QuEChERS-超高效液相色譜-串聯質譜法測定茶葉中47 種農藥殘留

劉華文，鄧美晴，陳北燕

（1.廣西-東盟食品檢驗檢測中心，廣西南寧 530029；2.廣西醫科大學，公共衛生學院，廣西南寧 530022；3.南寧市衛生學校，廣西南寧 530409）

我國茶葉有著悠久的歷史，其本身具有抗氧化、抗菌、抗癌和抗炎作用，還能降低血壓，減少膽固醇和心血管疾病的患病風險[1]。我國茶葉種植存在過量使用農藥的情況，且使用的大多數是化學類農藥[2]。此類農藥作用單一無法達到大規模的病蟲治理，且使害蟲的抗藥性不斷提高，從而促使茶農使用復配農藥，造成農藥殘留現象愈發嚴重[3-5]。此外，發達國家對進口產品的檢驗標準不斷提高，而我國的茶葉因農藥殘留不達標而被阻止出口。茶葉中農藥殘留超標已成為中國茶葉出口最主要的技術性貿易壁壘[6]。目前，各國在茶葉產品中農藥殘留的監測重點是制定各種農藥的最大殘留限量（Maximum residue limit，MRL）和開發準確快速的定性、定量分析方法[7]。我國從2005 年起開始對茶葉產品中農藥的MRL 做出強制性要求限制，但仍不及歐盟等發達國家的要求。

目前研究較為深入、使用最廣泛的茶葉農藥殘留檢測技術主要有氣相色譜法、氣相色譜-串聯質譜法、液相色譜法、液相色譜-串聯質譜法[8]等；前處理方法有超聲提取法[9]、均質提取法[10]、索氏提取法、固相萃取法[11]等。大多前處理方法操作繁瑣，試劑消耗量較大。QuEChERS 方法是近年來國際上最新發展起來的一種快速樣品前處理技術[12]，因其具有快速（Quick）、簡單（Easy）、便宜（Cheap）、有效（Effective）、可靠（Rugged）、安全（Safe）的特點而得名[13-16]。QuEChERS 法分為提取和凈化兩部分：使用適宜的溶劑提取待測物，并針對雜質選用適宜的凈化劑，一般常用的凈化劑有N-丙基乙二胺（PSA）、十八烷基鍵合硅膠（C18）、石墨化碳黑（Graphitizing of carbon black，GCB）等。由于茶葉基質復雜，采用常用凈化劑進行凈化，凈化結果不徹底，會存在基質干擾現象[17-18]。多壁碳納米管（MWCNTs）[19-20]是一種新型碳納米材料，由多層石墨片卷曲而成的碳納米管，層與層之間呈無序排列，具有比表面積大、化學穩定性好、吸附能力強等優點。通過向吸附劑中加入多壁碳納米管，改進QuEChERS 法對茶葉的凈化能力，液質聯用法進行檢測的研究鮮有報道。因此，本研究將QuEChERS 技術和多壁碳納米管凈化劑相結合，采用超高效液相色譜-串聯質譜法檢測茶葉中農藥殘留，建立一種快速、簡便、高效的檢測茶葉中多種農殘的方法，為茶葉農藥的使用、監管提供技術及數據支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

空白茶葉 購于本地有機茶社；待測茶葉100 份，包含綠茶20 份、紅茶20 份、白茶10 份、黑茶25 份、花茶25 份，分別購自廣西各地；47 種農藥標準物質分別為毒蟲畏、甲拌磷、甲拌磷砜、甲拌磷亞砜、甲基異柳磷、特丁硫磷、特丁硫磷砜、特丁硫磷亞砜、克百威、硫環磷、甲基硫環磷、甲胺磷、樂果、滅線磷、內吸磷、水胺硫磷、氧樂果、乙酰甲胺磷、滅多威、辛硫磷、吡蟲啉、敵百蟲、多菌靈、甲萘威、茚蟲威、啶蟲脒、噻蟲胺、噻蟲啉、噻蟲嗪、噻嗪酮、喹螨醚、噻螨酮、乙螨唑、除蟲脲、啶氧菌酯、呋蟲胺、氟蟲脲、唑蟲酰胺、甲氨基阿維菌素甲酸鹽、醚菊酯、吡唑醚菌酯、殺蟲威、殺螟松、氟蟲腈砜、氟蟲腈、氟蟲腈亞砜、氟甲腈 純度均大于99%，德國Dr Ehrenstorfer 公司；乙腈、甲酸、甲醇 色譜純，德國默克公司；乙酸銨 色譜純，天津市光復精細化工研究所；QuEChERS 提取鹽包 含6 g 無水硫酸鎂和1.5 g 無水乙酸鈉，美國Waters 公司；多壁碳納米管 MWCNTs，成都中科時代納能科技有限公司；N-丙基乙二胺 PSA，天津博納艾杰爾科技有限公司；十八烷基鍵合硅膠 C18，廣州沃恩生物科技有限公司；實驗室用水 超純水。

1290 超高效液相色譜儀 美國Agilent 公司；TRIPLE QUAD 5500 三重四極桿串聯質譜儀（配備AB SCIEX 數據處理軟件、電噴霧源） 美國AB SCIEX 公司；MS303TS 型電子天平 梅特勒－托利多儀器（上海）公司；Multi Reax 渦旋儀 德國Heidolph 公司；Shaker SA320 振蕩器 日本YAMATO公司；X3R 高速冷凍離心機 美國熱電Thermo 公司；Gradient A10 Milli-Q 超純水機 美國Millipore 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品前處理 提取：精密稱取粉碎茶葉樣品2.000 g（精確至0.001 g）于50 mL 離心管中，加入5 mL 水浸泡30 min，接著加入15 mL 1% 乙酸乙腈溶液，在渦漩儀上渦漩振蕩提取25 min（450 次/min），然后加入QuEChERS 鹽析劑（1.5 g 乙酸鈉，6 g 無水硫酸鎂），立即搖勻，置于振蕩器上劇烈振蕩3 min（450 次/min），以10000 r/min 離心5 min，上清液待凈化。

凈化：取上清液8 mL，轉移到含有1200 mg 無水硫酸鎂、50 mg MWCNTs、100 mg PSA 和100 mg C18的凈化管中，渦漩2 min（450 次/min），以10000 r/min 離心5 min，精密吸取上清液2 mL，氮吹至近干，甲醇定容1 mL，過0.22 μm 有機濾膜，供UPLC-MS/MS 分析。

1.2.2 標準溶液配制 準確稱取適量標準物質，根據標準物質的溶解性選用甲醇或乙腈分別配制成1 mg/mL 的標準儲備液，-20 ℃保存。分別適量移取一定體積的各標準儲備液于同一10 mL 容量瓶中，乙腈定容至刻度，得到10 μg/mL 的混合標準溶液，再精密量取1 mL 混合標準溶液于100 mL 容量瓶中，乙腈稀釋定容至刻度得到0.1 μg/mL 混合標準使用液，用于繪制標準曲線。

稱取空白基質樣品，按“1.2.1”處理后，得到空白基質溶液。分別精密吸取混合標準使用液0、0.02、0.05、0.1、0.5、1.0 mL，用空白基質溶液配制成濃度為0、2、5、10、50、100 ng/mL 系列基質混合標準工作曲線。

1.2.3 超高效液相色譜條件 色譜柱：InertsilTMODS-3 色譜柱（3 μm，2.1 mm×150 mm）；流動相：A 為0.1%甲酸水，B 為甲醇。梯度洗脫程序：0～1.5 min，97%A；1.5～2.5 min，85%A；2.5～9 min，50%A；9～11 min，30%A；11～13 min，2%A；13～13.1 min，97% A；13.1～15 min，97% A；流速：300 μL/min；柱溫：35 ℃；進樣量：2.0 μL。

1.2.4 質譜條件 離子源：電噴霧離子源（ESI）；掃描方式：正、負離子同時掃描；檢測模式：多反應監測（Multiple reaction monitoring，MRM）；電噴霧電壓：5500 V 和-4500 V，霧化氣（氮氣）壓力：55 psi；輔助氣壓力：60 psi；氣簾氣（氮氣）壓力：30 psi；碰撞氣（氮氣）壓力：7 psi；離子源溫度：550 ℃；掃描時間：60 ms；碰撞室入口電壓：7 V；碰撞室出口電壓：12 V；各目標化合物的質譜采集參數見表1。

表1 47 種農藥的多反應監測掃描模式的質譜參數Table 1 MRM mass spectrometric parameters of 47 kinds of pesticides

1.3 數據處理

分別利用Analyst Software 和MutiQuant 3.0.2軟件（AB SCIEX）進行數據采集及處理，Excel 2013進行數據匯總和分析。

2 結果與分析

2.1 提取液的優化

目前，農藥殘留的提取溶劑主要有乙腈、乙酸乙酯、丙酮、甲醇、甲苯、正己烷和石油醚[21-24]等。茶葉基質比較復雜，使用乙酸乙酯、丙酮、甲醇等作為提取溶劑時，提取液顏色很較深，提取物也更多，不利于后續凈化。而乙腈作為提取溶劑，因其極性較強，對于油性物質如蠟、脂肪、油性色素等不易提取出，可減小雜質的干擾，最適于提取各種極性的農藥殘留，且僅加入鹽便可實現與水相的分離[25]。在乙腈中加入少量有機酸，可防止部分農藥分解及調節pH，因此加入1%乙酸[26]。對于含水量低的樣品，通過先向樣品中添加一定量的水，可弱化分析物與樣品基質之間的相互作用，使待分析物更易在萃取分配過程中被充分提取。通過UPLC-MS/MS 全掃描得到的總離子流圖顯示，乙酸乙腈提取的共萃物少（圖1）。因此，本研究采用加入5 mL 超純水潤濕茶葉后加入15 mL 1%乙酸乙腈作為提取溶劑。

圖1 1%乙酸乙腈作為提取溶劑的總離子流圖Fig.1 TIC of 1% acetic acid acetonitrile as solvents for extraction

2.2 凈化條件的優化

茶葉基質復雜，富含色素、茶多酚、生物堿、咖啡堿和脂肪酸等物質，水分含量極低[27]。茶葉樣品經過有機溶劑提取后，樣液多呈深紅色，若不采取方法對提取液進行凈化，直接進儀器分析，既污染色譜柱和離子源，又影響儀器的響應，干擾檢測的靈敏度和準確性[28]。常見的凈化劑有無水硫酸鎂、MWCNTs、GCB、C18、PSA 等。提取時加入無水硫酸鎂能除去茶葉中的水分，保證其他凈化填料的吸附效果[29]，同時避免水分損害儀器和毛細柱，降低柱效。PSA 的表面鍵合極性官能團，具有極性吸附作用和弱陰離子交換功能，對樣品基質中的有機酸、極性色素、糖類等雜質吸附能力較強[30-31]。相反，C18可去除酯類和脂肪等非極性干擾物的影響。GCB 具有片狀結構，是一種非極性吸附劑，對含苯環官能團的化合物有較強的吸附作用，可有效去除具有平面結構的甾醇和色素雜質，但也會對平面結構的有機氯農藥進行吸附，導致有機氯農藥回收率降低。相比于GCB，MWCNTs的空心柱狀結構對農藥吸附作用很小，對色素的吸附能力更強，更易獲得較高的回收率。因此本實驗選取無水硫酸鎂、PSA、C18、MWCNTs 作凈化劑，比較不同配比的凈化效果。取8 mL 提取液，固定加入1200 mg 無水硫酸鎂，分別考察PSA 添加量為50、100、200、300、400、600 mg 的回收率，在PSA 添加量為100 mg 時，各農藥的平均回收率為73.2%～110.1%；固定1200 mg 無水硫酸鎂、100 mg PSA 用量，比較MWCNTs 添加量為50、100、200、300、400、600 mg 的回收率，在MWCNTs 添加量為50 mg時，各農藥的平均回收率為68.0%～111.7%；固定1200 mg 無水硫酸鎂、100 mg PSA、50 mg MWCNTs用量，比較C18添加量為50、100、200、300、400、600 mg 的回收率，在C18添加量為100 mg 時，各農藥回收率為73.4%～114.3%。最終凈化配比為無水硫酸鎂1200 mg、MWCNTs 50 mg、PSA 100 mg、C18100 mg（圖2）。

圖2 不同凈化條件的回收率Fig.2 Recovery rate of different purification conditions

2.3 質譜條件的優化

將各農藥配制成0.05 μg/mL 的混合標準溶液。用蠕動泵直接注入質譜儀，采用正、負離子掃描模式，優化錐孔電壓使母離子響應豐度最大且穩定，同時優化碰撞能量，選取響應豐度較高、易得到、出峰穩定的碎片離子作為子離子，并將母離子和子離子組成離子對。具體質譜參數見表1。

2.4 液相色譜條件的優化

在優化的質譜條件下，考察不同色譜柱不同流動相對目標物質譜信號的影響。本實驗對比了四種色譜柱，ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（1.7 μm，2.1 mm×150 mm）、ATLANTIS T3色譜柱（3 μm，2.1 mm×150 mm）、INERTSILTMODS-3 色譜柱（3 μm，2.1 mm×150 mm）、CAPCELL PAK BBH C18色譜柱（3 μm，2.1 mm×150 mm）。甲酸和乙酸銨具有增強目標化合物離子化程度和改善峰形的作用[14]，因此，分別考察0.1%甲酸水-甲醇、0.1%甲酸水-乙腈、5 mmol/L 乙酸銨溶液-乙腈幾種流動相對目標化合物的影響。對比圖3A～D，同種流動相下ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱、Atlantis T3色譜柱、CAPCELL PAK BBH C18色譜柱、INERTSILTM ODS-3 色譜柱，使用INERTSILTMODS-3 色譜柱的色譜圖目標化合物響應均高于其它3 根色譜柱；對比圖3D～F，同種色譜柱中的三種流動相體系出峰均良好，間距適宜。使用INERTSILTMODS-3 色譜柱，對比0.1%甲酸水-甲醇流動相體系和5 mmol/L 乙酸銨溶液-乙腈流動相體系，殺蟲威、除蟲脲在5 mmol/L 乙酸銨溶液-乙腈流動相中出現雜峰，特丁硫磷砜在0.1%甲酸水-甲醇流動相中響應值較高。使用INERTSILTMODS-3 色譜柱，對比0.1%甲酸水-甲醇和0.1%甲酸水-乙腈流動相，提取目標化合物離子對，結果顯示使用0.1%甲酸水-甲醇體系時絕大部分化合物的響應都高于0.1%甲酸水-乙腈體系。因此，選用INERTSILTMODS-3 色譜柱和0.1%甲酸水-甲醇體系。

圖3 不同色譜柱和流動相的色譜圖Fig.3 Chromatogram of different chromatographic columns and mobile phases

2.5 基質效應

基質效應（Matrix effect，ME）是指樣品中除待測物以外的組分，常常對分析物的分析過程有明顯的干擾，并影響分析結果的準確性。基質效應可用以下公式計算：

式中，ME 為基質效應；A 為溶劑標準曲線的斜率；B 為基質匹配標準曲線的斜率。若ME＜0.8，則表現為基質抑制效應，ME＞1，則為基質增強效應，ME=0.8～1，則表現為基質效應影響不大。本實驗對47 種化合物的基質效應進行評估（圖4），發現47 種化合物的基質效應均低于1，其中85%的化合物受到基質抑制，因此本方法檢測采用基質匹配曲線，以此滿足農藥殘留的檢測要求。

圖4 47 種化合物在茶葉中的基質效應Fig.4 Matrix effects of 47 compounds in tea

2.6 線性范圍、檢出限、定量限

在優化的實驗條件下，按“1.2.2”配制6 個濃度水平的基質工作溶液，上機測定，以目標物的質量濃度為橫坐標，對應的定量離子峰面積為縱坐標繪制標準曲線。如表2，47 種目標化合物在2～100 ng/mL范圍內線性良好，相關系數為0.9971～0.9996，檢出限（LOD）為0.001～0.006 mg/kg，定量限（LOQ）為0.002～0.020 mg/kg，滿足農藥殘留的檢測要求。

表2 47 種化合物的線性范圍、回歸方程、相關系數、檢出限、定量限和食品中農藥最大殘留限量（MRL）Table 2 Linear ranges,regression equations,correlation coefficients,LOD,LOQ and maximum residue limits (MRL) for pesticides in food of 47 compounds

2.7 回收率

根據GB/T 27404-2008[33]對食品理化檢測的質量控制要求，分別向空白茶葉樣品添加低、中、高3 水平加標回收實驗，平行測試6 次，結果見表3。47 種化合物的平均回收率為73.4%～114.3%，相對標準偏差（RSD%）為0.3%～19.9%（n=6），方法具有良好的回收率與精密度。

表3 47 種化合物的加標回收率及相對標準偏差（n=6）Table 3 Recovery rates and relative standard deviations of 47 compounds (n=6)

2.8 實際樣品檢測

利用本次實驗建立的方法和國家標準方法GB 23200.121-2021[34]分別對廣西省內銷售的100 份茶葉進行農藥殘留分析，包含綠茶20 份、紅茶20 份、白茶10 份、黑茶25 份、花茶25 份。部分農藥超出國家標準限值，結果見表4，其余農藥均為未檢出。

表4 QuEChERS 方法和國家標準方法結果對比Table 4 Comparison results of QuEChERS method and national standard method

3 結論

本文采用優化QuEChERS 方法進行前處理，超高效液相色譜-串聯質譜作為檢測儀器，在最優的實驗條件下，47 種農藥平均回收率為73.4%～114.3%，相對標準偏差為0.3%～19.9%（n=6），檢出限為0.001～0.006 mg/kg，定量限為0.002～0.020 mg/kg，并對廣西省內銷售的100 份茶葉進行農藥殘留分析，包含綠茶20 份、紅茶20 份、白茶10 份、黑茶25 份、花茶25 份，其中檢出綠茶中水胺硫磷1.78 mg/kg、吡蟲啉0.65 mg/kg，紅茶中氧樂果0.061 mg/kg，其余農藥均為未檢出。與國家標準方法相比，標準偏差SD 值滿足農藥殘留的檢測要求。該方法靈敏、準確、穩定，可滿足茶葉中47 種農藥殘留的檢測要求。

? The Author(s) 2024.This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License (https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).