

對表3 試驗數據進行二次多項回歸擬合，獲得綜合評分對甜酒曲添加量（A）、發酵時間（B）、發酵溫度（C）的多元回歸方程為：Y=13.07+0.054A-0.15B+0.13C+0.057AB+0.025AC+0.18BC-0.24A2-0.62B2-0.40C2。

該模型的方差分析結果見表4。

表4 回歸模型方差分析Table 4 Analysis of variance for the regression model

以綜合評分為評價指標，對模型進行統計學檢驗并分析，由表4 可知，該回歸模型P＜0.01，極顯著，失擬項P=0.3050＞0.05，不顯著，說明方程能準確反映綜合評分與各因素之間的關系。回歸模型相關系數R2=0.9757，R2adj=0.9444，擬合程度良好。單因素B 極顯著（P＜0.01），三因素的F值分別為1.97、15.52、11.29，因此，對小米酒精飲料綜合評分影響大小的因素依次為發酵時間（B）＞發酵溫度（C）＞甜酒曲添加量（A）。二次項A2、B2、C2對飲料的綜合評分影響都極顯著（P＜0.01）。

利用Design-Expert 10 軟件對表4 的數據進行二元多次回歸擬合，A、B、C 三個因素對綜合評分（Y）的影響交互作用關系見圖4。

圖4 各因素交互作用對飲料綜合評分影響的響應面圖Fig.4 Response surface diagram of the interaction of each factor on the comprehensive score of beverages

2.3 模型驗證實驗

經Design-Expert 10 軟件分析得出，在發酵工藝為甜酒曲添加量1.03%、發酵時間2.90 d、發酵溫度32.28 ℃時，測得飲料的綜合評分為13.09 分。考慮實際操作性，將工藝調整為甜酒曲添加量1%、發酵時間3 d、發酵溫度32 ℃。在此工藝下進行驗證實驗，得出的飲料感官評分為89.37 分，可溶性固形物為22.05%，總酸為19.33 g/L，綜合評分為13.08 分。與預測值的誤差較小，在合理范圍之內，所以此模型運用響應面優化得到的工藝具有可靠性。

2.4 小米酒精飲料酒精度

測得小米酒精飲料的酒精度為0.7%vol，GB/T 17204-2021 中提到酒精度在0.5%vol 以上的稱為酒精飲料，說明該款飲料是小米酒精飲料。

2.5 發酵小米酒精飲料中活性成分及體外抗氧化能力

2.5.1 小米酒精飲料礦物質含量 礦物質是機體所必需的營養元素，對人體的正常發育至關重要，但是礦物質不能自身合成，需要不斷地從食物中攝取。缺乏和過量攝入礦物質都會導致機體出現功能性障礙和紊亂，所以需要適當均衡的從飲食中攝取一定數量的必需礦物質，以維持機體正常的生命活動[21]。如表5 所示飲料中礦物質含量由高到低依次為鉀＞鎂＞鈣＞鋅＞錳＞硒。鉀是所有元素中含量最高的元素，與之前的研究一致[22]。

表5 小米酒精飲料中礦物質元素含量Table 5 Mineral element content in foxtail millet alcoholic beverages

2.5.2 小米酒精飲料B 族維生素含量 B 族維生素通常以輔酶或輔助因子的形式參與脂肪、蛋白質、碳水化合物等的代謝過程，對維持機體的健康生長起到積極作用[23]。但B 族維生素易受到環境的影響，在加工制備過程中可能造成一部分B 族維生素的流失[24]。從表6 中可以看出，飲料中含有431.36 μg/L的煙酰胺。煙酰胺是維生素B3 進入人體后轉化的物質，除具有抗氧化、美白的功效外，對視網膜神經節細胞也有較強的保護作用[25]。小米酒精飲料中B 族維生素含量由高到低依次為煙酰胺＞維生素B6＞泛酸＞維生素B1＞維生素B2＞煙酸。

表6 小米酒精飲料中B 族維生素含量Table 6 B vitamin content in foxtail millet alcoholic beverages

2.5.3 小米酒精飲料黃酮、多酚及抗氧化能力分析 如表7 所示，該飲料的黃酮含量為66.78 mg/L，多酚含量為65.13 mg/L。研究表明，酚類、黃酮類等營養成分在抗氧化過程中起到了重要的作用[26]。通過測定DPPH 自由基、ABTS+自由基及羥自由基清除率來檢測其抗氧化活性，結果顯示小米酒精飲料具有一定的抗氧化活性，該飲料的DPPH 自由基及羥自由基的清除率均較高于彭新顏等[27]研究的褐色乳飲料，可以得出此款飲料的抗氧化活性總體較高。

表7 小米酒精飲料黃酮、多酚及抗氧化能力Table 7 Flavonoids,polyphenols and antioxidant capacity of foxtail millet alcoholic beverages

2.6 小米酒精飲料揮發性風味物質分析

利用SPME/GC-MS 對飲料揮發性成分進行分析，從表8 中可以看出，共檢測到46 種揮發性成分，其中包括14 種酯類、3 種酸類、11 種醇類、8 種醛類、5 種酮類和5 種其他類物質。研究表明，小米中揮發性成分主要集中于醛類物質，苯乙醛、反-2-辛烯醛、壬醛、癸醛、（E,E）-2,4-壬二烯醛、（E,E）-2,4-癸二烯醛等這幾種醛類物質是小米自有的揮發性香味成分[28]。經甜酒曲發酵后可以看出酯類、醇類、醛類種類最多，是飲料中的主要揮發性物質，這與龔燕川等[29]探究不同品牌醪糟揮發性成分所得的結果一致。

表8 小米酒精飲料揮發性風味物質分析Table 8 Analysis of volatile flavor substances in foxtail millet alcoholic beverages

2.6.1 酯類物質 酯類物質一般是由醇類物質酯化產生，具有水果甜香或花香氣味[30]。飲料中酯類物質最多，以乙酯類和丙酯類的飽和酯類物質為主，它們主要呈現水果香、花香、酒香和脂香等。乙酸異戊酯、正己酸乙酯、棕櫚酸乙酯、亞油酸乙酯這幾種酯類物質在小米酒精飲料中含量相對較高，說明這幾個酯類成分可能對飲料香氣具有重要貢獻。

2.6.2 醇類物質 醇類物質也是飲料中主要揮發性物質之一，大部分的醇類物質都是由酒精發酵階段產生的，而且醇類是生成酯類物質的前體物質。在飲料中可以看出，正己醇、3-甲硫基丙醇、1-辛醇是含量最多的醇類物質，含量分別為112.75、153.78、122.87 μg/L，它們主要貢獻的風味為果香、花香和草木香等。1-壬醇有橙子和玫瑰香氣，1-辛烯-3-醇有蘑菇、玫瑰和甘草香氣，這些醇類賦予飲料鮮香醇厚的特征香氣，對飲料香氣的形成有促進作用[31]。

2.6.3 醛類物質 醛類物質主要來自于氨基酸的代謝或不飽和脂肪酸的氧化[32]，不同的氨基酸在相應的酶作用下可產生不同的醛類物質，它們能協調各香氣組分，促進其釋放。在飲料中，影響其風味最重要的醛類化合物是苯甲醛，其含量最高，具有苦杏仁、櫻桃的香味。

3 結論

本文以小米為原材料，通過加入甜酒曲發酵研制出一款谷物酒精飲料，并對其營養品質和揮發性風味物質進行評價。實驗結果表明，發酵工藝的最優條件為：甜酒曲添加量1%、發酵時間3 d、發酵溫度32 ℃。該谷物酒精飲料酒精度為0.7%vol，還富含多種生物活性成分，且DPPH、ABTS+和羥自由基清除率分別為73.19%、34.29%、53.72%，說明該飲料具有較好的抗氧化能力。利用SPME/GC-MS 對飲料揮發性成分進行分析，共檢測到46 種揮發性成分，這些成分構成小米酒精飲料特有的風味。該研究為開發以小米為原料的功能性食品提供理論依據，為實現農產品資源的深度開發開辟有效途徑。

? The Author(s) 2024.This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License (https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).