響應面法優化準噶爾山楂總三萜提取工藝及其純化工藝研究

馮 琳，羅世博，古麗格娜·皮達買買提，劉媛夢,3，高紅艷,

（1.伊犁師范大學化學化工學院，新疆伊寧 835000；2.新疆普通高等學校天然產物化學與應用重點實驗室，新疆伊寧 835000；3.污染物化學與環境治理重點實驗室，新疆伊寧 835000）

準噶爾山楂（Crataegus songarica），屬薔薇科山楂屬光核組，小喬木或灌木[1]，作為天山野果林的主要樹種之一，準噶爾山楂具有較高的營養價值和藥用價值[2]。其果實中含有多糖、黃酮和三萜等多種成分[3-4]，具有抗氧化、保肝和抗衰老等功效[5-7]，三萜類化合物在植物中部分以游離的形式存在，多數與糖以苷鍵或酯鍵相結合，其基本碳架是由30 個碳原子構成[8-9]，具有抗氧化[10]、保肝[11-12]、保護腎臟[13]、抗癌[14]、降血脂[15]、降糖[16]、抗炎[17]、抑菌[18]等生物活性，具有極大的藥用價值。為了研究準噶爾山楂的藥理作用是否與其總三萜的含量相關，首先對其總三萜的提取和純化工藝進行優化，目前有關總三萜提取的方法主要有回流提取法、酶輔助提取法、超聲輔助提取法、微波輔助提取法以及超臨界CO2流體萃取法等。相比于其他提取方法，酶輔助提取法條件溫和，操作方便且對環境無污染，是利用各種酶來破壞植物細胞壁的結構完整性，從而提高植物中生物活性物質的提取，多種酶協同作用，可以提高提取效率[19-20]，超聲輔助提取法同樣能夠破壞細胞壁，使有效成分溶出。大孔樹脂具有機械強度高、耐酸堿性能好、使用壽命長等優點，被廣泛用于天然產物的分離純化和富集[21-22]。

目前對準噶爾山楂總三萜的研究存在空缺，無法以現有研究高效利用準噶爾山楂。因此本文采用酶-超聲分步提取法提取準噶爾山楂總三萜，運用比色法[23]以準噶爾山楂總三萜提取量為指標，通過單因素實驗、正交試驗和響應面試驗探究準噶爾山楂的提取工藝和大孔樹脂純化工藝，為準噶爾山楂的進一步研究與開發提供數據支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

準噶爾山楂 采于新疆伊犁州伊寧市內，去核，自然晾干至恒重，粉碎后過100 目篩，備用；無水乙醇 天津市致遠化學試劑有限公司；冰乙酸、乙酸鈉天津市福晨化學試劑廠；高氯酸 桃浦化工廠；香草醛 上海源葉生物科技有限公司，以上試劑均為分析純；D101 型大孔吸附樹脂 滄州茂全新材料科技有限公司；木瓜蛋白酶（800 U/mg）、齊墩果酸標準品（≥98%） 上海源葉生物科技有限公司；纖維素酶（＞3 U/mg）、中性蛋白酶（≥50 U/mg） 伊勢久（江蘇連云港）生物科技有限責任公司；果膠酶（500 U/mg）上海士鋒生物科技有限公司。

BSA124S 電子天平 德國賽多利斯股份公司；YB-150 高速多功能粉碎機 永康市速峰工貿有限公司；HH-S1數顯恒溫水浴鍋 金壇市醫療儀器廠；KM-300DE 超聲波清洗機 昆山美美超聲儀器有限公司；TDZ5-WS 多管架自動平衡離心機 長沙湘儀離心機儀器有限公司；WH220-HT 磁力攪拌器德國維根斯公司；Hei-VAP 旋轉蒸發儀 德國海道夫公司；UV2550 紫外-可見分光光度計 日本島津公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 單一酶提取單因素實驗 準確稱取0.5 g 準噶爾山楂粉末，選擇纖維素酶、果膠酶、木瓜蛋白酶和中性蛋白酶（質量比均為1%，2%，3%，4%，5%），以1:20 g/mL 的料液比加入pH5.0 的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液，55 ℃酶解60 min，后沸水浴滅活10 min，離心（4000 r/min，10 min），取上清液定容，計算總三萜提取量。

1.2.2 復合酶正交試驗 根據單一酶提取單因素實驗結果，選取纖維素酶、果膠酶和木瓜蛋白酶3 個因素，每個因素選取3 個水平，設計L9（34）正交試驗，篩選復合酶的最優配比，正交因素水平如表1 所示。

表1 正交試驗因素水平設計Table 1 Orthogonal experimental factor horizontal design

1.2.3 復合酶提取工藝單因素實驗 以提取物中總三萜提取量為指標，固定其他實驗條件，結合復合酶配比的正交試驗結果，分別對料液比、酶解時間、酶解溫度、酶解pH 等4 個因素對總三萜提取量的影響進行考察。

1.2.3.1 料液比對總三萜提取量的影響 稱取0.5 g準噶爾山楂粉末，以最優復合酶配比加入復合酶，固定其他單因素條件為：酶解時間60 min，酶解溫度為50 ℃，酶解pH5.0，考察料液比為1:10、1:15、1:20、1:25、1:30 g/mL 對總三萜提取量的影響。

1.2.3.2 酶解時間對總三萜提取量的影響 稱取0.5 g準噶爾山楂粉末，以最優復合酶配比加入復合酶，固定其他單因素條件為：料液比1:20 g/mL，酶解溫度為50 ℃，酶解pH5.0，考察酶解時間為30、60、90、120、150 min 對總三萜提取量的影響。

1.2.3.3 酶解溫度對總三萜提取量的影響 稱取0.5 g準噶爾山楂粉末，以最優復合酶配比加入復合酶，固定其他單因素條件為：料液比1:20 g/mL，酶解時間為60 min，酶解pH5.0，考察酶解溫度為40、45、50、55、60 ℃對總三萜提取量的影響。

1.2.3.4 酶解pH 對總三萜提取量的影響 稱取0.5 g準噶爾山楂粉末，以最優復合酶配比加入復合酶，固定其他單因素條件為：料液比1:20 g/mL，酶解時間為60 min，酶解溫度為50 ℃，考察酶解pH 為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0 對總三萜提取量的影響。

1.2.4 酶輔助提取準噶爾山楂總三萜的響應面優化設計 在單因素實驗結果的基礎上，以總三萜提取量為響應值，選擇料液比（A）、酶解溫度（B）和酶解時間（C）設計三因素三水平的響應面試驗，試驗因素水平如表2 所示。

表2 響應面試驗因素水平Table 2 Factor level of response surface experiment

1.2.5 酶-超聲分步提取準噶爾山楂總三萜 稱取0.3 g 準噶爾山楂粉末，在最優酶解提取條件下提取后，濾渣以1:15 g/mL 的料液比加入70%的乙醇，在超聲功率為120 W，超聲溫度為50 ℃的條件下提取30 min，抽濾，合并兩次提取液，定容，計算總三萜提取量。

1.2.6 總三萜提取量的測定 準確稱取5 mg 齊墩果酸標準品，70%乙醇溶解后定容至50 mL 容量瓶中，搖勻，即得0.1 mg/mL 的標準儲備液。分別吸取標準儲備液0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mL 置于比色管中，水浴蒸干溶劑，根據前期探究顯色條件的實驗結果，分別加入0.4 mL 顯色劑5%香草醛-冰乙酸，1.0 mL 穩定劑高氯酸（71%），60 ℃水浴15 min后，立即轉移至冰水浴，5 min 后取出，加入5 mL 冰乙酸，搖勻，在最大吸收波長550 nm 處測定吸光度。橫坐標為齊墩果酸的質量濃度C，縱坐標為吸光度A，繪制標準曲線，得到線性回歸方程A=55.88724C-0.05808，R2=0.9995。公式（1）為準噶爾山楂總三萜提取量的計算公式[24]：

式中：C 為總三萜的質量濃度，mg/mL；V 為所取提取液體積，mL；n 為稀釋倍數；m 為樣品質量，g。

1.2.7 大孔樹脂純化準噶爾山楂總三萜提取物

1.2.7.1 上樣液的制備 取準噶爾山楂粉末50 g，以1.2.5 的方法提取，合并提取液，減壓濃縮至無醇味，備用。

1.2.7.2 大孔樹脂預處理 稱取適量D101 型大孔樹脂以95%乙醇浸泡24 h，充分溶脹后過濾，濕法裝柱。先用95%的乙醇沖洗至流出液與蒸餾水混合無渾濁后，再用蒸餾水沖洗至流出液無醇味，備用[25]。

1.2.7.3 大孔樹脂純化準噶爾山楂總三萜的工藝優化 上樣液濃度的選擇：稱取相同質量預處理好的D101 型大孔樹脂5 份，濕法裝柱，柱體積為20 mL，分別制備濃度為2、4、6、8、10、12 mg/mL 的上樣液各10 mL，上樣速度為1 mL/min 吸附后，均用5 BV的水和 95%乙醇分步洗脫，收集洗脫液，計算洗脫液中總三萜濃度，并根據公式（2）計算吸附率，確定上樣液濃度。

式中，C0為起始樣品溶液中總三萜濃度，mg/mL；C1為吸附后樣品溶液中總三萜濃度，mg/mL。

上樣量的選擇：稱取預處理好的D101 型大孔樹脂，濕法裝柱，上樣液以1 mL/min 的流速上柱，流出液每5 mL 收集1 次，測定并計算每份流出液的總三萜濃度，繪制泄露曲線。

洗脫劑濃度的確定：稱取5 份預處理好的D101型大孔樹脂，濕法裝柱，取5 份15 mL，6 mg/mL 準噶爾山楂總三萜提取液，以1 mL/min 的流速上柱，吸附完成后用蒸餾水洗至流出液無色，分別用體積分數為10%、20%、50%、70%、90%的乙醇洗脫，每10 mL 收集1 次洗脫液，計算每份洗脫液以及合并洗脫液中總三萜的濃度，繪制不同乙醇濃度動態解吸曲線，確定洗脫液體積和濃度。

1.2.8 準噶爾山楂總三萜純度及回收率的計算 在上述篩選的純化工藝條件下，用D101 型大孔樹脂純化準噶爾山楂總三萜粗提物，流出液旋干，取0.01 g總三萜純化物（m1），以一定量（V1）的純水溶解，按照

1.2.6 的方法測定其總三萜濃度（C2），并根據公式（3）和公式（4）計算純度以及回收率[21]。

1.3 數據處理

每組實驗平行做3 次，結果取平均值，數據使用Origin 2022 軟件作圖，并使用IBM SPSS Statistics 26 和Design-Expert 8.0.6 進行數據分析。

2 結果與分析

2.1 單一酶提取效果

單一酶提取準噶爾山楂總三萜的用量結果如圖1 所示，由圖可知，隨著酶用量的增加，4 種酶輔助提取效果均呈現先增加后減小的趨勢，這可能是由于酶的作用使準噶爾山楂細胞的通透性增強，總三萜更易溶出，從而提高其提取效果，但達到最高點后呈現下降趨勢，可能是過量的酶會包裹原料顆粒，不利于三萜的溶出，造成總三萜提取率的下降[26-27]。總體來看，果膠酶對準噶爾山楂總三萜的提取效果最好，木瓜蛋白酶與中性蛋白酶輔助提取的最高提取量相近，但考慮到經濟效益，選擇木瓜蛋白酶進行后期實驗。因此選擇纖維素酶（2%、3%、4%），果膠酶（2%、3%、4%），木瓜蛋白酶（1%、2%、3%）進行正交試驗確定復合酶輔助提取準噶爾山楂總三萜的酶比例。

圖1 單一酶提取單因素實驗Fig.1 Single factor experiment of single enzyme extraction

2.2 復合酶比例對總三萜提取量的影響

復合酶輔助提取準噶爾山楂總三萜的正交試驗結果和方差分析結果見表3 和表4，通過極差分析可知，三種酶對準噶爾山楂總三萜提取結果的影響程度的順序為A＞B＞C，即纖維素酶＞果膠酶＞木瓜蛋白酶，且據方差分析可知，纖維素酶對準噶爾山楂總三萜提取效果有顯著影響（P＜0.05），果膠酶和木瓜蛋白酶無顯著影響（P＞0.05）。確定復合酶提取準噶爾山楂總三萜的最優比例A3B3C2，即纖維素酶4%，果膠酶4%，木瓜蛋白酶2%，與正交試驗結果一致。根據優化條件進行3 次平行實驗，結果顯示準噶爾山楂總三萜的平均提取量為（23.536±0.601）mg/g，說明此方法具有較好的穩定性和可行性。

表3 復合酶比例正交試驗結果Table 3 Orthogonal experimental results of compound enzyme ratio

表4 方差分析結果Table 4 Results of variance analysis

2.3 復合酶提取單因素實驗

2.3.1 料液比對總三萜提取量的影響 由圖2 可知，總三萜的提取量在此范圍內隨料液比的逐漸增大而呈現先增加后降低的趨勢，當料液比達到1:20 g/mL時，總三萜提取量顯著高于其他（P＜0.05），分析原因可能是提取劑的體積增加，使固液之間總三萜的濃度差增大，有利于其傳質作用，但是由于樣品中總三萜提取量有限，且其他物質也更容易被溶解，并與三萜競爭溶劑，導致料液比繼續增加時，總三萜提取量呈現下降趨勢[28-29]。因此，選擇1:15、1:20、1:25 g/mL的料液比進行下一步響應面優化試驗。

圖2 料液比對總三萜提取量的影響Fig.2 Effect of liquid material ratio on the extraction amount of total triterpenoids

2.3.2 酶解時間對總三萜提取量的影響 由圖3 可知，在30～60 min 時，準噶爾山楂總三萜的提取量呈現上升趨勢，而60 min 之后則呈現逐漸下降趨勢，酶解時間為60 min 時，提取物中總三萜提取量顯著高于其他（P＜0.05）。這可能是由于酶解時間過短時，細胞壁的結構沒有被完全破壞，酶解不充分，時間過長則會使更多其他成分溶解于提取液中，且可能會破壞有效成分的結構，影響總三萜的提取效果[30]。因此，選擇酶解時間30、60、90 min 進行下一步響應面優化試驗。

圖3 酶解時間對總三萜提取量的影響Fig.3 Effect of enzymatic hydrolysis time on the extraction amount of total triterpenoids

2.3.3 酶解溫度對總三萜提取量的影響 由圖4 可知，酶解溫度對準噶爾山楂總三萜的提取效果影響較大，溫度過高或過低都不利于總三萜的提取，當溫度達到50 ℃時，提取液中總三萜的提取量最高，當溫度持續升高時，總三萜的提取量出現急劇下降，分析原因可能是溫度升高有利于提高酶活性和分子擴散速率，從而加快提取速率，但是溫度超過50 ℃時，酶活性降低，提取效率下降[31]。因此，選擇酶解溫度45、50、55 ℃進行下一步響應面優化試驗。

圖4 酶解溫度對總三萜提取量的影響Fig.4 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on the extraction amount of total triterpenoids

2.3.4 酶解pH 對總三萜提取量的影響 酶都有最適宜的pH，過酸或過堿都有可能造成酶的變性，從而失去活性。由圖5 可知，準噶爾山楂總三萜的提取量隨著酶解pH 的增大，總體呈現先增大后減小的趨勢，當pH 為4.5 時，提取液中總三萜的提取量最高，繼續增大pH 時，提取量反而下降，說明pH4.5 為酶解的最適宜pH，在此之外酶活性降低。因此，選擇酶解的最適宜pH4.5 進行下一步實驗。

圖5 酶解pH 對總三萜提取量的影響Fig.5 Effect of enzymatic hydrolysis pH on the extraction amount of total triterpenoids

通過以上單因素實驗結果可以看出，料液比、酶解溫度和酶解時間的不同均對準噶爾山楂總三萜的提取量有較大影響，而改變酶解pH 對準噶爾山楂總三萜提取量的影響不大，因此選擇料液比、酶解溫度、酶解時間進行響應面優化試驗，在試驗過程中，酶解pH 均為4.5。

2.4 響應面優化酶輔助提取準噶爾山楂總三萜的工藝

2.4.1 響應面試驗結果 根據Box-Behnken 試驗設計原理，優化提取工藝，分析各因素對總三萜提取效果的綜合影響，試驗結果見表5。

表5 響應面試驗設計方案與結果Table 5 Test design and results of response surface methodology

運用Design-Expert 8.0.6 軟件對表中數據進行分析和數據擬合，得到二項多次回歸方程為：Y=36.72+0.13A+0.26B+0.29C+0.01AB+0.45AC-7.25×10-3BC-0.23A2-1.00B2-0.61C2。為檢驗方程是否有效，利用軟件對其回歸模型進行方差分析，結果見表6。由表6 可知，回歸模型極顯著（P＜0.01），R2=0.9536，失擬項不顯著（P＞0.05），說明模型擬合較好，其他因素對實驗結果的影響較小，可用于分析響應值，預測實驗結果。由表6 可知，在一次項中，酶解溫度（B）和酶解時間（C）對總三萜提取量的影響差異顯著（P＜0.05），料液比（A）對總三萜提取量的影響差異不顯著（P＞0.05），二次項中B2的影響高度顯著（P＜0.0001），C2影響極顯著（P＜0.01），交互項中AC 影響極顯著（P＜0.01），AB 和BC 影響不顯著（P＞0.05）。比較F值可知，各因素對提取量的影響大小順序為：酶解時間（C）＞酶解溫度（B）＞料液比（A）。

表6 回歸模型方差分析結果Table 6 Results of variance analysis of regression model

通過回歸方程作響應面圖和等高線圖（見圖6），可以更直觀地反映各因素的交互作用對總三萜提取量的影響。響應面圖曲線彎曲明顯，顏色變化快，等高線呈現橢圓形說明兩個因素交互作用大，反之，曲線彎曲程度小，顏色變化不快，等高線呈現圓形，則說明兩個因素交互作用對響應值的影響不明顯。因此，由圖6 可知，A（料液比）和C（酶解時間）的交互作用對總三萜提取量的影響最大，A（料液比）和B（酶解溫度）交互作用影響其次，B（酶解溫度）和C（酶解時間）的交互作用對總三萜提取量的影響最弱。

圖6 各因素交互作用對準噶爾山楂總三萜提取量影響的響應面及等高線圖Fig.6 Response surface and contour map of the effect of interaction of various factors on the total triterpenoids extraction amount of Crataegus songarica

2.4.2 最優工藝驗證實驗結果 運用Design-Expert 8.0.6 軟件分析得出準噶爾山楂總三萜的最優提取工藝為：料液比為1:24.06 g/mL，酶解溫度為50.66 ℃，酶解時間為75.99 min，預測在此條件下總三萜的提取量為36.865 mg/g。根據實際操作調節，調整最優條件為：料液比為1:24 g/mL，酶解溫度為51 ℃，酶解時間為76 min。通過3 次平行實驗驗證，得到在此條件下總三萜的平均提取量為（36.570±0.332）mg/g，實驗結果與預測值相近，說明此方法具有可行性且穩定性高。

2.5 酶-超聲分步提取準噶爾山楂總三萜

在最優酶解條件下提取結束后，再進行超聲提取，通過3 次平行實驗，得出酶-超聲分步提取準噶爾山楂總三萜的提取量為（53.782±0.673）mg/g。實驗結果說明酶解后的濾渣再次進行超聲提取能夠明顯增加總三萜的提取效果，且具有穩定性。

2.6 大孔樹脂純化準噶爾山楂總三萜提取物

2.6.1 大孔樹脂純化工藝

2.6.1.1 上樣液濃度的選擇 由圖7 可知，吸附率在2～6 mg/mL 的范圍內呈逐漸上升趨勢，這可能是由于上樣液濃度增大后，溶液中三萜與大孔樹脂接觸的幾率也逐漸增大，而隨著上樣液濃度的進一步增加，樣液中其他成分的濃度也會增大，與三萜競爭活性位點，導致吸附率呈下降的趨勢[32]。當上樣液濃度為6 mg/mL 時，大孔樹脂吸附率最高，之后開始呈現下降趨勢。

圖7 上樣液濃度對總三萜吸附率的影響Fig.7 Effect of loading concentration on the adsorption rate of total triterpenoids

2.6.1.2 上樣量的選擇 由圖8 可知，隨著上樣體積的逐漸增加，流出液中的總三萜濃度呈現先平緩后快速上升，最后又平緩上升的趨勢。當流出液為15 mL時，流出液中總三萜的濃度上升到上樣液總三萜濃度的1/10，達到泄露點[11]，隨后總三萜開始大量泄露，因此選擇15 mL 為上樣液體積。當流出液體積為60 mL 后，流出液總三萜濃度逐漸與上樣液總三萜濃度接近，因此上樣液體積最大不應超過60 mL。

圖8 大孔樹脂動態吸附曲線Fig.8 Dynamic adsorption curve of microporous resin

2.6.1.3 洗脫液的選擇 不同乙醇濃度的解吸曲線如圖9 所示。由圖9 可知，當乙醇濃度為70%和90%時，均能夠迅速將吸附的三萜洗脫下來，在洗脫液通過體積為20 mL 時達到高峰，洗脫液體積為50 mL時，被吸附的三萜類化合物基本被洗脫，洗脫曲線出峰快，無明顯拖尾現象，而乙醇濃度較低時，三萜難以被洗脫。因此為了節約試劑，并提高純化效率，選擇70%的乙醇進行洗脫，洗脫液體積為50 mL。

圖9 不同乙醇濃度時大孔樹脂的洗脫曲線Fig.9 Elution curves of macroporous resin at different ethanol concentrations

2.6.2 大孔樹脂純化準噶爾山楂總三萜提取液的工藝 在以上優化的純化條件下純化準噶爾山楂總三萜粗提物，經測定計算得純化前后總三萜的純度由2.52%提高至29.93%，回收率為81.25%。實驗結果表明D101 型大孔樹脂能夠用于純化準噶爾山楂總三萜，回收率較高，但純化效果一般，提取物中仍含有其他成分，說明大孔樹脂只能除去一部分雜質，并不能達到精制的目的，若想得到純度高的總三萜純化物，還需進行二次純化。

3 結論

通過設計正交試驗和響應面試驗確定準噶爾山楂總三萜的最優提取條件為纖維素酶、果膠酶和木瓜蛋白酶的添加量分別為4%、4%和2%，料液比為1:24 g/mL，溫度51 ℃，pH 為4.5，酶解76 min，提取量為（36.570±0.332）mg/g，通過超聲再次提取后，總三萜提取量達到（53.782±0.673）mg/g,說明酶-超聲分步提取法能夠顯著提高準噶爾山楂總三萜的提取量。其次，通過D101 型大孔樹脂確定純化工藝為：上樣液濃度為6 mg/mL，流速：1 mL/min，上樣量：15 mL，洗脫條件為50 mL，70%乙醇，純化后的準噶爾山楂總三萜的純度可達29.93%，回收率為81.25%，說明大孔樹脂可以除去一部分雜質，提高準噶爾山楂總三萜的純度，但若想得到純度更高的三萜純化物，還需進一步純化精制。以上提取工藝和純化工藝的建立，均為準噶爾山楂總三萜的成分研究和富集提供了新的實驗依據，而且方法條件溫和，效率高且穩定性好。實驗只針對提取的酶解部分進行了條件優化，對超聲部分的提取條件還有待進一步優化，同時還需要對大孔樹脂純化后的純化物進行進一步精制，并對其純化前后的生物活性進一步研究。

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