檳榔堿對人胃黏膜上皮細胞的毒性作用研究

李家旭，成鈺瑩，楊 揚，王璧瑩，蔣玉珍，陳建萍，黎 攀，杜 冰,*

（1.華南農業大學食品學院，廣東廣州 510642；2.香港大學中醫藥學院，中國香港 999077）

檳榔及其制品中含有多種成分，包括碳水化合物、脂肪、蛋白質、粗纖維、生物堿、皂苷、酚類、氨基酸和微量元素等。其中，生物堿是檳榔及其制品中的主要活性物質，包括檳榔堿、檳榔次堿、去甲基檳榔堿、去甲基檳榔次堿、檳榔副堿和高檳榔堿等[1-2]。其中檳榔堿含量在2.98～745.0 μg/mL[3]。

檳榔堿（Methyl-1,2,5,6-tetrahydro-1-methyl-nicotinate）是從檳榔中分離出來的一種生物堿，被認為是檳榔中含量最多的有效成分。檳榔堿的毒性作用可歸因于其對各種生物過程的廣泛影響因素[4]，例如抑制參與生物代謝、解毒、染色體結構穩定性和DNA 修復系統的基因表達。研究表明，檳榔堿抑制多種細胞DNA 和雙鏈核酸的合成，進而影響細胞生長、遷移、增殖以及組織附著再生[5]。另外，氧化應激在細胞生長、細胞凋亡[6]、基因表達[7]和細胞信號傳導[8]中起著關鍵作用，而檳榔堿會阻礙人體內抗氧化劑如SOD、過氧化氫酶和谷胱甘肽-S-轉移酶（GST）和活性氧（ROS）的中和[9]。檳榔堿可調節實驗動物的免疫功能[10]來調節炎癥過程，例如檳榔堿可能通過引發前列腺素E2（PGE-2）和環氧合酶2（COX-2）的產生以及誘導白細胞介素6（IL-6）的表達來引發上皮炎癥[11-12]。檳榔堿的細胞毒作用已在口腔上皮細胞中得到證實[13-14]。

有研究表明，咀嚼檳榔與胃癌以及食管癌之間存在一定的因果關系[15]。咀嚼檳榔時，帶有檳榔活性成分的唾液可能會經過食道、胃部以及腸道等的消化系統器官，所以，咀嚼檳榔還可能會導致這些部位發生黏膜損傷、潰瘍等病變，長期刺激可能引發胃癌。利用檳榔堿或者是檳榔提取物經過多種方式如灌胃[16]、混合到飼料中[17]，發現食道和胃部都具有類似癌癥的癥狀，導致胃黏膜上皮細胞的p53、Bax及p65 的水平升高[15]。然而，檳榔堿體內外損傷模型的系統建立方法未有報道，檳榔或者是檳榔堿對消化器官，尤其是胃部的損害以及致癌途徑研究依然不完善。因此本研究采用體外培養人胃黏膜上皮細胞GES-1 的方法，探討檳榔堿對GES-1 細胞的毒性，以期建立檳榔堿對GES-1 細胞的損傷模型，為進一步闡明檳榔堿的細胞毒性作用機制提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

GES-1 人胃黏膜上皮細胞 武漢普諾賽生命科技有限公司；RPMI-1640 培養基、特級胎牛血清（Fetal Bovine Serum，FBS）、0.25%含EDTA 胰酶（0.02%EDTA，Trypsin-EDTA）、0.25%無EDTA 胰酶（Trypsin Solution without EDTA）、磷酸緩沖鹽溶液（Phosphate Buffered Saline，PBS）、青霉素-鏈霉素混合液（P/S） 美國Gibco 公司；檳榔堿（分析標準品，HPLC≥98%，CAS：63-75-2） 上海源葉生物科技有限公司；LDH 試劑盒、SOD 試劑盒、GSH 試劑盒、ROS 檢測試劑盒、YO-PRO-1/PI 細胞凋亡與壞死檢測試劑盒 碧云天生物技術公司；ATP 酶試劑盒、Na+K+-ATP 酶試劑盒 南京建成生物工程研究所；TNF-α試劑盒、IL-6 試劑盒、VEGF 試劑盒、TGF-β試劑盒 江蘇酶免實業有限公司。

SH 型CO2細胞培養箱 上海善志儀器設備有限公司；DGG-9070B 型鼓風干燥箱 上海森信實驗儀器有限公司；ANKE TDL-5-A 型離心機 上海安亭分析儀器有限責任公司；Labserv K3 型酶標儀、BD FACSCalibur 流式細胞儀 賽默飛世爾科技（中國）有限公司；SW-CJ-I-1FD 蘇潔超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術有限公司；ZEISS Lab.A1 倒置生物學顯微鏡 德國蔡司公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養 GES-1 細胞培養在含10%（體積分數）FBS 的RPMI-1640 培養基中，在5%（體積分數）CO2、37 ℃的培養箱中培養，取對數生長期的細胞進行試驗。

1.2.2 CCK-8 法測定細胞活力 設置只含有新鮮培養液為空白孔，含有細胞且不含樣品作為對照孔，含有不同質量濃度檳榔堿孔為實驗孔（10、20、30、60、90、120、150 μg/mL），每組樣品設置6 個復孔。

取出生長狀態良好細胞，用胰酶消化后制成細胞懸液，以1×104個/mL 的密度將細胞接種在96 孔細胞培養板中，每孔100 μL，培養12 h 使細胞貼壁生長。

棄去細胞培養板的培養基，空白孔與對照孔加入新鮮的完全培養基，實驗孔按分組加入含不同質量濃度檳榔堿（10、20、30、60、90、120、150 μg/mL）的培養基，每孔100 μL，放回培養箱內繼續培養24 h/48 h 后棄去培養基，用PBS 清洗1 次后每孔加入10 μL的CCK8 試劑和90 μL 的完全培養基，將孔板在培養箱內放置4 h，測定450 nm 處吸光值（A 值），計算細胞活力。

式中，V 指細胞活力；A 指樣品組的A 值；A0指空白組的A 值；A1指對照組的A 值。

1.2.3 檳榔堿對GES-1 細胞形態的影響 取生長狀態良好GES-1 細胞，以1×105個/mL 的密度接種于6 孔細胞培養板內，置于細胞培養箱內培養24 h 后，按分組加入含不同質量濃度檳榔堿（60、90、120、150 μg/mL）的培養基，每孔2 mL，放回培養箱內繼續培養24 h。培養完成后在倒置顯微鏡下觀察細胞形態。

1.2.4 GES-1 細胞活性氧檢測 取生長狀態良好GES-1 細胞，以1×105個/mL 的密度接種于6 孔細胞培養板內，置于細胞培養箱內培養24 h 后，按分組加入含不同質量濃度檳榔堿（60、90、120、150 μg/mL）的培養基，每孔2 mL，放回培養箱內繼續培養24 h。培養完成后，參考冷彥等[18]的方法進行細胞活性氧檢測。

1.2.5 GES-1 細胞線粒體膜電位檢測 收集處于對數生長期的細胞，以1×105個/mL 的密度接種于6 孔細胞培養板內，置于細胞培養箱內培養24 h，按分組加入含不同質量濃度檳榔堿（60、90、120、150 μg/mL）的培養基，每孔2 mL，放回培養箱內繼續培養24 h，培養完成后，參考冼健安等[19]的方法進行細胞線粒體膜電位的檢測。

1.2.6 檳榔堿對GES-1 細胞ATP 酶的影響 取生長狀態良好GES-1 細胞，以1×105個/mL 的密度接種于6 孔細胞培養板內，置于細胞培養箱內培養24 h，按分組加入含不同質量濃度檳榔堿（60、90、120、150 μg/mL）的培養基，每孔2 mL，放回培養箱內繼續培養24 h，按照超微量ATP 酶測試盒（Na+K+、T-ATP 酶）的說明書進行測定。

1.2.7 檳榔堿對GES-1 細胞GSH、SOD、LDH 的影響 取生長狀態良好GES-1 細胞，以1×105個/mL的密度接種于6 孔細胞培養板內，置于細胞培養箱內培養24 h 后，按分組加入含不同質量濃度檳榔堿（60、90、120、150 μg/mL）的培養基，每孔2 mL，放回培養箱內繼續培養24 h，按照乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒、超氧化物歧化酶（T-SOD）試劑盒、還原型谷胱甘肽（GSH）試劑盒中的說明書進行測定。

1.2.8 檳榔堿對GES-1 細胞炎癥因子的影響 取生長狀態良好GES-1 細胞，以1×105個/mL 的密度接種于6 孔細胞培養板內，置于細胞培養箱內培養24 h，按分組加入含不同質量濃度檳榔堿（60、90、120、150 μg/mL）的培養基，每孔2 mL，放回培養箱內繼續培養24 h，按照TNF-α、IL-6、TGF-β、VEGF試劑盒說明書檢測。

1.3 數據處理

采用SPSS 24.0 統計軟件進行數據分析，以Graphpad 8.0 進行圖表處理，統計方法采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），并做組間比較，不同組別樣本數n=6，計量數據以平均數±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 檳榔堿對GES-1 細胞的毒性作用

2.1.1 檳榔堿對人胃黏膜上皮細胞活力影響 不同濃度檳榔堿對人胃黏膜上皮細胞活力的影響見圖1。與對照組相比，GES-1 細胞在經過60 μg/mL的檳榔堿刺激24 h 后，細胞活力開始出現極顯著降低（P＜0.01），是對照組的82.6%。

圖1 不同檳榔堿濃度刺激GES-1 細胞活力Fig.1 Cell viability of GES-1 cells stimulated by different arecoline concentrations

而在48 h 的刺激時間下，檳榔堿濃度為30 μg/mL 時細胞活力開始出現極顯著降低（P＜0.01），是對照組的86.2%；隨著檳榔堿濃度的升高，細胞活力過低，已普遍降至30%以下，因此后續實驗中選擇24 h作為刺激時間，并且選擇60～150 μg/mL 檳榔堿濃度作為后續實驗的作用濃度范圍。

2.1.2 檳榔堿刺激對GES-1 細胞形態影響 不同濃度檳榔堿刺激對GES-1 細胞形態影響見圖2?？捎^察到正常生長的GES-1 細胞排列有序，細胞邊界清晰，胞質均勻。而隨著檳榔堿濃度的提升，細胞的數量逐漸減少，排列出現紊亂；部分細胞回縮變圓；部分死亡細胞脫離底部，漂浮在培養液中，同時也可以觀察到部分細胞碎片。說明檳榔堿對細胞具有一定損傷作用，會引起細胞損傷甚至死亡脫落。

圖2 不同濃度檳榔堿刺激24 h 對GES-1 細胞形態影響（100×）Fig.2 Effect of different concentrations of arecoline stimulation for 24 h on the shape of GES-1 cells (100×)

2.2 檳榔堿對GES-1 細胞內ROS 水平影響

不同濃度檳榔堿對GES-1 細胞內ROS 水平影響見圖3。隨著檳榔堿的濃度的提升，GES-1 細胞內的ROS 水平也隨之升高，具有一定的濃度依賴性。與空白組相比，90 μg/mL 檳榔堿處理后，GES-1 細胞的平均熒光強度開始出現極顯著上升（P＜0.01），約為對照組的7.4 倍。120 μg/mL 檳榔堿處理后平均熒光強度達到259.14，150 μg/mL 檳榔堿處理后平均熒光強度達到262.27，與對照組相比均有極顯著升高（P＜0.01）。以上結果表明，檳榔堿刺激GES-1 細胞可能會引起細胞內氧化應激，促使細胞內ROS 的生成，造成細胞的氧化損傷。

圖3 不同檳榔堿濃度刺激對GES-1 細胞內ROS 水平影響Fig.3 Effect of stimulation with different arecoline concentrations on intracellular ROS levels in GES-1 cells

2.3 檳榔堿對GES-1 細胞線粒體膜電位影響

不同濃度檳榔堿對GES-1 細胞線粒體膜電位影響見圖4。隨著檳榔堿濃度的提升，GES-1 細胞的線粒體膜電位呈現下降的趨勢，在120 μg/mL 開始出現極顯著下降（P＜0.01），當檳榔堿濃度為150 μg/mL時，線粒體膜電位下降至對照組的10.4%（P＜0.01）。以上結果提示，在檳榔堿的處理下，GES-1 細胞的線粒體發生去極化導致膜電位失衡，呼吸鏈電子的傳遞過程出現障礙，進一步導致線粒體的功能出現障礙。

圖4 不同檳榔堿濃度刺激對GES-1 細胞線粒體膜電位影響Fig.4 Effect of stimulation with different arecoline concentrations on the mitochondrial membrane potential of GES-1 cells

2.4 檳榔堿對GES-1 細胞ATP 酶影響

不同濃度檳榔堿對GES-1 細胞ATP 酶影響見圖5。隨著檳榔堿濃度的提升，總ATP 酶活力呈現先上升后下降的趨勢，其原因可能是因為檳榔堿存在雙相劑量效應（Hormesis）[20]，即在低濃度檳榔堿刺激下，促使細胞產生ATP 酶；而Na+K+-ATP 酶的活力則呈現出濃度劑量依賴式下降。在90 μg/mL濃度的檳榔堿處理下，細胞的總ATP 酶以及Na+K+-ATP 酶活力均出現了極顯著性下降（P＜0.01），分別下降為1.64、1.38 U/mg prot。在150 μg/mL 濃度的檳榔堿刺激下，總ATP 酶以及Na+K+-ATP 酶活力進一步下降至1.13、1.05 U/mg prot。說明檳榔堿的刺激會降低GES-1 細胞的ATP 酶活力，可能進一步對線粒體造成損傷，導致能量代謝失衡與ATP 的生成下降。

圖5 不同檳榔堿濃度刺激對GES-1 細胞ATP 酶活力影響Fig.5 Effect of stimulation with different arecoline concentrations on ATPase activity in GES-1 cells

2.5 檳榔堿對GES-1 細胞GSH、SOD、LDH 的影響

不同濃度的檳榔堿對GES-1 細胞內GSH、SOD、LDH 的影響見圖6。在120 μg/mL 濃度的檳榔堿刺激下，GES-1 細胞的GSH 含量為79.6 μmol/g prot，與對照組相比出現顯著性降低（P＜0.05）。在90 μg/mL 濃度的檳榔堿刺激下，SOD 的酶活力開始出現極顯著性降低（P＜0.01），降低到了4.74 U/g prot。在120 μg/mL 濃度的檳榔堿刺激下，LDH 出現極顯著性升高（P＜0.01），說明檳榔堿的刺激對GES-1 細胞具有毒性作用，GES-1 細胞內的抗氧化酶系統遭到了破壞，導致細胞出現氧化損傷。

圖6 不同檳榔堿濃度對GES-1 細胞GSH、SOD、LDH 的影響Fig.6 Effect of different arecoline concentrations on GSH,SOD and LDH in GES-1 cells

2.6 檳榔堿對GES-1 細胞炎癥因子的影響

不同濃度的檳榔堿對GES-1 細胞內炎癥因子的影響見圖7。在不同濃度檳榔堿的刺激下，各炎癥因子均出現上升趨勢，在150 μg/mL 檳榔堿的刺激下，與對照組相比TNF-α含量極顯著上升至82.21 pg/mL（P＜0.01），IL-6 含量上升至6.95 pg/mL（P＜0.01），VEGF 含量上升至2145.41 pg/mL（P＜0.01），TGF-β含量上升至43.02 pg/mL（P＜0.01）。說明檳榔堿能夠提高細胞內促炎因子與促纖維化因子水平，破壞胃黏膜正常的保護功能，進一步誘發胃黏膜的炎癥反應，導致細胞損傷。

圖7 不同濃度檳榔堿對GES-1 細胞炎癥因子的影響Fig.7 Effect of different concentrations of arecoline on inflammatory factors in GES-1 cells

3 討論與結論

GES-1 細胞是人胃黏膜中正常的胃黏膜上皮細胞，是研究胃黏膜損傷、胃潰瘍、胃炎、幽門螺旋桿菌感染、胃癌等疾病的重要細胞模型系統[21]。有研究表明，檳榔堿在經過人體消化系統時會對消化系統造成損傷，其中包括胃部黏膜的損傷[15]。Kong 等[22]的體外模擬消化研究表明，攝入121.22 μg/mL 的檳榔堿1 h 后，在胃部消化階段仍能檢測到72.41 μg/mL的檳榔堿殘留，有可能對胃部造成損傷。因此本研究利用檳榔堿刺激GES-1 細胞，探究檳榔堿對人胃黏膜的毒性作用，結果顯示：60 μg/mL 檳榔堿刺激GES-1 細胞24 h 后細胞活力開始出現極顯著降低（P＜0.01）；30 μg/mL 檳榔堿刺激GES-1 細胞48 h 后細胞活力開始出現極顯著降低（P＜0.01）。此外，不同濃度檳榔堿刺激后細胞形態發生改變，檳榔堿濃度越高，細胞形態變化程度越大。檳榔堿刺激降低了細胞內 SOD 與 GSH 的活力，促進 LDH 與 ROS 的含量升高，引發細胞的氧化應激反應；同時積蓄的ROS攻擊線粒體，進一步導致線粒體膜電位失衡與功能障礙，ATP 酶活力降低，細胞供能受損，促炎因子與促纖維化因子水平升高，最終對GES-1 細胞產生毒性作用。

細胞在氧化脅迫中會誘導線粒體功能出現障礙，產生大量的自由基，破壞細胞內的平衡狀態，最終導致細胞損傷甚至死亡。其中ROS 是機體正常代謝的產物，能參與到多種信號通路中，激活細胞信號聯級反應，抑制細胞增殖、誘導細胞發生凋亡、壞死等[8]。有研究表明檳榔堿可以提升細胞內ROS 的水平，引發氧化應激，打破細胞內的平衡環境，誘導線粒體功能障礙，最終導致病變甚至癌變[23-24]。Hung等[25]證明了檳榔提取物誘導內皮細胞的ROS 水平上升，并且進一步通過MAPK（JNK 和p38）通路上調HO-1 的表達，引發氧化應激。同樣Ji 等[26]研究表明檳榔堿能誘導口腔鱗狀細胞中ROS 上升，引起DNA 損傷，導致DNA 復制錯誤。本研究中，在90 μg/mL 檳榔堿處理下ROS 呈現出極顯著性升高（P＜0.01），表明檳榔堿刺激導致GES-1 細胞產生大量活性氧，對細胞造成損害。

細胞內自由基的清除需要依靠抗氧化酶，其中GSH 在機體內可以維護正常的免疫系統功能，可以幫助機體清除自由基，保護機體內多種酶不被氧化并且正常地發揮其生理功能，具有抗氧化、解毒的功效，可以作為細胞內衡量抗氧化能力的關鍵指標[27]；SOD 是一種抗氧化金屬酶，能夠清除細胞內超氧陰離子，參與細胞內的抗氧化進程并起關鍵作用，SOD活力可以反映組織內細胞的氧化受損情況[28]；LDH穩定存在于細胞內部，當細胞受損傷后能迅速釋放到細胞外，因此，細胞外液中的LDH 活性是衡量細胞發生應激損傷的指標物[28]。有研究表明，小鼠膠質細胞中GSH 的耗竭引起的過氧化導致細胞壞死[29]；Run等[30]發現檳榔堿能夠抑制細胞內SOD 的酶活性，進一步破壞氧化應激抗氧化酶系統。在本研究中，隨著檳榔堿濃度的升高，GSH、SOD 活力出現下降，LDH含量升高，說明檳榔堿的刺激對GES-1 細胞的抗氧化系統造成了破壞，導致細胞內產生的自由基積蓄，最終導致細胞損傷。

線粒體膜電位是由線粒體內膜兩側質子以及其他離子的濃度不對稱分布而形成的，對穩定細胞的正常生理功能有重要作用[19]。ATP 作為機體內重要的能量產物，能夠維系生物功能的正常運轉，ATP 酶廣泛分布在細胞的生物膜系統內，對保護細胞的正常生理功能具有重要意義。線粒體受到氧化劑的攻擊后，線粒體膜電位的失衡會導致能量異常代謝，進而導致細胞周期的失調、細胞壞死[31]以及細胞凋亡[32]等。已有研究表明過氧化氫處理人臍靜脈內皮細胞（HUVECs）會導致線粒體膜電位顯著下降，誘導HUVECs 發生程序性壞死[33]；香煙煙霧提取物會導致人肺上皮細胞（BEAS-2B）ATP 酶水平明顯下降，進一步誘導BEAS-2B 發生程序性壞死[34]；H2S 通過下調ATP 酶的活性引起能量代謝紊亂，誘導雞的脾臟細胞發生程序性壞死[35]。在本研究中，60～150 μg/mL 的檳榔堿處理組線粒體膜電位以及ATP 酶活力出現下降，能夠說明氧化應激進一步導致線粒體功能破壞，正常的膜電位失衡引起能量代謝紊亂，最終導致細胞出現損傷。

TNF-α作為多肽類細胞因子具有多種生物功能，參與細胞的增殖與分化、侵襲與轉移、細胞凋亡、機體免疫應答反應和炎癥反應[36]。IL-6 是典型的細胞炎癥因子，在炎癥與腫瘤的形成中有著重要作用[37]。TGF-β是一種具有多種生物學活性的細胞因子，與細胞的生長與轉化密切相關，可以通過調節免疫來促進細胞的侵襲和轉移[38-39]。有研究表明，檳榔堿能夠促進炎癥因子的表達與釋放[40-41]，Jeng 等[42]發現檳榔提取物能夠促進TNF-α和IL-6 的產生，引發口腔癌。Li 等[43]認為在成纖維細胞和角質形成細胞中，檳榔提取物或檳榔堿誘導腫瘤促進介質或致癌信號通路，包括IL-6、TGF-β[44]。此外，檳榔提取物能夠引發口腔癌細胞中VEGF 的表達，具有促進癌癥轉移的潛在作用[43]。檳榔堿可能通過多種分子調節因子促進細胞炎癥，最終引發細胞死亡。這與本研究結果一致，隨檳榔堿濃度的升高，促炎因子與促纖維化因子均出現上升趨勢，導致細胞出現炎癥反應，并促進損傷部位炎癥的轉移，最終導致GES-1 細胞的毒性損傷。

細胞的死亡方式多種多樣，大致可以分為程序性與非程序性死亡，程序性死亡的方式主要為程序性壞死、細胞凋亡、焦亡、鐵死亡和自噬等。其中程序性壞死具有一些特征：細胞膜在外界的刺激下被破壞，產生氧化應激導致線粒體的膜電位喪失，發生線粒體功能障礙與能量失衡[45]。很多研究表明ROS的產生是引發程序性壞死的關鍵因子[46]，此外線粒體膜電位在程序性壞死中起到關鍵作用，線粒體膜電位失衡導致能量供應失調，最終導致細胞產生程序性壞死[33-35]。目前對于檳榔堿導致細胞毒性的機制研究仍不明確，根據本研究結果顯示，線粒體膜電位以及ATP 酶活力隨檳榔堿的濃度提升而降低，引發線粒體功能障礙，推測檳榔堿可能引發GES-1 細胞程序性壞死發揮毒性作用。

綜上所述，檳榔堿引發氧化應激失衡，導致細胞內的ROS 積蓄，進而導致線粒體功能障礙，細胞供能受損，最終引發GES-1 細胞死亡。對GES-1 細胞毒性作用的潛在機制可能是氧化應激導致的線粒體功能障礙，誘發炎癥因子的產生，最終導致GES-1 程序性壞死，但有待進一步研究確定。本研究發現檳榔堿對人胃黏膜上皮細胞具有損傷作用，并為檳榔堿對GES-1 細胞的損傷模型的建立提供了實驗劑量的參考依據，研究結果提示食用檳榔可能會導致胃部損傷，因此建議人們應減少檳榔的食用以保護自身消化系統的健康。

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