不同產地覆盆子乙醇提取物中的酚類物質及其抗糖尿病活性

王佩欣，盧菲艷，張 露，周雯娜，彭春彥，陳明舜 ，涂宗財,3

（1.江西師范大學健康學院，江西南昌 330022；2.江西師范大學國家淡水魚加工技術研發專業中心，生命科學學院，江西南昌 330022；3.南昌大學食品科學與資源挖掘全國重點實驗室，江西南昌 330047）

藥用覆盆子（Rubus chingiiHu）是薔薇科懸鉤子屬華東覆盆子的未成熟干燥果實，因葉裂如掌又稱掌葉覆盆子。全世界大約有750 余種藥用覆盆子，大多數種植于北半球溫帶，少數種植于熱帶，藥用覆盆子在我國主要分布于江蘇、浙江、安徽、福建、江西、廣西等地[1-2]。近十年來，許多國內外研究發現，藥用覆盆子中含有酚酸、黃酮、單寧、多糖、生物堿、萜類及甾體等多種活性成分，其中水解單寧、酚酸、黃酮等酚類物質為其主要活性成分[3-4]。藥理研究表明，覆盆子具有抗氧化、降血糖、降血脂、抗癌、抗衰老、改善學習能力、調節性激素水平等作用[5-6]。

然而，受品種、地理位置和生長條件的影響，植物營養成分組成和活性可能存在較大差異。平嘉倩等[7]研究發現不同品種和產地的覆盆子總糖、糖酸比、VC和氨基酸含量差異顯著，江西覆盆子的果糖含量、糖酸比最高，福建的最低，但福建覆盆子卻含有較高的氨基酸和礦質元素。付彩群等[8]研究發現產地、采收期是造成藥用覆盆子酚類化合物含量差異的主要原因，浙江產地覆盆子中鞣花酸含量明顯高于江西，而向陽與背陽對覆盆子活性成分含量的影響較小。Park 等[9]的研究發現Gokseong 的覆盆子具有最高的多酚含量，Jeongeup 的覆盆子具有最高的黃酮含量，Gochang、Sunchang、Jeongeup 和Jinan等地覆盆子中花色苷的含量要略多于Gokseong 和Hoengseong。然而，很少有研究集中在來自不同產地的覆盆子酚類物質組成及活性的差異。

綜上，產地不同會導致覆盆子中活性成分含量差異顯著，但國內外對覆盆子的研究主要集中在活性成分分離鑒定及種質資源的評價和利用方面，而關于產地對覆盆子酚類物質及活性影響的研究較少。本文采用40%乙醇提取廣東、廣西、安徽、浙江、江西和四川六個不同產地覆盆子酚類物質，評價不同產地覆盆子提取物中總酚、總黃酮和總水解單寧的含量以及酚類物質的組成，并對比不同產地覆盆子體外抗糖尿病活性，以期獲得較優品質的覆盆子，為后續覆盆子的深度加工提供借鑒，促進覆盆子資源的高值化利用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

覆盆子 2022 年5 月于廣東、廣西、安徽、浙江、江西和四川六個產地采集，江西師范大學生命科學學院袁濤教授鑒定為薔薇科懸鉤子屬，曬干后-4 ℃保存備用；無水乙醇 天津永大化學試劑有限公司；牛血清白蛋白、葡萄糖、沒食子酸、槲皮素、維生素C（VC）標準品、三氯化鋁、碳酸鈉、碘酸鉀、福林酚 北京索萊寶科技有限公司；α-葡萄糖苷酶（100 U）、對硝基苯基-D-吡喃葡萄糖苷（PNPG）、阿卡波糖、2,2'-聯氨-雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二胺鹽（ABTS）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）美國Sigma 公司；甲酸、乙腈 色譜純，阿拉??；所有實驗用水均為雙蒸水。

KH-500DE 型數控超聲波清洗器 昆山禾創超聲儀器有限公司；RV10 型旋轉蒸發儀 德國IKA有限公司；Synergy H1 型酶標儀 美國Biotek 儀器有限公司；F-7000 型熒光分光光度計 日本日立有限公司；ESJ200-4 型電子天平 沈陽龍騰電子有限公司；5430R 型離心機 艾本德中國有限公司；Triple TOF 5600+液相色譜-質譜聯用儀 AB SCIEX 儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 覆盆子提取物的制備 參照前期優化的方法提取覆盆子中的酚類物質[5]，將六個產地的藥用覆盆子粉碎成粉末后，按1:10 的料液比（g/mL）加入40%乙醇，混勻后于KH-500DE 數控超聲波清洗器中400 W，50 ℃超聲提取1 h，抽濾，收集上清液，殘渣再在相同條件下提取一次，合并所有上清液，旋轉蒸發濃縮后冷凍干燥至粉末狀，制得覆盆子提取物樣品，于4 ℃冷藏備用。

1.2.2 總酚含量的測定 參照文獻步驟，采用福林酚法檢測樣品的總酚含量[10]。取200 μL 0.25 mg/mL樣品與0.1 mL 福林酚試劑于試管中室溫反應5 min，加入0.3 mL 20%的碳酸鈉溶液和1.0 mL 雙蒸水，避光反應25 min 后，采用酶標儀測定反應體系在765 nm 處的吸光值?？瞻捉M以雙蒸水代替碳酸鈉溶液，以沒食子酸為標準品繪制標準曲線，結果以沒食子酸當量（μg GAE/mg E）表示。

1.2.3 總黃酮含量的測定 采用三氯化鋁比色法測定樣品中總黃酮的含量[11]。取100 μL 1.0 mg/mL 的樣品與100 μL 10%三氯化鋁于酶標板中混勻，室溫反應15 min 后，采用Synergy H1 酶標儀測反應體系在430 nm 處的吸光值。乙醇代替三氯化鋁溶液的反應體系為空白組，以槲皮素為標準品繪制標準曲線，結果以槲皮素當量（μg QUE/mg E）表示。

1.2.4 總水解單寧含量的測定 采用碘酸鉀法測定樣品中水解單寧的含量[10]。取100 μL 1.0 mg/mL 樣品與150 μL 5%碘酸鉀溶液于酶標板中混勻，室溫反應15 min 后，測其在550 nm 的吸光值。以乙醇代替碘酸鉀溶液的反應體系為空白組，以沒食子酸為標準品作標準曲線，結果以沒食子酸當量表示（mg GAE/g E）。

1.2.5 不同產地覆盆子提取物HPLC-MS/MS 分析將不同產地覆盆子提取物粉末溶解在甲醇中，配制成2 mg/mL 的溶液，經0.22 μm 濾膜過濾后采用AB Exion LC 高效液相色譜-TripleTOF 5600+高分辨質譜聯用儀（AB Sciex）測定提取物中酚類物質。利用PeakView 對樣品進行MS/MS 數據分析，通過將獲得的數據與參考文獻和Scifinder、Metlin 數據庫中記錄的數據進行匹配，對化合物的結構進行初步鑒定，并通過峰面積對化合物進行定量分析。

高效液相色譜參數：色譜柱為SHIM-PACK GIST C18（75 mm×2.1 mm）；流動相A 為0.1%甲酸水溶液，流動相B 為乙腈溶液；梯度洗脫程序條件為0～6 min 4% B，6～32 min 4%～16.5% B，32～45 min 16.5% B；檢測波長為254 nm；柱溫為35 ℃；流速為0.3 mL/min；進樣量為5 μL。

質譜參數：電噴霧離子源為負離子模式，550 ℃ESI 離子源；質量掃描范圍為50～2000 Da，離子源霧化氣為50 psi，離子源加熱輔助氣為35 psi；一級質譜去簇電壓為-80 V，碰撞能為-10 eV；二級質譜去簇電壓為-80 V，CE 為-40±20 eV。

1.2.6 自由基清除能力測定 采用DPPH 和ABTS法比較樣品的自由基清除能力[11]。取50 μL 適宜濃度的樣品與150 μL 新鮮配制的DPPH·溶液（0.15 mmol/L）或ABTS+·溶液于酶標板中混勻并進行稀釋，室溫避光孵育30 min（DPPH·溶液）或6 min（ABTS+·溶液）后，分別于517 nm 和734 nm 處測定吸光值。乙醇代替自由基溶液的反應體系為樣品空白組，以VC作陽性對照。采用Origin 2018 計算樣品清除DPPH 和ABTS+自由基半抑制濃度，結果用IC50值（μg/mL）表示。

1.2.7α-葡萄糖苷酶抑制能力測定 參考Tan 等[5]方法測定樣品的α-葡萄糖苷酶抑制能力。取50 μL 適宜濃度樣品與100 μL 0.1 U/mLα-葡萄糖苷酶于酶標板中倍稀，室溫反應6 min 后加入50 μL 5.0 mmol/L pNPG 反應10 min，最后加入100 μL 0.2 mol/L 碳酸鈉終止反應，并于405 nm 處測定吸光值（Ai），以不加酶和樣品的反應體系為空白組（Aj），不加樣品的反應體系為控制組（Ac），阿卡波糖為陽性對照。按照公式（1）計算樣品中α-葡萄糖苷酶抑制能力，結果用IC50值（mg/mL）表示。

1.2.8 晚期糖基化終末產物（AGEs）抑制能力測定采用牛血清白蛋白（BSA）-葡萄糖反應體系評價樣品抑制AGEs 形成能力[12]。將200 μL 提取物（1 mg/mL）與1.0 mL BSA（20 mg/mL）、1.0 mL 葡萄糖溶液（500 mmol/L）于10 mL 棕色帶蓋玻璃瓶中混勻，恒溫培養箱中37 ℃孵育4 周后取出，冰水浴終止反應。最后用0.1 mol/L pH7.4 的磷酸鹽緩沖溶液稀釋10 倍后，采用F-7000 熒光分光光度計測定稀釋液在激發波長340 nm，發射波長420 nm 處的熒光值。以氨基胍為陽性對照，按照公式（2）計算樣品對AGEs 的抑制率。

式中：FIs表示含有樣品、蛋白和糖的反應體系的熒光強度；FIc表示不含樣品的反應體系的熒光強度；FIb表示不含樣品和蛋白的反應體系的熒光強度；FInb表示不含蛋白的反應體系的熒光強度。

1.3 數據處理

所有實驗重復三次，結果用平均值±標準偏差表示，采用SPSS 13.0 中的單因素方差分析和t-檢驗進行統計分析，P＜0.05 認為具有顯著性差異，所有圖形用Origin 8.0 繪制。

2 結果與分析

2.1 總酚、總黃酮和總水解單寧含量分析

六個產地藥用覆盆子提取物的總酚、水解單寧、總黃酮含量如表1 所示。廣東和安徽產的覆盆子提取物中的總酚含量最高，為349.77 和345.16 μg GAE/mg E，廣西和四川覆盆子提取物的總酚含量最低，為294.47 和285.16 μg GAE/mg E，且兩者之間不存在顯著性差異（P＞0.05）。浙江覆盆子提取物中的總黃酮含量最高，達202.55 μg QUE/mg E，其次為廣西、江西和廣東覆盆子提取物，含量為156.92～153.51 μg QUE/mg E，且三者之間不存在顯著性差異（P＞0.05），四川覆盆子提取物的總黃酮含量最低，僅112.77 μg QUE/mg E。四川覆盆子提取物中的可水解單寧含量最高，為125.07 mg GAE/g E，其次為廣西和浙江覆盆子提取物，廣東和安徽覆盆子提取物中的水解單寧含量最低，為62.07 mg GAE/g E 和64.87 mg GAE/g E，且兩者之間不存在顯著性差異（P＞0.05）。

表1 六個產地覆盆子提取物的總酚、水解單寧、總黃酮含量Table 1 Total phenols,hydrolyzed tannins and total flavonoids content of raspberry extracts from six producing areas

2.2 主要化學成分分析

為了比較六個產地覆盆子之間的差異，本文檢測了六個產地覆盆子提取物中酚類物質，色譜圖如圖1 所示。從覆盆子提取物鑒定出34 個酚類化合物，主要是鞣花單寧、黃酮和酚酸類物質（表2）。

圖1 六個產地覆盆子提取物的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram of raspberry extracts from six producing areas

表2 六個產地覆盆子提取物的定性定量分析Table 2 Qualitative and quantitative analysis of raspberry extracts from six producing areas

鞣花單寧是懸鉤子屬植物中的一類主要活性成分。通過對比母離子、離子碎片可以推斷化合物的初步結構。鞣花單寧在負離子模式下的特征碎片離子包括：沒食子酰基（m/z 151），hexahydroxydiphenoyl（HHDP）基團（m/z 301），HHDP-葡萄糖部分（m/z 463、301 和161）和沒食子酰葡萄糖基（m/z 331）。六個產地都含有豐富的鞣花單寧，共鑒定出12 種鞣花單寧，主要包括鞣花酸、木麻黃鞣寧、花梗鞣素、galloyl-HHDP-glucose、鞣花酸己糖醛酸等，其中四川產地含量占比最高，占其總酚類化合物的56%。盧遇[13]通過HPLC-QTOF-MS/MS 技術從覆盆子中鑒定了26 個酚類物質成分，其中鞣花單寧是覆盆子中主要活性成分，這與本文結果相一致。

黃酮類化合物也是覆盆子中的主要酚類物質，共鑒定出19 種黃酮類化合物，主要以黃酮苷形式存在。包括原花青素二聚體、表兒茶素、報春黃甙、柚皮素己糖苷、蘆丁、槲皮素-3-O-半乳糖苷、異葒草素阿拉伯糖苷、山奈酚-3-O-洋槐糖苷、山奈酚-3-O-蕓香糖苷、芹菜素鼠李糖苷等。除了四川產地，其他五個產地的黃酮類化合物含量的都相對較高，占其總酚類化合物的38%以上。其中浙江產地的含量最高，達55%左右。覆盆子中酚酸含量較少，共鑒定出3 種酚酸，分別為白屈菜酸、沒食子酸和短葉蘇木酚酸。

2.3 自由基清除能力

活性氧自由基（ROS）是人體的正常代謝物，但是過多的ROS 在體內積累會造成器官的氧化損傷，從而誘發各種慢性疾病，如炎癥、癌癥、糖尿病、高血壓等[14]。膳食中的多酚、黃酮類物質都是良好的天然自由基清除劑[15]。常用的體外自由基清除能力評價方法包括測定O2-·、·OH、DPPH·、ABTS+·等，本研究采用最常用的DPPH 和ABTS 法探究了不同產地覆盆子提取物的DPPH·和ABTS+·清除能力[16-17]。六個產地藥用覆盆子提取物對DPPH·和ABTS+·清除能力如圖2 所示，IC50值越小，表示達到半數清除率時所需濃度越小，自由基清除能力越強，該產地覆盆子自由基清除能力越強。和陽性對照VC相比，不同產地覆盆子DPPH·和ABTS+·清除能力差異較大，四川覆盆子的DPPH·和ABTS+·清除能力最強，IC50值分別為63.069 和29.977 μg/mL，廣東、廣西、安徽和浙江覆盆子提取物的DPPH·清除能力相差較小，江西覆盆子提取物的DPPH·和ABTS+·清除能力最弱，IC50值分別為109.750 和52.230 μg/mL。張露等[10]研究發現江西德興所產覆盆子醇溶多酚提取物的DPPH·的IC50值約為80 μg/mL，與本實驗結果類似。吳峰華等[18]報道表明浙江覆盆子醇溶提取物的DPPH·的IC50值約為0.177±0.0078 mg/mL，與本實驗不盡相同，也許是由于采摘的時間不同。

Mansouri 等[19]證明懸鉤子果實的自由基清除能力可能與其酚類、黃酮類、單寧和花青素含量有關，Muniyandi 等[20]證明覆盆子的自由基清除能力與其所含酚類、黃酮類、單寧類化合物含量相關，曾小艷等[21]、謝欣梅等[22-23]證明原花青素、覆盆子酮、覆盆子提取物可以有效降低大鼠血糖，因此產地的不同影響了覆盆子中酚類、黃酮類、單寧類等化合物的含量，進而導致覆盆子間自由基清除能力的差異。覆盆子活性功能由其含有的活性成分決定，已有研究發現藥用覆盆子中的主要活性物質為水解單寧[13]，四川產地覆盆子提取物中水解單寧含量最高，這可能是四川產地覆盆子提取物具有最高自由基清除能力的原因。

2.4 α-葡萄糖苷酶抑制能力

II 型糖尿病的產生被認為與促胰島素分泌和影響胰島素敏感性的關鍵酶有關，如α-葡萄糖苷酶、蛋白酪氨酸磷酸酶、AGEs 等[24-25]。α-葡萄糖苷酶可以水解多糖中的α-（1→4）-糖苷鍵，釋放葡萄糖，而α-葡萄糖苷酶抑制劑則能抑制其活性，從而使機體葡萄糖釋放速率下降，有效地降低血糖濃度[13]。不同產地藥用覆盆子提取物的α-葡萄糖苷酶抑制能力如圖3A所示。和陽性對照阿卡波糖（IC50=1.547 mg/mL）相比，六個產地覆盆子對α-葡萄糖苷酶均具有較強的抑制作用。四川和安徽覆盆子對α-葡萄糖苷酶具有最強抑制效果，IC50值分別為0.086 和0.109 mg/mL。廣東、廣西和浙江覆盆子的α-葡萄糖苷酶抑制能力次之，IC50達0.125～0.142 mg/mL。江西覆盆子的α-葡萄糖苷酶抑制能力最弱，IC50值為0.182 mg/mL。Chen 等[26]發現河北產地的覆盆子提取物具有很好的α-葡萄糖苷酶的抑制能力，是降糖藥阿卡波糖的9 倍，與本文報道的江西覆盆子類似（8.5 倍）。該結果為覆盆子作為α-葡萄糖苷酶抑制劑資源和降血糖功能食品的開發提供了科學依據，但其具體降血糖成分和作用機制需要進一步研究。

圖3 六個產地覆盆子提取物的α-葡萄糖苷酶（A）和AGEs（B）抑制能力Fig.3 Inhibition capacities on α-glucosidase (A) and AGEs (B)of raspberry extracts from six producing areas

2.5 AGEs 抑制能力

AGEs 是由還原糖及其衍生物（如甘油醛，乙醇醛，甲基乙二醛和乙醛）與蛋白質或脂質發生非酶糖基化生成的終末期產物，機體內AGEs 的積累會與蛋白質發生交聯，引發糖尿病的一系列并發癥，延緩衰老和緩解糖尿病并發癥的有效方法之一便是抑制AGEs 的累積[27]。本研究以不同產地覆盆子對AGEs的抑制活性作為其抑制糖尿病并發癥的重要指標。以抑制AGEs 生成為指標，對不同產地的覆盆子提取物進行抑制糖基化活性檢測，結果如圖3B 所示，不同產地藥用覆盆子提取物對AGEs 的形成具有很強的抑制效果，當提取物為1 mg/mL 時，其對AGEs 形成的抑制率達到了73.92%～81.91%。安徽覆盆子的AGEs 抑制率最高，達到81.91%，與陽性對照氨基胍無顯著差異（P＞0.05）。廣東和廣西覆盆子的AGEs 抑制率次之（78.54%～78.85%），江西、四川和浙江覆盆子的AGEs 抑制率最低（74.94%～73.92%）。

3 結論

不同產地覆盆子間總酚、總黃酮和總水解單寧含量存在差異，其中廣東和安徽覆盆子提取物總酚含量最高，廣西和四川產地的最低；浙江覆盆子提取物總黃酮含量最高，廣西、江西和廣東產地次之，四川產地的最低；四川覆盆子提取物總水解單寧含量最高，廣西和浙江產地次之，廣東和安徽產地的最低。從六個產地的覆盆子提取物中鑒定出34 種酚類物質，主要是鞣花單寧、黃酮和酚酸類物質，四川覆盆子提取物含有最豐富的鞣花單寧。不同產地覆盆子提取物都具有一定自由基清除能力、α-葡萄糖苷酶抑制活性以及AGEs 抑制能力，其中四川覆盆子的DPPH·和ABTS+·清除能力和α-葡萄糖苷酶抑制活性遠高于其他產地，而安徽覆盆子提取物的AGEs抑制能力略高于其他產地。本文僅對部分產地覆盆子酚類物質及其抗糖尿病活性進行了初步研究，對于不同產地體內抗糖尿病活性及機制還有待進一步研究。

? The Author(s) 2024.This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License (https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).