培養皿中的人腦“阿凡達”：腦類器官

腦類器官的技術建立得益于發育生物學理論的積累和干細胞技術的發展。早在20世紀初，研究人員就開始進行細胞解離與重聚的實驗。他們發現，在適當的培養環境中，解離的海綿細胞可以重新聚集并分化為新的個體。隨后，類似的實驗從無脊椎動物擴展到了脊椎動物胚胎。這些實驗為我們理解細胞行為，細胞間如何組織、分化等方面提供了重要的素材，也為模擬體外器官的發育研究提供了一些基礎。

在對胚胎發育的長期興趣和探索的驅動下，干細胞技術在1950年代開始迅速發展。其中包括一些諾獎級的技術，比如基于核移植的體細胞重編程、胚胎干細胞的體外培養以及誘導多能干細胞的構建等。這些技術為研究人員提供了獲得干細胞的新途徑，使其可以通過干細胞的分化和重組來構建復雜的器官模型，如腦類器官。

與神經誘導的“默認模型”一致，20多年前的研究發現，在無外源抑制因子的條件下，人類胚胎干細胞可以自發地分化為神經細胞[1]。即使在二維培養條件下，神經干細胞也會表現出組織的傾向，形成類似神經管組織的玫瑰花環狀結構[1]。這些早期的干細胞神經分化研究極大地推動了人體外腦建模和使用細胞治療方法治療腦疾病等領域的探索。相關的神經分化技術也從最初的隨機分化發展到現在的針對特定譜系的定向分化，例如多巴胺神經元和抑制性中間神經元等。

從人腦體外建模的角度來看，二維分化與真實的大腦之間存在明顯的差異。這些差異主要表現在：①二維分化體系難以重現多樣化的細胞譜系類型，且無法進行長期培養。相比之下，在真實的大腦中，存在各種細胞類型的復雜組合，而且這些細胞需要在長時間的發育過程中逐漸形成。②二維分化雖然可以模擬一些簡單的細胞自組織現象，比如神經干細胞在培養中形成玫瑰花環狀結構，但無法重現復雜的腦組織的三維結構。因為真實的大腦是一個高度有序的器官，其細胞和組織的排列方式非常復雜。而二維分化往往只是在平面上生長。③上述的細胞構成和組織結構的差異，直接導致二維培養無法呈現復雜的腦組織功能。因此，新的人腦體外模型的發展十分必要。這樣的模型應該能夠更真實地模擬人腦，包括多樣化的細胞譜系、復雜的三維結構以及豐富的腦組織功能。

目前，已經建立的腦類器官技術主要分為兩大類：基于非定向分化策略構建的腦類器官和基于定向誘導策略構建的腦區特異類器官。此外，還可以建立更為復雜的多腦區或多譜系的類器官組裝體。腦類器官技術通過不同的構建策略和整合方法，為研究人類腦的發育、結構和功能提供了強有力的工具，也為神經科學研究和相關領域的發展帶來了新的機遇。

非定向分化的腦類器官

在神經分化研究的發展歷程中，無血清擬胚體分化方案的建立對三維類器官的構建非常重要。在2008年的一項研究中，科學家們發現，在三維擬胚體分化方案的基礎上，將人類胚胎干細胞進行神經外胚層誘導，并使用胞外基質材料（如matrigel）處理，就能夠通過細胞自組織的方式形成類似胚胎大腦的結構[2]。這些結構包括由神經干細胞構成的腦室樣區域，以及由不同類型的分化神經元構成的皮質板樣區域。盡管這項工作并沒有被稱為“類器官”，但它為后來的腦類器官研究奠定了重要基礎。2011年，科學家們首次成功建立了完全三維培養的視杯類器官模型，隨后其他神經類器官技術也得到了快速發展。 這些研究的進展對于理解和模擬人類大腦非常重要。科學家們希望通過改進技術和方法，將人腦的復雜性和功能更加真實地模擬出來。

2013年，科學家們首次報道了非定向分化腦類器官（cerebral organoids）[3]，該模型可能是大家最熟悉的腦類器官類型。構建非定向分化腦類器官的方法主要基于早期胚胎發育中神經外胚層分化的“默認模型”。簡單來說，就是在無血清的三維培養條件下，多能干細胞自發分化為神經外胚層，并最終形成具有三維自組織結構的腦類器官。這種非定向分化腦類器官的建立方法為我們提供了一種模擬人類腦的新途徑。

腦區特異類器官

非定向分化腦類器官是一種能夠主要重現人腦皮層發育特征的模型。由于構建過程中沒有特定的分化引導步驟，因此在這種類型的腦類器官中可能會隨機出現與其他腦區相關的細胞譜系或組織結構。因此，非定向分化腦類器官更適合用于較寬泛地體外模擬人腦的研究。然而，人腦是非常復雜的器官，不同的腦區神經元組分有所不同，并且具有不同的功能。為了滿足對特定腦結構進行模擬和研究的需求，科學家們采用了另一種叫作定向分化的技術，用來構建針對特定腦區的類器官。例如，第一個成功建立的腦區特異類器官是皮質類器官，它在非定向分化腦類器官建立的同一年份（即2013年）被報道[4]。此后，許多國際研究團隊開始開展不同腦區的類器官構建。這些工作加速了腦區特異類器官技術的發展。

在胚胎發育過程中，神經管會發育成為初級腦泡，每個腦泡對應不同的腦區域和結構，包含前腦、中腦和后腦。現在，科學家們已經成功建立了針對這些不同腦區的類器官模型，這為我們更精確地模擬特定的人腦區域提供了新的方法。其中，最早成功建立的皮質類器官依然是大家最關注的模型之一。除了皮質類器官，科學家們在過去幾年里相繼建立了其他腦區特異類器官模型，包括腹側端腦類器官、脈絡叢類器官、紋狀體類器官、丘腦類器官、下丘腦類器官、中腦類器官、小腦類器官等。這些類器官基本上涵蓋了從前腦到后腦神經管的主要腦區域，其構建基本上使用了無血清擬胚體懸浮培養的方法。其中關鍵的不同之處在于，如何在神經誘導或模式發生階段重現特定腦區的發育調控。

神經管的前-后軸和背-腹軸發育受到一系列形態發生因子的調控，最終決定了不同腦區的分化命運。因此，在體外構建特定腦區的模型時，研究人員的關鍵目標就是模擬神經管特定區域形態發生因子的作用。例如，在皮質分化過程中，需要考慮抑制神經管尾部富集的WNT信號。而在構建偏尾部神經管分化時（如丘腦），則需要去除WNT抑制，并輔以可誘導尾部化的信號（如胰島素）。又如，負責分泌腦脊液的脈絡叢組織發育自端腦最背側區域，而端腦背側會富集WNT和BMP信號。因此，在構建脈絡叢類器官時，會采取同時激活WNT和BMP信號通路的策略來促進背側模式發生。通過探索這些關鍵調控因子，科學家們能夠更好地模擬特定腦區的發育過程，從而為我們提供了更準確的類器官模型。

復雜腦類器官

非定向分化和定向分化構建腦類器官這兩類技術在2013年之后都得到了快速發展。而在此基礎上，更加復雜的腦類器官技術也不斷涌現出來。例如，2017年成功構建了多腦區腦類器官組裝體，為研究不同腦區之間的相互作用提供了新的模型，其相關技術在近幾年也得到了進一步的發展。目前，復雜腦類器官模型主要可分為兩類：多腦區類器官和多譜系類器官。多腦區類器官是指分別構建多種腦區特異的類器官，通過將它們融合培養以模擬跨區域的相互連接。這種模型使得研究人員能夠便利地探索不同腦區之間的聯系。 多譜系類器官是指在同一個腦類器官中引入多個不同的細胞譜系。這種模型可以更好地研究不同細胞譜系之間的相互調控。通過構建這些復雜的腦類器官模型，科學家們希望能夠更全面地了解人腦的發育和功能。需要指出的是，目前對于腦的復雜性了解仍然有限，因此構建出可完全復制人腦的模型仍然是一個巨大的挑戰。

多腦區類器官

非定向分化腦類器官可能包含多種腦區的特征，但是這些特征的出現是隨機且不可控的。腦區特異類器官能夠更精確地模擬特定的腦結構，但是同時也忽略了其在發育和功能執行過程中與其他腦區的互動。因此，在使用腦類器官時，需要根據具體需求選擇合適的模型。此外，開發新的腦類器官模型來模擬人腦中復雜的區域互動也是一個重要的技術難題。關于這一點，研究人員最初重點關注了腦發育過程中的一個關鍵事件，即細胞遷移。通過在腦類器官中模擬細胞遷移，科學家們希望能夠更好地理解人腦的發育過程。

在大腦皮層的發育過程中，細胞遷移以多種形式發生。例如，皮層新生神經元通過放射狀膠質細胞纖維遷移到皮質板上，中間神經元從腹側遷移到大腦皮層，新生神經元從腦室下區遷移到嗅球等。其中，一些遷移現象，例如皮層新生神經元沿放射狀膠質細胞纖維遷移，可以通過構建獨立的非定向分化腦類器官或皮質類器官來再現，但更復雜的跨區域細胞遷移難以模擬。為了解決這個問題，研究人員在2017年建立了腦類器官組裝體模型。例如，針對中間神經元切向遷移到皮層的過程，他們將分別構建的皮質類器官和腹側腦類器官進行組裝，即將它們融合在一起，以模擬兩個腦區之間的功能連接[5-7]。當腹側腦類器官和皮質類器官融合培養后，可以觀察到腹側來源的中間神經元定向遷移到皮層并建立神經突觸連接。這為研究人類中間神經元遷移的調控或相關疾病模擬提供了方便的三維模型。這個模型的建立也為三維模擬更多復雜的腦發育過程和腦功能提供了新思路。

隨后，科學家們成功建立了多腦區類器官組裝體，用于體外模擬跨腦區的軸突投射。相關的技術也從早期模擬神經系統內部的連接逐步發展到模擬神經系統與外周器官組織的連接調控。例如，我們知道皮層的發育和功能與丘腦密切相關，它們之間存在雙向的軸突投射。為了在體外重現這個特征，可以分別構建皮層和丘腦的腦區特異類器官，然后將它們融合在一起進行培養。這樣就可以在三維模型中模擬人丘腦與皮層組織之間的雙向軸突投射連接和相應的功能[8]。這種策略也可以用于模擬其他連接模式，比如皮層到紋狀體的軸突投射。進一步地，人類中樞神經系統對外周器官組織的調控也可以通過類器官組裝體來模擬。例如，早些時候的研究證實，非定向分化的腦類器官與鼠脊髓組織的共同培養可以實現腦神經元向脊髓組織建立軸突投射連接，并且可以調節與脊髓組織連接的椎旁肌肉。隨后，研究人員建立了人皮層類器官、脊髓類器官和肌肉球體的三重組裝體，從而實現了人類皮層神經元對運動的控制模擬。

多譜系腦類器官

除了不同腦區之間的互作，大腦中還存在著多種細胞譜系之間的復雜互作。其中最經典的案例包括神經組織與血管組織之間的互作，以及免疫系統對神經系統的調控。然而，在以往的腦類器官模型中，不同譜系之間的互作很難被模擬，這是因為它們起源于不同的胚層。為了解決這個問題，近年來研究人員逐漸開發出不同的技術方案。比如，如何重構血管是其中一個關鍵挑戰，這也是許多其他類型器官模型面臨的問題之一。目前已經建立了幾種技術方案來解決這個問題：首先，可以通過將由干細胞分化而來的血管內皮細胞或人臍靜脈內皮細胞與腦類器官一起培養，實現它們的共生[9]。類似的方案也可以用于引入其他與腦血管相關的細胞，如周細胞。其次，通過利用轉錄因子（如ETV2）來調控細胞的命運，可以實現腦類器官中血管內皮細胞的定向分化[10]。再次，可以分別構建血管類器官和腦類器官，然后將它們融合在一起培養，從而實現血管化組裝[11]。上述這些方案可以在體外模擬神經組織與血管組織之間的互作，為多細胞譜系的發育和功能提供了基礎。當然，目前建立的腦類器官血管化與體內的功能性血管網絡仍存在較大差距，因此還需要進一步改進。

為了實現血管化和多細胞譜系之間的互作，另一種策略是將腦類器官移植到小鼠的大腦內。該方案可以實現小鼠的血管網絡向人類腦類器官組織生長，而且這些血管可以實現正常的血液循環功能。此外，體內移植還可以有效地將小鼠的膠質細胞整合到腦類器官中，從而將缺失的免疫組分引入腦類器官的發育過程中。當然，在研究免疫系統與腦類器官互作方面，研究人員也在探索從體外培養的角度進行研究。其中，一種方法是利用大腦中廣泛分布的先天免疫細胞，也就是小膠質細胞，建立小膠質細胞或原始巨噬細胞與腦類器官共同培養的模型，從而在體外重現人類小膠質細胞與神經組織的互作情況。通過以上的體內和體外實驗，研究人員可以更好地理解腦組織中多細胞譜系互作的機制。

結 語

發育生物學和神經生物學等基礎理論的不斷積累，加上干細胞技術的建立和迅速發展，為腦類器官技術的誕生和發展奠定了基礎。腦類器官就好像是人腦在體外的“阿凡達”世界，是我們窺探人腦奧秘的窗口。在過去的10年里，腦類器官已經被廣泛用于探索發育調控、疾病機制、藥物發現、人類進化等前沿科學問題。當然，作為一種新興且處于快速發展階段的模型技術，腦類器官仍面臨一些技術挑戰需要克服。但隨著技術的不斷完善，相信腦類器官將為我們提供不可或缺的視角和創新平臺，進而更好地認識人類大腦，理解人類自身，乃至攻克腦疾病等重要問題。

[1]Zhang S C， Wernig M， Duncan I D， et al. In vitro differentiation of transplantable neural precursors from human embryonic stem cells. Nat Biotechnol， 2001， 19（12）： 1129-1133.

[2]Eiraku M， Watanabe K， Matsuo-Takasaki M， et al. Self-organized formation of polarized cortical tissues from ESCs and its active manipulation by extrinsic signals. Cell Stem Cell， 2008， 3（5）： 519-532.

[3]Lancaster M A， Renner M， Martin C A， et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature， 2013， 501（7467）： 373-379.

[4]Kadoshima T， Sakaguchi H， Nakano T， et al. Self-organization of axial polarity， inside-out layer pattern， and species-specific progenitor dynamics in human ES cell-derived neocortex. Proc Natl Acad Sci U S A， 2013， 110（50）： 20284-20289.

[5]Xiang Y， Tanaka Y， Patterson B， et al. Fusion of regionally specified hPSC-derived organoids models human brain development and interneuron migration. Cell Stem Cell， 2017， 21（3）： 383-398.

[6]Birey F， Andersen J， Makinson C D， et al. Assembly of functionally integrated human forebrain spheroids. Nature， 2017， 545（7652）： 54-59.

[7]Bagley J A， Reumann D， Bian S， et al. Fused cerebral organoids model interactions between brain regions. Nature Methods， 2017， 14（7）： 743.

[8]Xiang Y F， Tanaka Y， Cakir B， et al. hESC-derived thalamic organoids form reciprocal projections when fused with cortical organoids. Cell Stem Cell， 2019， 24（3）： 487.

[9]Shi Y， Sun L， Wang M， et al. Vascularized human cortical organoids（vOrganoids） model cortical development in vivo. PLoS Biol， 2020， 18（5）： e3000705.

[10]Cakir B， Xiang Y， Tanaka Y， et al. Engineering of human brain organoids with a functional vascular-like system. Nat Methods， 2019， 16（11）： 1169-1175.

[11]Sun X Y， Ju X C， Li Y， et al. Generation of vascularized brain organoids to study neurovascular interactions. Elife， 2022， 11.

關鍵詞：腦類器官 干細胞 腦科學 腦模型 ■